הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים

8.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51245

⸱

4 במאי 2014

 ,  ,  , 
1Laboratory for Genetic Code, Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Laboratory for Circuit Mechanisms of Sensory Perception, RIKEN Brain Science Institute, 3Disease Mechanism Research Core, RIKEN Brain Science Institute

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים את התהליך של צביעה חיסונית שלמה של אנטנות דרוזופילה, המאפשר לנו להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוון נוירונים של קולטני ריח (ORN).

תקציר

מולקולות odorant נקשרות לקולטנים היעד שלהם באופן מדויק ומתואם. כל קולטן מזהה אות מסוימת ומעביר מידע זה למוח. ככזה, קביעת אופן בו מידע הרחה מועבר למוח, שינוי הן תפיסה והתנהגות, חקירה ראויה. מעניין לציין, כי יש ראיות המתעוררות כי גורמי התמרה ותעתיק תאיים מעורבים בפיזור של עצב קולטני ריח. כאן אנו מספקים כולה חזקים הר שיטת תיוג חיסוני לassay in vivo ארגון תא עצב קולטני ריח. באמצעות שיטה זו, זיהינו את כל תאי העצב קולטני הריח עם נוגדן אנטי ELAV, סמן פאן עצבי ידוע וOr49a-mCD8 :: ה-GFP, נוירון קולטני ריח במיוחד לידי ביטוי בנוירון-NBA באמצעות נוגדן אנטי-GFP.

מבוא

מערכת חוש הריח משמשת להבחין בין מגוון עצום של מולקולות ריח ולאחר מכן לשלוח את המידע וכתוצאה מכך למרכזי המוח גבוהים יותר. קלט זה משמש לשלוט במדויק התנהגות בעלי חיים בסיסית, כגון האכלה והזדווגות 1-6. כמו כל סוג תא עצב חוש הריח קשור לקבוצה מסוימת של ריחות, הפיזור של תאי עצב קולטני ריח (orn) ים הוא חיוני לתפקוד התקין של מערכת חוש הריח נכון 7.

הגנטיקה דרוזופילה מאפשרת לנו לבצע חקירה ברמת התא בודדת מעורבת מנגנונים מולקולריים הקשורים בהתפתחות orn ותפקוד פיסיולוגי 8-16. immunostaining ההר השלם של אנטנות דרוזופילה אפשר לנו להבין בפירוט רב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיזור של תאי עצב קולטני ריח (orn) של 7. במסמך זה אנו מספקים תיאור מקיף של שיטה פשוטה לachieve זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן צלחת תפוחים

  1. מערבבים 12.5 אגר גרם, 125 מיליליטר 100% מיץ זמין מסחרי תפוח, 12.5 גרם גלוקוז, ו375 מיליליטר H 2 O. מיקרוגל את התערובת במשך 1 עד 2 דקות ויוצקים לצלחת תרבית תאי 3 סנטימטר. חנות ב 4 ° C.

2. צלב גנטי

  1. השתמש בצלב הגנטי הנציג הבא:

Or49a-mCD8 :: ה-GFP / ארגון נוער קתולי x w 1118

3. פרוטוקול Dissection והמכתים

  1. להרדים את הזבוב ולאחר מכן לחתוך את הראש לטוס בצורה אנכית על ידי החזקתו באמצעות מלקחיים.
  2. בזהירות להניח את חלק האנטנות המכילות בצלחת תפוחים.
  3. חותכים את הקטע השלישי של האנטנה באמצעות מספריים לנתיחה בסדר.
  4. הנח 90 μl של פתרון הקיבעון (paraformaldehyde 4% בPBST 0.1% (PBS עם 0.1% טריטון X-100)) לאמצע צלחת תרבות תחתית כוס.
  5. בעדינות להעביר את antenn גזורAE עם מחט חדה ישירות לפתרון הקיבעון. במידת צורך, מבחינה פיזית להטביע את האנטנות לפתרון באמצעות מחט.
  6. דגירה של 40 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את האנטנות בPBST 0.4% (PBS עם 0.4% טריטון X-100), 3x 10 דקות בכל אחד, לשמור אותם באותה הצלחת. השתמש בעצות צהובות כדי להסיר ולהוסיף פתרון PBST. השתמש 90 μl של הפתרון לשטוף בכל פעם.
    הערה: אין להניח את הצלחת לתוך שייקר במהלך אימונוהיסטוכימיה. לפני הסרה או הוספת הפתרון לתוך הצלחת, להביא את כל האנטנות במרכז הצלחת באמצעות המחט וזהירות להוסיף או להסיר את הפתרון מהקצה של המנה.
  7. חסום את האנטנות עם 90 μl של 5% בסרום סוס רגיל בPBST 0.1% 20 דקות ב RT.
  8. לאחר הסרת חסימת הפתרון, דגירה האנטנות עם 90μl של נוגדנים עיקריים בPBST 0.1% המכילים 5% בסרום סוס ל48 שעות על 4 מעלות צלזיוס במכל לח כפי שתואר לעיל 8.
  9. שטוף את אנטנות 6x 10 דקות בPBST 0.4%.
  10. דגירה האנטנות עם 90 μl של נוגדנים משני בPBST 0.1% המכיל 5% בסרום סוס ל48 שעות ב 4 ° C. שטוף 6x 10 דקות באמצעות PBST 0.4%.
  11. כדי לעלות את האנטנות, להסיר PBST ממנת התרבות ככל האפשר ולהציג בהדרגה שני ריכוזים שונים של גליצרול לאנטנות. ראשית להוסיף גליצרול 40% למנה ל1 עד 2 דקות; לאחר מכן להסיר את זה ולהוסיף גליצרול 80%.
  12. לחלץ בזהירות את האנטנות (כולל גליצרול 80%) ממנת התרבות באמצעות קצה צהוב ומניח אותם על גבי שקופיות. מניח בעדינות coverslip על גבי וסוגר את קצות coverslip עם לק. האנטנות מוכנות להיות צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עכשיו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבטחה כי גם הנתיחה והקיבוע מבוצעים במהירות היא גורם מפתח בהשגת הצלחה בפרוטוקול זה. בעזרת מספריים ומלקחיים עדינים הוא גם חיוני. לאחר immunostaining, אנטנות ניאון שכותרתו נבדקו תחת מיקרוסקופ confocal. בדרך כלל אנחנו לוקחים את חלקי 1μm באמצעות עדשת 20x. אנו כותרת-NBA 7 ORNs באמצעות GFP :: Or49a-mCD8 וספרנו את מספר-NBA ORNs באנטנת wild-type. כתב mCD8-GFP הוא מקומי קרום תא ולכן הביטוי לראות באיור 2 מוצג על קרום התא של OR49a ORNs להביע GFP. באיור 2 מראה ביטוי ORNs-NBA באמצעות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דיסקציה של אנטנת דרוזופילה אנו מתארים היא פשוט וקל לביצוע בסביבת מעבדה. כדי להבטיח לנתיחה מוצלחת, חיוני לנצל מספריים עדינים עם קצוות. בעוד immunostaining האנטנה גזור, חשוב כדי לדגור אותם במכל המלא בלחות, כדי למנוע אידוי של פתרון הנוגדן. יש האנטנה גזור נטייה לצוף בפתרון. שימוש 0.1% טריטון ב-PBS במהלך הקיבעון וחסימת צעדים תקל על הטמעה של האנטנה בפתרון ועל מנת להבטיח צביעה טובה יותר. באמצעות "תרבות צלחת זכוכית התחתונה" יכול להפחית את האובדן של אנטנות במהלך immunost...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תכנית נתמכת-MEXT לקרן המחקר האסטרטגי באוניברסיטאות פרטיות וJSPs מדען הצעיר ב 'המענק לHT ברצוננו להודות לOhtake Norihito כדי לערוך את קטעי וידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ דיסקציה Stemi DV4ZeissStemi DV4
כלי תרבית תחתית זכוכית תאגיד MatTekP35G-0-10-C
מספריים דיסקציהכלים מדעיים עדינים15000-08
עכברוש אנטי-ELAVמחקרים התפתחותיים בנק היברידומה7E8A10דילול 1:200
עכבר אנטי-GFPInvitrogenA11122דילול 1:400
חמור נגד ארנב IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-225-152דילול 1:200
דונקי נגד חולדות IgGמעבדות ג'קסון למחקר חיסוני712-165-150דילול 1:200

מקורות

  1. Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
  2. Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
  4. Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
  5. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  6. Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
  7. Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
  8. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
  9. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  10. Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
  11. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
  12. Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
  13. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
  14. Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
  15. Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
  16. Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרוסקופיה קונפוקליתאימונוהיסטוכימיהנוגדן Anti-GFPנוגדן Anti-ELAVOr49a-mCD8::GFPשטיפות PBSTהרכבה בגליצרין
הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.