מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
השימוש ארוך השנים של דרוזופילה כמודל לתא וביולוגיה התפתחותית הניב מערך של כלים. יחד, בטכניקות אלה אפשרו ניתוח של תא וביולוגיה התפתחותית ממגוון רחב של זוויות מתודולוגי. הדמיה חיה היא שיטה המתעוררות להתבוננות בתהליכי תא דינמיים, כגון חלוקת תא או תנועתיות תא. לאחר שבודד מוטציות בחלבוני מחזור תא המשוערת uncharacterized זה הפך חיוני להתבונן מיטוזה באתרם באמצעות הדמיה לחיות. רוב מחקרי הדמיה לחיות בדרוזופילה התמקדו בשלבים העובריים, כי הם נגישים למניפולציה ותצפית בגלל הגודל הקטן שלהם והבהירות אופטית. עם זאת, בשלבים אלה את מחזור התא הוא יוצא דופן בכך שהוא חסר אחד או שני שלבי הפער. לעומת זאת, יש תאים של אגף גלמים של דרוזופילה מחזור תא טיפוסי ועוברים תקופה של מיטוזה המהירה פורש על 20 שעות של פיתוח גלמים. זה קל ליdentify ולבודד גלמים של השלב המתאים לתפוס מיטוזה באתרם. גלמים ללא פגע הרכבה סיפקו את השילוב הטוב ביותר של עקיבות ועמידות במהלך הדמיה, המאפשרים ניסויים לרוץ במשך כמה שעות עם השפעה מינימאלית על כדאיות תא ושל בעלי חיים. השיטה מאפשרת התבוננות בתכונות קטנה כמו, או קטן יותר, לעוף כרומוזומים. התאמה של הגדרות מיקרוסקופ ואת הפרטים של הרכבה, אפשרה הרחבה של ההכנה כדי להמחיש דינמיקת קרום של תאים סמוכים וחלבונים שכותרתו fluorescently כגון טובולין. שיטה זו עובדת עבור כל חלבוני הניאון נבדקו ויכולה ללכוד תכונות submicron סולם על מגוון רחב של סולמות זמן. אמנם מוגבל ל -20 מיקרומטר החיצוני של הגולם עם מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, גישה זו להתבוננות חלבון ודינמיקה הסלולר ברקמות גלמי in vivo יכולה להיות, בדרך כלל שימושית בחקר התא וביולוגיה התפתחותית ברקמות אלה.
מבוא
זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל מבוסס היטב ללימוד היבטים רבים של ביולוגיה. יש מחקר דרוזופילה היסטוריה עשירה של ניסויים גנטיים המאפשרת לצורות מתוחכמות של מניפולציה גנטית, כולל ביטוי, מציאה ומוטציה. עם כניסתו של תוויות חלבון פלואורסצנטי, הרפרטואר הזה התרחב והוא כולל מחקרים של תאים וחלבונים חי חיות. עובר הזבוב הוא מערכת מצוינת למחקרים כגון זה הוא קטן וברור אופטי המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עמוקה, in vivo 1-3. שלבים אחרים של התפתחות זבוב הוכיחו להיות פחות צייתן, הדורשים הרדמה 4, לנתיחה ותרבות לטווח קצר 5,6, או יצירה של חלונות בציפורן הדמיה 7,8. מניפולציות אלה בדרך כלל לפגוע בהתפתחות בעלי חיים בטווח הארוך או להשפיע על בעלי החיים בדרכים המגבילות את ההדמיה לתקופות קצרות.
אף אוזן גרון "> כדי לחקור מוטציות רומן בגנים שדומים רגולטורים מחזור תא, זה היה חיוני למצוא היערכות מתאימה כדי ללמוד את התזמון ונאמנות של מחזור התא. מאחר שרוב מחזורי תא העובריים מעוגלים (SM או S-G2-M) והמוטציות תחת מחקר לא מראות פגמים עד שלבים מאוחר יותר, זה היה חשוב לקיים את מחזור התא ברקמות שלב גלמים. תאי אפיתל בגולם יש מחזור טיפוסי יותר G1-S-G2-M תא וגלמים של שלב זה הם לא מסוגלים תנועות שרירים 9. נקודת ההתחלה הראשונית למניפולציות כללה כל גלמים שלמים להביע Histone2AV-GFP. למרות האטימות, לכאורה, של המקרה גלמי, הכנה ללא פגע זה הוכיחה את עצמו מצוין לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. טכניקה זו היא פשוטה די בכך שהחוקרים לתואר ראשון באופן שיגרתי להשתמש בו כדי ללמוד היבטים של תא וביולוגיה התפתחותית בדרוזופילה ועדיין הרזולוציה היא בסדר מספיק כדי לאפשר אפליה של תכונות בקנה מידה מיקרומטר. בשיטה זו, תצפיות של אירועים על פני שעות, דקות או שניות הן אפשריות רק על ידי התאמת פרמטרים סדרת הזמן. וידאו באמצעות חלבונים כחולים, ירוקים, צהובים, כתום, אדומים וניאון, או שילוב של אלה, נעשה. חשוב מכך, אם טיפול שננקט כדי למזער את עוצמת הלייזר, יש אפילו הדמיה לטווח ארוך אין כל השפעה על התפתחות או כדאיות של בעלי החיים.הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. טוס עבודה
- לשמור על זבובים על מדיום קמח תירס, אגר ולסה, שמרים סטנדרטיים בטמפרטורת חדר 10.
- לצלבים, לבודד בתולות בתוך 6 שעות של eclosion. לאחר החצייה לזכרים של הגנוטיפ הרצוי, השינוי טס לבקבוקונים חדשים בכל 3-4 ימים.
הערה: בניסויים אלה, קו Gal4 A9 שימש לנהוג ביטוי של transgenes באגף. ניתן להשיג במניות טוסו ממרכז המניה בבלומינגטון. מניות המשמשות בניסויים אלה כוללים A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), Sco / הארגון הנוער הקתולי HsCre (BL # 1092), כטב"מ-ChRFP-אמבטיה (BL # 25773), lollibow 11.
2. בחירה והרכבה של גלמים
- גלמי במה או על ידי איסוף אותם כprepupae הלבן (WPP) ולשמור אותם ב25 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל המתאים, או על ידי שימוש בקריטריונים מורפולוגיים 12.
- כדי לצפות חלוקות תא, גולם בחר שלאחרונה עבר eversion הראש.מזה זמן עד ממש לפני eclosion (ב> 96 hr), גלמים נמצאים ללא תנועה המאפשרים תצפית ממושכת זמן לשגות.
- הסר גלמים מהבקבוקונים ידי הנגיעה הראשונה עם מכחול טבול במים, מחכה לרגע כדי לאפשר למים כדי לשחרר את הדבק ואז בעדינות דוחף אותם על המכחול.
- לשטוף בעדינות גלמים שנבחרו על ידי דרבונם עם מכחול במים כדי להסיר חלקיקי דבק בלוטה ומזון הרוק.
- העבר את הגלמים נקיים לצלחת פטרי עם 25 מ"מ תחתון coverslip (מספר 1 ½ coverslips).
- שימוש ברצועות דקות של או פלסטלינה או שעוות שיניים כתמיכה, הר גלמים כך שהרקמות של עניין היא הקרובות ביותר לcoverslip.
הערה: במחקרים שתוארו כאן, כנפי גלמים, רגליים, בטן או histoblasts notum הגבי כבר נצפו. בפועל, כל רקמה בתוך 20 מיקרומטר של פני השטח של המקרה גלמי היא הנצפה. - גלמי אוריינט בזהירות, כדי שTissuדואר של עניין הוא מקביל אל פני השטח coverslip הזכוכית.
- ברגע שגלמים הם רכובים, להשתמש במכחול להעביר שכבה דקה של thiodiethylene גליקול (TDG) למרווח שבין הגולם וcoverslip.
הערה: TDG מפחית פיזור פני השטח, תואם את מקדם השבירה של שמן, ומאפשר לחמצן כדי לחדור את הרקמה 13. שימוש בשמנים אינו מומלץ, כפי שהם נוטים לשלול את הרקמות של חמצן, גורמים להפסקה מהירה של התנהגויות תא.
3. הדמיה
הערה: לקבלת הדמיה, מיקרוסקופ confocal עשוי להיות חיוני כמו confocality מסיר את רוב רקע הטשטוש הנגרם על ידי תאורה חזקה של המקרה גלמי.
- התאם את הגדרות בconfocal כדי למזער את ההשפעה של תאורה על פיתוח וכדאיות גלמי. לשם כך, איזון בין עוצמת עירור ואת הרגישות של אוסף. תצורה אופיינית לwi הדמיהה SP5 לייקה בשימוש בסורק התהודה (8,000 הרץ), כוח הלייזר מוגדר 2% (העברת 10% מ20% כוח), סט חריר 120 מיקרומטר, וקו מיצוע מוגדר 8. הגדרות ישתנו בהתאם לתנאי ניסוי.
הערה: כדי לפתור סולם קנס כולל 40X ו63X עדשות טבילת שמן (מרחק עבודה 0.1 מ"מ) יש גם שימש בהצלחה בשיטה זו, אם כי הם מגבילים את עומק המיקוד.
4. אנליזה
כדי לנתח מסגרות, Z-ערימות או סרטים לייבא את קבצי הנתונים לפיג'י, שבה יש כלים יעילים לצפייה, מדידה ושינוי קבצים למצגת 14. לדוגמא זמן כדי להשלים מיטוזה נמדד באמצעות מרווח הדגימה ודפדפן תמונה רב ממדי כדי לעבור מסגרות בעת שצפה מתא prophase לtelophase. ה-X, Y, ו-Z-ממדים ניתן למדוד באמצעות כלי המדידה. להוראות מפורטות על התוכנה והשימוש בהראה: http://fiji.sc/Fiji.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאים בepithelia pseudostratified, כגון העין פיתוח דרוזופילה, או שכבת חדרית של מערכת העצבים המרכזית של בעלי החוליות בפיתוח, עוברים תנועות גרעיניות, כינה הגירה גרעינית interkinetic, בזמן עם מחזור התא. שכפול הדנ"א מתרחש כאשר גרעינים נמצאים באו סמוך לפני שטח הבסיס ותאים להיכנס מיטוזה כאשר הגרעינים להגיע למשטח פסגת 15,16. תאי אגף גלמים יוצרים אפיתל monolayer המתחלק במהירות בכמה השעות הראשונות שלאחר eversion הראש. הנתונים נאספו במצב xyzt מאגף גלמים מוקדם, ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי להמחיש, למדוד, ולכמת את תכונות של תאים מתחלקים, פיתוח הנדרש של הכנה פשוטה להתבוננות מיטוזה באגף גלמים החי של דרוזופילה באמצעות ניתוח confocal של His2AvGFP לבטא בתאים. שיטה זו שימשה לתיעוד שמחזור התא באגף גלמים מתאפיין בקווי דמיון חזקים לתא מחזורים בepithelia pseudostratified שבמהלך הגרעינים למשטח הפסגה של האפיתל שם הם נכנסים למיטוזה. בעקבות telophase, גרעינים לרדת בחזרה לשכבת האפיתל. לפיכך, התאים של monolayer זה, האפיתל unstratified ככל הנראה, להראות מוגבלים interkine...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות אקירה צ'יבה לתמיכה רוחני, תמיכה חומרית, ומניות. הודות לג'וליה Dallman להערות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כרית זבוב דברים | Genesee Scientific | 59-114 | להרדמת זבובים |
| CO2 גז | Airgas South | CD50 | להרדמת זבובים |
| רגולטור | Airgas South | CO2 רגולטור | |
| בקבוקוני זבוב | Genesee Scientific | 32-113RLBF | תרבות |
| זבובDrosophila שורות:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | המניות בלומינגטון | ||
| כלים תחתונים מזכוכית #1 1/2 | WillCo Wells BV | למיקרוסקופיה | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| דוגמנות | חימר חנות | תמיכה להצבת גלמים כנגד | |
| חנות | מברשות צבע | למניפולציה של זבובים | |
| מלקחיים עדינים, Inox #5 | כלי מדע עדינים | 11252-20 | Dumont #5 |
| מחשב | כל | 8 ג'יגה-בייט RAM לניתוח תמונה/סרט | |
| תוכנת | תוכנה חופשית http://fiji.sc/Fiji | תוכנת ניתוח תמונה | |
| מיקרוסקופ | כל סריקה מהירה קונפוקלית צריכה להספיק | ||
| 20X יבש, ועדשות טבילה בשמן 40X או 63X | כל | להדמיית רקמות, תכונות | |
| סלולריות ותת-תאיותשמן טבילה (לא פלורסנט) | |||
| סטריאומיקרוסקופ | כל | למניפולציה של זבובים |
מקורות
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
