מאמר שיטה

בדיקה

15.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51241

⸱

12 ביוני 2014

 ,  , 
1Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-6265 CNRS, 2Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-1324 INRA, 3Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, Université de Bourgogne

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים מבחן אמריקאי כדי לחשוף את ההשפעה של ניחוחי על התנהגות דרוזופילה באמצעות assay Y-מבוך.

תקציר

גילוי אותות מהסביבה הוא חיוני לבעלי חיים כדי להבטיח את הישרדותם. למטרה זו, הם משתמשים ברמזים סביבתיים כגון ראייה, mechanoreception, שמיעה, וchemoperception דרך טעם, באמצעות מגע ישיר או דרך חוש ריח, המייצג את התגובה למולקולה נדיפים הפועלת בטווח ארוך יותר. מולקולות כימיות נדיפים הן אותות חשובים מאוד עבור רוב בעלי החיים בזיהוי של סכנה, מקור למזון, או לתקשורת בין אנשים. melanogaster דרוזופילה הוא אחד המודלים הביולוגיים הנפוצים ביותר למדענים לחקור את הבסיס התאי ומולקולרי של חוש ריח. על מנת להדגיש את יכולות חוש הריח של חרק קטן זה, אנו מתארים פרוטוקול בחירה שונה המבוסס על בדיקת Y-המבוך קלסי בשימוש עם עכברים. נתונים המתקבלים עם Y-מבוכים לתת מידע בעל ערך כדי להבין טוב יותר כיצד בעלי חיים מתמודדים עם הסביבה תמיד המשתנה שלהם. אנחנו מציגים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ללמוד אתהשפעה של ניחוחי על תגובת גישוש לטוס באמצעות assay Y-המבוך הזה.

מבוא

Chemoreception דרך טעם או חוש ריח הוא שיטה חושית מפתח להישרדות של בעלי חיים. זה נותן רמזים חיוניים נחוצים לצורך זיהוי של סכנה או מקורות מזון, כמו גם לאינטראקציות חברתיות. זה גם עוזר בעלי חיים למצוא בן זוג לצורך הרבייה שלהם. במשך יותר מ 20 שנים, מחקר אינטנסיבי, כולל פרס נובל עבודה על ידי ריצ'רד אקסל ולינדה באק ב2004 "על תגליותיהם של קולטנים odorant והארגון של מערכת חוש הריח", בוצע כדי לחשוף את הבסיס המולקולרי ותאי של לחוש ריח 1,2.

אחד מהמודלים של בעלי החיים האהובים למדענים לנתח את תפיסת ריח הוא ד melanogaster. חרק זה חולק אסטרטגיה דומה קידוד ריח תאית ומולקולרית ביונקים. הקהילה המדעית משתמשת בפרדיגמות התנהגותיים מגוונות כדי ללמוד את התפקיד של ניחוחי בזבוב הפירות הזה. בדיקות אלה כוללות מבחני מולטי כגון courtshiבדיקות עמ 'שבו שיטות שונות חושיות, כוללים לחוש ריח, חשובות לעורר חיזור זכר 3. מבחני אחרים יש גם פותחו כדי להתמודד עם התפקיד של ניחוחי ליתר דיוק; אלה כוללים T-מבוכים, Y-מבוכים, מבחני מלכודת, זירות ארבעה שדה ו4,5,6,7,8 רוח מנהרות.

במאמר זה אנו מציגים assay פשוט הותאם Y-מבוך, המספק תשובות חוש הריח חזקות באמצעות ד melanogaster. ההגדרה שלנו משתמשת קצה טיפים בניגוד לשיטה שתוארה לעיל 9. לפיכך, יש Y-המבוך שלנו שני יתרונות. ראשית, זה ימנע כל החזר במערכת פעם אחת הזבוב עשה את הבחירה שלה. שנית, שהוא מגביל את חילופי הניחוח בכל תחומי ה-Y המבוך. היתרון האחרון הוא חשוב מאז דרוזופילה רגישה מאוד לזרימת אוויר המשמש לעתים קרובות כדי למנוע הרוויה odorant. כדי להתאים את ניסיוני הגדרה עם זרימת אוויר יהיה זמן וצרכנות עלות. לכן, assay Y-המבוך שלנו מייצג EFficient ודרך מהירה לבדוק את ביצועי חוש הריח של דרוזופילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. לפני שמתחיל

  1. השתמש מניית התייחסות isogenized נושאות פנוטיפים התנהגותיים יציבים וחזקים. אין חוק כללי לבחירת המניה זו, שכן כל הבקרות האפשריות עשויות לשאת אללים רקע הטרוגנית.
  2. השתמש בלחץ שליטה זו להכלאה לאחור כל מניות אחרות הדרושים לצעדים מאוחר יותר. צעד backcrossing זה מיוצג בדרך כלל על ידי לפחות 5 צלבים רצופים של נקבות בתולה יחידה (כדי לאפשר מעבר מעל בין כרומוזומים הומולוגיים אפשרי) ל2-3 זכרים התייחסות isogenic 5. שלב זה חשוב לhomogenize הרקע הגנטי בין מניות זבוב השונות.
  3. לשמור על מניות דרוזופילה על קמח תירס סטנדרטי (9%), שמרים (10%), ובינוני אגר (1.5%) השלים עם (0.4% para-הידרוקסי-נזואט תיל) אנטיביוטיקה במחזור אור / חושך 12-HR ב25 ° C.
  4. להשיג ניסויי chemosensory בחדר בטמפרטורה מבוקרת (25 מעלות צלזיוס) תחת אור אדום רחוק(כדי למנוע את תרומתם של רמזים חזותיים, ולהתמקד באותות chemosensory). באופן קבוע לחדש את האוויר מהחדר כדי לאוורר את האזור שבין כל ניסוי.

2. תגובת חוש הריח באמצעות assay Y-מבוך

  1. להרעיב את הזבובים ל16-18 שעות ב25 מעלות צלזיוס בצינורות זכוכית המכילים מגבת נייר רטובה לפני הבדיקה.
  2. הצטרפות מחבר Y-צורה לשתי צלוחיות זכוכית ובקבוקון קטן מפלסטיק (בקבוקון טעינה). השתמש 1 טיפים פיפטה מיליליטר שעוברים דרך פקקי הקצף לקשר את המחבר לשלושה בקבוקונים, וכדי להשיג Y-מבוך סגור היטב. חותכים את הקצוות הצרים של שני טיפים פיפטה (~ 2 מ"מ קוטר, כדי להימנע מכל החזרה של הזבוב ברגע שהוא עשה את ההחלטה שלו) כדי ליצור שני בקבוקונים "מלכודת", וסופו של דבר גדול של פיפטה קצה אחד כדי ליצור את "ההעמסה" צינור (איור 1 א).
  3. רק לפני חיבור בקבוקוני "מלכודת" (איור 1), במקום אחד ~ 6 נייר סינון בקוטר מ"מכל בקבוקון. הוסף 40 μl של פתרון odorant על נייר מסנן אחד, ו40 μl של מקביל הממס על נייר הסינון השני.
  4. להציג את עשרה 4 עד 9 זבובים בן יומו לתוך הבקבוקון "טעינה". אל תשתמש בהרדמה 2 CO בהעברה זו, שכן יש לו השפעה חזקה על התנהגות 10. במקום זאת להשתמש בקירור קצר על קרח. מניפולציה נכונה של זבובים מורדמים חשובה להגביל את הלחץ על הנושאים עד כמה שניתן.
    1. לבצע סדרה של בדיקות Y-מבוך ב ° C25 תחת אור מרחיק האדום (שימוש בנורות LED להגביל מקור חימום אפשרי), כדי למנוע גירויים חזותיים ככל האפשר. היזהר חלופיים האוריינטציות של Y-המבוכים (צינור odorant המכיל בצד השמאל, או בצד הימין, וצינור טעינה בחזית או בגב; תרשים 1C).
    2. אפשר לכמה שעות לזבובים להיכנס בבקבוקון המכיל מלכודת odorant או הממס. לספור זבובים לאחר 24 שעות כדי להגדיל את participatiעל עד יותר מ 80% ולספק את ערך מדד חוש הריח המרבי (Simonnet, תקשורת אישית).
    3. לחשב את מדד חוש הריח וכתוצאה מכך שימוש בנוסחה הבאה: (מספר בצינור הריח - מספר בצינור הממס) / מספר כולל של זבובים טעונים.
  5. ההגדרה לשטוף Y-מבוך כדלקמן: להשרות את פירקה ההגדרה בMD RBS 35 לילה. לשטוף ביסודיות עם מים ברז. לבסוף לשטוף עם מים deionized ולתת להתייבש.

3. ניתוח סטטיסטי של נתונים

  1. לבצע מבחן t, ניתוח שונה חד כיווני או אנובה דו כיוונית בהתאם לנתונים ומשתנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

1D איור מראה שתי תגובות נציג באמצעות assay Y-המבוך הזה. זכרים קנטון-S מאוד להימנע 10% חומצה אצטית מדוללת במים מזוקקים, ואילו הם לא להימנע 10% חומצת phenylacetic באופן משמעותי. מבחני אלה מבוססים על 10 זכרים ללשכפל מונחים ביחד בבקבוקוני הטעינה. פרוטוקול זה יכול לפעמים לגרום לשגיאה סטנדרטית גדולה של הממוצע. במידת הצורך, ניתן להפחית על חסרון זה באמצעות 20 זכרים למשכפל במקום רק 10. מבחינה מתמטית, בחירתו של אדם אחד יש לו משקל נמוך יותר על ערך המדד לגודל מדגם גדול יותר. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול Y-המבוך שלנו מבוסס על פרוטוקול שתואר לעיל 9. עם זאת, אנחנו מציגים שני הבדלים עיקריים. ראשית, עלינו להשתמש בטיפי פיפטה צרים כדי למנוע את הזבובים מלשוב ברגע שהם יחליטו להיכנס בבקבוקון המכיל ממס או הממס בתוספת odorant. טיפים צרים אלה הם שימושיים גם כדי להגביל את הדיפוזיה odorant בY-המבוך. שנית, אנו משתמשים בבקבוקון טעינה קטן יותר כדי לאלץ את הזבובים להיכנס בY-המבוך. חשוב לי השתתפות גבוהה של זבובים אלו (80% ל100% לאחר 24 שעות; Simonnet, תקשורת אישית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ל4 ביקורות בעילום שם לעבודה שלהם כדי לשפר את כתב היד. אנו מודים למרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique לתמיכה הכספית שלה לMBG וי.ג., ואוניברסיטת דה בורגון והמשרד הצרפתי למחקר ל- MMS. מחקר במעבדה י.ג. ממומן על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC החל גרנט, GliSFCo-311,403), Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil האזורי דה בורגון (פייבר), וCNRS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור פוליסטירן דרוזופילהVWR אירופה734-225530 x 25 מ"מ 
מבוך
Y צינור בורוסיליקט דרוזופילהדיז'ון verre95 X 25 מ"מ
פקק קצףמבוך Y Dutscher999038
מחבר בצורתEuroprix11020605
מבוך Y
100-1,000 ומיקרו; l קצות פיפטהקורנינג4868חבר את קצות הפיפטה הבאים למחבר בצורת Y. חותכים 2 קצות פיפטה ב-65 מ"מ מהקצה הרחב, ומחברים את הקצה הצר (עם ∼ פתח 2 מ"מ) ל-2 בקבוקוני בדיקה. פתחים אלה יגבילו את פניות הפרסה ברגע שהזבובים ייכנסו לצינורות המכילים את הריחות. חותכים קצה פיפטה אחד ב-35 מ"מ מהקצה הרחב, ומחברים אותו לבקבוקון הטעינה.
y-maze
נורת לד אדומהרחוקה Rubin-Lacaque0RB180238625-630 ננומטר
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ'45725
חומצה פנילקטיתסיגמא-אולדריץ'P16621
טעמי שמרים רגישים שטרסבורג1018880464
קמחתירסeurogermFarine de maï s
AgarKalysHP-697-25
מתיל הידרוקסי 4 בנזואטVWR בינלאומי25605293
Y

מקורות

  1. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  2. Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
  3. Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
  4. Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
  5. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
  6. Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
  7. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
  8. Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
  9. Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
  10. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
  11. Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
  12. Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים