דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה ומהירה של נקב מחט intrathecal עבור transfection מקומי של siRNA בחוט השדרה המותני בעכבר תחת הרדמה קצרה אור בר קיימא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בVivo siRNA Transfection וג'ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
דו"ח זה מתאר את מדריך צעד אחר צעד לטכניקה של הזרקות מחט intrathecal חריפות בצורה לא פולשנית, כלומר העצמאית של השתלת קטטר. המגבלה הטכנית של טכניקה ניתוחית זו נעוצה בעידון של הידיים. הזריקה היא מהירה, במיוחד עבור הנסיין מיומן, וכן שיבוש רקמות עם טכניקה זו הוא מינימאלי, זריקות חוזרות ונשנות אפשריות; תגובת יתר על כן חיסון לכלים זרים (. למשל קטטר) אינה מתרחשת, ובכך נותנת ספציפי טוב יותר ויותר לקרוא את של אפנון חוט השדרה. מאז היישום של החומר מוגבל במידה רבה לאזור היעד של חוט השדרה, תרופות לא צריכה להיות מיושמות במינונים גדולים, ואת השפעות חשוב יותר לא רצויות ברקמות אחרות, כפי שנצפתה עם משלוח מערכתי, יכולה לעקוף 1, 2. יתר על כן, אנו משלבים בטכניקה זו עם transfection vivo של חומצות גרעין בעזרת polyethylenimine (PEI) מגיב 3, המספק גמישות עצומה ללימוד פונקציות השדרה באמצעות משלוח של סוכנים תרופתיים כמו גם גנים, RNA, ומאפנני חלבון.
מבוא
חוט השדרה הוא מרכז חשוב מאוד במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים מרכזיים ופונקציות פיסיולוגיות, לרבות עיבוד והעברה של תשומות כואבות (nociceptive) 4-7. ניסיוני בטכניקות שונות פותחו כדי להקל על אפנון תרופתי של חוט השדרה, כגון השתלה כרונית של צנתרים intrathecal 8, microinjection חוט השדרה, והזרקת מחט intrathecal 9. לכל אחד יש טכניקת יתרונות משלה וחסרונות, ובהתאם לפרדיגמה ניסוי טכניקה אחת יכולה להיות מתאימה יותר מאשר לאחרים. ואילו השתלה כרונית של צנתרים intrathecal אינה ריאלי בקלות בחולדה, בשיטה זו קשה מאוד בעכבר, בהתחשב במגבלות גודל. שיעור הצלחה הוא נמוך מאוד וליקויים מוטוריים מתרחשים לעתים קרובות בשל ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל נהלי השימוש בבעלי החיים היו בהתאם לקווים מנחים אתיים שנקבעו על ידי גוף שלטוני המקומי (Regierungspräsidium קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה).
1. הכנת מורכבת siRNA / PEI
הפתרון המורכב siRNA / PEI מוכן באמצעות הוראות יצרן כדלקמן:
- פתרון: לדלל את הכמות הרצויה של siRNA עם מים סטריליים (במידת צורך) עד רבע לסוף הנפח ולדלל עוד יותר את זה עם 10% פתרון גלוקוז עד מחצית מסוף הנפח. מערבולת בעדינות או מערבב על ידי pip....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להמחיש זריקה מוצלחת, ביצענו בטכניקה זו משתמשת בצבע מהיר גרין FCF בעכברי C57BL6 מבוגר (8-10 שבועות של גיל). בעלי החיים הורשו להתאושש במשך כמה דקות לאחר ההזרקה על מנת לספק מספיק זמן לצבע להתפשט ולאחר מכן נהרג עם מנת יתר של CO 2. בהמשך לכך, בעמודת החוליות הייתה גזור ואת חוט השדרה נחשף. Puncta הכחול תואם לצבע מתפזר, סימן את אתר ההזרקה. אין סימן לפגיעה בחוט השדרה ניתן הייתה לראות, המאשרת את הטבע פולשנית של טכניקה זו (איור 1 א). הצבע המוזרק מתפזר מא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לכן, השיטה שתואר לעיל של זריקות מחט intrathecal היא יעילה, מהירה, במיוחד-מקומי, ולא הורסות. מבחינה טכנית, ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא נקודת החדרת מחט לתוך החריץ. זה חיוני כי הליך זה נעשה עם ידיים וסבלנות מאוד רגועות. כמו רבים הליכים כירורגיים, אימון משפר את קצב הזריקה מוצלחת. זה חשוב גם כי במהלך ניסוי בפועל, טכניקה זו אינה מספקת אינדיקציה ברורה על מנת לאשר באופן ישיר אם זריקה היא מוצלחת או לא. המחוון הגלוי רק של החדרת מחט הנכונה הוא קפיצי הזנב שהוא ציין כמו רפלקס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | סנטה קרוז | sc-36832 | |
| בקרה siRNA-A | סנטה קרוז | sc-37007 | |
| נוגדן אנטי-ß-טובולין III | סיגמא | T2200 | |
| נוגדן נגד WAVE1 | R& D Systems | AF5514 | |
| צבע ירוק מהיר | Sigma | F-7252 | |
| איזופלורן | בקסטר | ||
| הגדרת איזופלורן | Drä ger Lü בק | ||
| מכונת גילוח | Wella | ||
| מזרק המילטון Gastight 1702 | המילטון | ||
| 30 גרם 1/2 ב-13 מ"מ מחט | BD Microlance | 304000 | |
| מיקרוסקופ Leica MS5 | Leica | ||
| פריימר קדימה WAVE1 עבור qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 פריימר הפוך עבור qRT-PCR | Sigma | ctttttaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green | Master Roche | 6402712001 |
מקורות
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-lik....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
