הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51248

⸱

28 בפברואר 2014

 ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Special Hematology/Flow Cytometry, London Health Sciences Centre, 4Lawson Health Research Institute, 5Department of Oncology, Western University

במאמר זה

סיכום

תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTCs וCTC בעכברי מודל פרה של גרורות שימוש בטכנולוגיה זו.

תקציר

רוב מקרי מוות הקשורים לסרטן מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית. שלב מחלה הקטלני ביותר זה קשור לנוכחות של תאים סרטניים במחזור (CTCs). תאים נדירים אלה כבר הוכיחו להיות בעל משמעות קלינית בשד גרורתי, סרטן ערמונית, סרטן מעי גס. תקן הזהב הנוכחי בזיהוי CTC קליני וספירה הוא במערכת ה-FDA פינה CellSearch (CSS). כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי מנוצל על ידי פלטפורמה זו, כמו גם בשני פרוטוקולים נוספים מותאמים המתארים את התהליך מפורט של סמן אופטימיזציה של משתמש מוגדר לאפיון חלבונים של CTCs מטופל ופרוטוקול דומה ללכידת CTC בכמויות נמוכות מאוד של דם, באמצעות תקן ריאגנטים CSS, ללימוד בעכברי מודל פרה vivo של גרורות. בנוסף, הבדלים באיכות CTC בין דם תורם בריא זינקו עם תאים מתרבית רקמה לעומת SAMP דם חולהles מודגשים. לבסוף, כמה פריטים בדרך כלל סותרים שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC מפורטים. יחדיו, פרוטוקולים אלה יספקו משאב שימושי עבור משתמשים בפלטפורמה זו מתעניינת במחקר פרה קליני הנוגע לגרורות וCTCs.

מבוא

בשנת 2013 הערכה הוא כי 580,350 אנשים ימותו מסרטן וש1,660,290 מקרים החדשים של מחלה זו יאובחנו בארצות הברית לבדה 1. רוב מקרי המוות הללו מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית 2. חוסר הנוכחי של טיפולים יעילים בטיפול בגרורות ובהבנה מוגבלת של המפל גרורתי הופך שלב זה של מחלה קטלני ביותר. נוכחותם של תאים סרטניים במחזור (CTCs) בתוך זרם הדם הוכח לתאם עם מחלה גרורתית 3. תאים אלה הם נדירים ביותר וזיהוי שלהם מעיד על הישרדות כוללת בשד גרורתי 4, 5 ערמונית, וסרטן מעי גס 6. בחולים אלה, הנוכחות של ≥ 5 (שד וערמונית) או ≥ CTCs 3 (מעי גס) ב7.5 מיליליטר של דם מעיד על פרוגנוזה גרועה יותר בהשוואה לאותם חולים עם פחות או ללא CTCs לזיהוי בסאםדם דואר בנפח. בנוסף, השינוי במספר CTC במהלך או לאחר התערבות טיפולית הוכח להיות שימושי כמנבא של תגובה לטיפול, לעתים קרובות מוקדם יותר מאשר טכניקות מנוצלים כיום 7-10.

הערכה הוא כי בחולי סרטן גרורתי, CTCs מתרחש בתדירות של כ 1 CTC לכל 10 5 -10 7 תאי mononuclear דם ובחולים עם מחלה מקומית, תדר זה ​​יכול להיות אפילו נמוך יותר (~ 1 ב10 8). הטבע הנדיר של תאים אלה יכול לעשות את זה קשה לזהות באופן מדויק ואמין ולנתח 11 CTCs. מספר שיטות (נבדק בעבר 12-14) כבר נוצל כדי להעשיר ולזהות תאים אלה על ידי ניצול מאפיינים שמבדילים אותם מסביב מרכיבי דם. באופן כללי, ספירת CTC היא תהליך בן שני חלקים שדורש הן צעד העשרה ושלב זיהוי. באופן מסורתי, את הפעולות העשרה מסתמכות על הבדלים בחינוך גופנימאפייני iCal של CTCs (גודל תא, צפיפות, deformability) או על ביטוי סמן חלבון (כלומר מולקולת הידבקות תא אפיתל [EpCAM], cytokeratin [CK]). בעקבות העשרה, זיהוי CTC יכול להתבצע במספר הדרכים שונות, הנפוץ ביותר מהם מבחני המבוססים על חומצות גרעין ו / או גישות cytometric. כל אחת מאסטרטגיות אלה הם ייחודיים, שיש יתרונות וחסרונות ברורים, עם זאת כל שחסר להם סטנדרטיזציה; הכרח עבור כניסה להגדרה הקלינית. מערכת CellSearch (CSS) לפיכך פותחה כדי לספק שיטה סטנדרטית לזיהוי והספירה של CTCs הנדיר בדם אדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטכניקות המבוסס על נוגדן 4-6. פלטפורמה זו נחשבת כיום לסטנדרט בספירת CTC הזהב והיא הטכניקה היחידה שאושרה על ידי ארה"ב מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לשימוש במרפאת 15.

CSS הוא שתי consistin פלטפורמת רכיבגרם של, (1) מערכת CellTracks AutoPrep (להלן ככלי ההכנה), שממכנת את הכנת דגימות דם של בני אדם, ו (2) CellTracks מנתח השני (להלן ככלי ניתוח), אשר סורק את אלה דוגמאות הבאות הכנה. כדי להבחין CTCs את זיהום לויקוציטים מכשיר ההכנה מעסיק נוגדן בתיווך, גישת הפרדה מגנטית מבוסס ferrofluid ומכתים הקרינה ההפרש. בתחילה, מערכת תוויות CTCs באמצעות נוגדנים אנטי EpCAM מצומדת לחלקיקי ברזל. המדגם הוא מודגרות אז בשדה מגנטי, וכל התאים ללא תווית הם aspirated. תאים סרטניים שנבחרו resuspended, וטופחו בכתם הקרינה ההפרש, בהיקף של נוגדני fluorescently שכותרתו ומגיב מכתים גרעיני. לבסוף, המדגם מועבר למחסנית מגנטית, הנקרא MagNest (להלן כמכשיר המגנטי), וscanned באמצעות כלי הניתוח.

מכשיר הניתוח משמש לסריקת דגימות מוכנות באמצעות מסנני הקרינה שונים, זה מותאם לחלקיקי הניאון המתאימים, באמצעות עדשה אובייקטיבית 10X. CTCs מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי EpCAM, אנטי הפאן CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18, ו19), ואת הכתם הגרעיני 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). לעומת זאת, לויקוציטים לזהם מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי CD45-allophycocyanin (APC) וDAPI. בעקבות סריקה, תאים סרטניים פוטנציאליים המוגדר על מחשב מוצגים למשתמש. מתמונות אלה, המשתמש חייב להעסיק ניתוח איכותי באמצעות הפרמטרים המוגדרים ומכתים ההפרש שנדונו לעיל, כדי לקבוע שאירועים הם CTCs.

בנוסף לאספקת שיטה סטנדרטית לספירת CTC, CSS מאפשר לאפיון מולקולרי של CTCs המבוסס על סמני חלבון של עניין. זה ג החקירהלהתבצע ברמת התא הבודד, באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) ערוץ הקרינה אינו נדרש לצורך זיהוי CTC 16. למרות שפלטפורמה זו מספקת את היכולת לאפיון מולקולרי, התהליך מפורט של פיתוח פרוטוקול ואופטימיזציה אינו מוגדר היטב. שלושה סמנים זמינים מסחרי פותחו על ידי היצרן לשימוש עם CSS, ובכלל זה צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן (EGFR), גורם קולטן אנושי צמיחת אפידרמיס 2 (HER2), וגורם גדילה דמוי אינסולין קולטן 1 (IGF-1R). ניתוח HER2, בשילוב עם CSS, נוצל על ידי מספר קבוצות כדי להמחיש את הפוטנציאל לאפיון CTC להודיע ​​קבלת החלטות קלינית ואפשרות לשנות את הנחיות טיפול קיימות. לדוגמא, Fehm et al. 17 הראו כי כשליש מחולי סרטן השד עם גידולים מסוג HER2 העיקרי היה HER2 + CTCs. בנוסף, ליו et al.18 דיווחו לאחרונה כי עד 50% מהחולים עם סרטן השד גרורתי + שלה לא היו HER2 + CTCs. הרצפטין, הקולטן HER2 מפריע נוגדן חד שבטי הפגין להועיל לחולים אשר גידולים להביע רמות מספיקות של HER2, הוא טיפול מנוצל בדרך כלל לחולים עם גידולים ראשוניים + HER2 19-21 במידה רבה. עם זאת, מחקרים אלה מראים כי הרצפטין ניתן להיות תת אופטימלי מנוצל וכי אפיון CTC עשוי לסייע בניבוי תגובה לטיפול. סופו של דבר, אפיון CTC יכול להיות הפוטנציאל לשפר את טיפול אישי.

מחקר CTC הוא ייחודי בכך שהיא במידה רבה מנוצל גישת מיטה להמעבדתיים. בשיטה זו, בניגוד למחקר מעבדתי למיטה, אשר לעתים קרובות יכול לקחת שנים כדי להשפיע על טיפול בחולה, אפשרה כניסה מהירה CTCs להגדרה הקלינית. עם זאת, רופאים מהססים להשתמש בתוצאות מניתוח CTC בהחלטות Mak טיפול בחולהing בשל חוסר הבנה של הביולוגיה הבסיסית שלהם. לכן מודלים עכבר פרה מתאימים של טכניקות גרורות וניתוח CTC משלים חייבים להיות מנוצלים על מנת לחקור השאלות קשות האלה. באופן כללי, ישנם שני סוגים של מודלים פרה לשמש כדי לחקור את המפל גרורתי, (1) מודלים גרורות ספונטניות, המאפשרים הלימוד של כל השלבים במפל גרורתי, ו (2) מודלים גרורות ניסיוניים, המאפשרים רק ל המחקר של צעדים מאוחר יותר בתהליך גרורתי כמו extravasation והיווצרות גידולים משניים 22. מודלים גרורות ספונטניים, כרוכים בזריקות של תאי גידול למיקומים מתאימים orthotopic (למשל הזרקה של תאי סרטן ערמונית לבלוטת הערמונית לחקר סרטן הערמונית). לאחר מכן ניתנו תאי זמן כדי ליצור גידולים ראשוניים וספונטאניות לשלוח גרורות לאתרים משניים כגון עצמות, ריאות, ובלוטות לימפה. בתוךלעומת זאת, מודלים גרורות ניסוייות כרוכים בהזרקה ישירה של תאים סרטניים למחזור הדם (לדוגמא דרך וריד זנב או הזרקת intracardiac למקד תאים למקומות ספציפיים) ולכן לדלג על השלבים הראשוניים של intravasation והפצה לאיברים משניים 22. עד כה רוב ניתוח CTC בin vivo מערכות מודל שבוצע באמצעות או 23 או מותאם טכניקות מבוססות cytometry מבוסס אנושי CTC (למשל AdnaTest) 24. אמנם שימושי, אף אחת מטכניקות אלה משקף באופן נאות ספירת CTC באמצעות CSS תקן זהב. בהתבסס על האישור הקליני, הטבע סטנדרטי, ושימוש נרחב של CSS, הפיתוח של טכניקת CTC לכידה וזיהוי לin vivo דוגמנות שמנצלת הכנת מדגם מקבילה, עיבוד, וקריטריוני זיהוי יהיה יתרון כתוצאות תהיה דומות לאלה מתקבל דגימות מטופל. עם זאת, בשל הנפח requirements של מכשיר ההכנה לא ניתן לעבד כמויות קטנות של דם באמצעות פלטפורמה אוטומטית זה. . בנוסף, העבודה קודמת של אליאן ואח' 25 הוכיחה כי זיהום של דגימות עם תאי האפיתל בעכבר (שגם עומדות בהגדרה CTC הסטנדרטי [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) יכול להוביל לסיווג מוטעה של תאי אפיתל קשקש עכבר כמו CTCs. כדי לטפל בבעיות אלה בטכניקה מותאמת המאפשרת הניצול של חומרים כימיים ערכת CSS CTC בשילוב עם הליך בידוד ידני פותח. התוספת של אנטיגן לויקוציטים אנושיים FITC נוגדן הנקרא (HLA) לassay מאפשרת לתאים סרטניים אנושיים כדי להבחין בין תאי אפיתל קשקש עכבר.

כתב יד זה מתאר סטנדרטי, שפותח באופן מסחרי ופרוטוקול CSS מותאם לעיבוד דגימות חולים דם ומלכודות נפוצות שעשויות להיות נתקלים, כולל discrepanפריטים לא שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC. בנוסף, ההתאמה האישית של assay ב-CSS כדי לבחון מאפייני חלבון בהגדרת משתמש של CTCs נתפס וטכניקת CSS מותאמת דומה המאפשרת להעשרה וזיהוי של CTCs מכמויות קטנות של דם בעכברי מודל פרה של גרורות מתוארות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבני האדם שתוארו בכתב היד הזה בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי אדם מחקר האתיקה מועצת המנהלים של האוניברסיטה המערבית. כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מערב השימוש בבעלי חי ועדת המשנה.

1. CTC ספירה סטנדרטית מדגימות דם חולה באמצעות CSS

1. איסוף דם אדם לדוגמא והכנה לעיבוד בכלי ההכנה

  1. באמצעות שימוש בטכניקות phlebotomy אספטיים סטנדרטיות, לצייר מינימום של 8.0 מיליליטר של דם אדם לתוך צינור CellSave 10 מיליליטר (להלן כצינור CTC חומר משמר), המכיל חומצת אתילן diaminetetraacetic (EDTA) וחומר משמר סלולארי קניינית. הפוך 5x הצינור כדי למנוע קרישת דם. דוגמאות יכולות להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסנות בטמפרטורת חדר למשך עד 96 שעה.
  2. Removריאגנטים CSS דואר מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש.
  3. בעזרת פיפטה חד פעמית 10 מיליליטר וpipettor אוטומטית, לאסוף 7.5 מיליליטר של דם מצינור משמר CTC ולוותר לאט דם לתוך צינור עיבוד שכותרתו כראוי הכנת מכשיר.
  4. הוספת 6.5 מיליליטר של חיץ דילול מדגם זה. מערבבים על ידי היפוך 5x מדגם. צנטריפוגה מדגם ב XG 800 עבור 10 דקות עם הבלם במצב "כבוי". בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לטעון את כל דגימות המטופל על המערכת לעיבוד. דגימות חייבות להיות מעובד בתוך 1 שעות של הכנה.

2. בקרת הכנה לעיבוד בכלי ההכנה

  1. בעדינות מערבולת בקבוקון השליטה ולהפוך 5x לערבב.
  2. מוציא בזהירות את הפקק מבקבוקון השליטה ולמקם את צינור עיבוד הפוך הכנת מכשיר על גבי הבקבוקון הסיר את המכסה. בתנועה אחת מהירה, להפוך אתלשלוט בבקבוקון, ויוצקים את התוכן לתוך צינור העיבוד. אמנם הפוך, בעדינות קפיצית הצדדים של בקבוקון השליטה לשחרר את כל תכנים שנותרו.
  3. מוציא בזהירות את בקבוקון שליטה ההפוכה מצינור העיבוד, הבטחה כי נוזל לא הולך לאיבוד ומניח בצד. בעזרת פיפטה 1,000 μl, לאסוף כל תוכן שנותר מהבקבוקון ואת המכסה ובעדינות פיפטה לתוך צינור העיבוד.
  4. בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה כדי לטעון את השליטה על המערכת לעיבוד.

3. סריקה לדוגמא על כלי ניתוח

  1. בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לפרוק את כל הדגימות מהמערכת. באופן רופף כובע כל מחסנית מכשיר מגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ואניncubate בחושך לפחות 20 דקות בטמפרטורת חדר. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה.
  2. הפעל את כלי הניתוח ולאתחל את המנורה. ברגע שחמם (~ 15 דקות), טענת את מחסנית אימות מערכת על גבי מכשיר הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת QC. בצע את ההוראות המופיעים על מסך כדי לבצע את אמצעי בקרת איכות הנדרשת.
  3. טען מדגם על כלי הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת החולה. כל המידע שנשמר ממכשיר ההכנה יוצג. לחץ על התחל כדי לאתחל סריקת מדגם. המערכת תבצע מיקוד גס וגילוי קצה של מחסנית המכשיר המגנטית.
  4. התאם את כל הקצוות לפי צורך באמצעות מקשי הכיוון. בחר קבל. המערכת תבצע להתמקד בסדר ולהתחיל סריקת מדגם.
  5. שליטה בעקבות סריקת התוצאות צריכה להיות מאומתת באמצעות הקריטריונים שהוגדרו לתאים זינקו ב גבוה (CK + DAPI + CD45 - APC +) ונמוך (CK + DAPI + CD45 - FITC + ריכוזים). מדגם מטופל בעקבות סריקת התוצאות צריך להיבדק לCTCs נתפס באמצעות הקריטריונים המוגדרים CTC (CK + DAPI + CD45 -).

2. אפיון CTC לסמנים המוגדר על ידי משתמש באמצעות CSS

1. הכנת סמנים מוגדר משתמש ומכשיר האתחול

  1. לדלל את הנוגדן של עניין באמצעות ונד ראשי נוגדן ממס לריכוז הרצוי בכוס מגיב סמן באמצעות הנוסחה הבאה, שבו ריכוז העבודה הוא הריכוז של הנוגדנים לאחר בנוסף למדגם וריכוז המניות הוא הריכוז של נוגדנים ב כוס מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, להתאים את כמויות הנוגדנים כפי שמתואר בטבלה 1. מניחים את הכוס מגיב סמן למקום 1 במחסנית מגיב וload המחסנית על CSS.
    ריכוז מניות = (ריכוז עבודה x 850 μl) / 150 μl
  2. איסוף דם, להכין את הדגימות, ולטעון את מכשיר ההכנה כפי שמתואר בתקן הנ"ל CTC ספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS. כדי לאפשר תוספת סמן מותאמת אישית, בחר מוגדר משתמש Assay כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי מכשיר ההכנה. קלט את שם הסמן ובחר שמור. כדגימות הועמסו על המכשיר, המפעיל יתבקש לציין שאמור לקבל סמן מותאם אישית על ידי בחירה כן או לא בהתאם לצורך.

2. סריקת מדגם של סמנים מוגדרי משתמש בכלי ניתוח

  1. הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS פרוטוקול.
  2. טען מדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. כדי לאתחל את ערוץ FITC, בחר CellSearch CTC כזהות קיט תחת סעיף בדיקת הפרוטוקולים. מתפריט זה, מחקר CTC בחר, לחץ על לחצן ערוך ולהגדיר את זמן החשיפה בהתאם לצורך. מומלץ כי זמן חשיפה של 1.0 שניות לא יהיה חריגה בעת שימוש בערכת CSS CTC כמו זה יכול להגדיל לדמם דרך לערוצי ניאון אחרים מנוצלים לזיהוי CTC.

3. עיבוד של CSSProtocol התקן לשימוש במודלים פרה מאוס

** מעובד מתוך Veridex עכבר / עכברוש CellCapture ערכה (כבר לא זמין באופן מסחרי)

1. עכבר של אוסף דם ואחסון

  1. לפני איסוף דם, לרוץ ~ 30 μl של 0.5 M EDTA קדימה ואחורה באמצעות מחט G 22, משאיר כמות קטנה של EDTA ברכזת.
  2. לאסוף מינימום של 50 μl של דם עכברים מעכברים שהוזרק בעבר עם תאים סרטניים אנושיים דרך נתיבים, וריד זנב, או intracardiac orthotopic. לאסוף דם מוריד saphenous (לניתוח CTC סידורי) או על ידי לנקב לב (לניתוח CTC מסוף). הסר את המחט ולוותר על דם לתוך צינור איסוף דם microtainer EDTA 1 מיליליטר. מערבבים על ידי היפוך או צינור בעדינות קפיצי למניעת קרישת דם. דם עשוי להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסן בטמפרטורת חדר למשך עד 48 שעות הבאות התוספת של נפח שווה של חומר משמר סלולארי CytoChex.

2. CTC העשרה

  1. הסר ריאגנטים CSS מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש.
  2. העבר את המקבילה של 50 μl של דם לזרימת x 75 מ"מ 12 cytometry צינור. הוסף 500 μl של חיץ דילול מדגם זה, שוטף את כל דם שנשאר על הדפנות של הצינור. במידת צורך, ספין צנטריפוגות קצרניתן להשתמש בם כדי לאסוף את כל דם שנותר.
  3. בעדינות מערבולת ferrofluid אנטי EpCAM ולהוסיף 25 μl לכל דגימה על ידי הצבת קצה פיפטה ישירות לתוך המדגם. הוסף 25 μl של מגיב שיפור לכידת ומערבולת בעדינות לתערובת. דגירה דגימות בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
  4. הנח צינורות מדגם לתוך המגנט ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק.

3. CTC מכתים

  1. הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב 50 μl של חומצות גרעין דאי, 50 μl של הכתמה מגיב, 1.5 μl של אנטי עכבר CD45-APC, 5.0 μl של אנטי אנושי HLA-Alexa פלואוריד 488, ושל permeabilization 100 μl מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, ריאגנטים אלה עשויים להיות מעורבבים מראש ו206.5 μl של תערובת ניתן להוסיף לכל מבחנה. מערבולת בעדינות לתערובתדגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  2. הוסף 500 μl של חיץ דילול, מערבולת בעדינות, דוגמיות המקום אל המגנט, ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק. הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב350 μl של חיץ דילול. מערבולת בעדינות לתערובת.

4. טעינת התקנים מגנטית

  1. באמצעות קצה טעינת ג'ל, מעביר בזהירות את כל הנפח מצינור המדגם לתוך מחסנית במכשיר המגנטי. התחל בתחתית המחסנית ולסגת באיטיות את הקצה כמדגם הוא לוותר.
  2. ברגע שכל הדגימה הועברה, באופן רופף מכסה את מחסנית המכשיר המגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית, כמתואר בsection 3.1 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS.
  3. פופ כל בועות באמצעות מחט G 22 סטריליים על ידי לכידתם בין פוע וקצה המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ודגירה בחושך לפחות 10 דקות. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה.

5. סריקה של דוגמאות מופרדים באופן ידני בכלי ניתוח

  1. הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS.
  2. טען את המדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. נקה את כל הנתונים קיימים על כפתור נתוני מכשיר המגנטי על ידי לחיצה על הכפתור לדוגמא עיצוב. אפשר ערוץ FITCnd להגדיר את זמן חשיפה ל1.0 שניות כפי שתואר בסעיף 2.2 אפיון CTC לסמנים מוגדר משתמש באמצעות CSS.
  3. לחץ על כרטיסיית בדיקת החולה ובחר עריכה כדי קלט את המידע לדוגמה. בחר CellSearch CTC כזהות קיט ומחקר CTC כפרוטוקול בדיקה. קלט את המידע הדרוש שנותר כפי שצוין ככוכבית. שמור את המידע לדוגמא ולחץ על התחל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תקן CTC ספירת Assay

הרגישות והסגוליות של CSS תועדה היטב בספרות. עם זאת, כדי לאמת את התאוששות CTC שווה ערך, זינק (תאי סרטן ערמונית אנושית 1,000 LNCaP) ודגימות דם של בני אדם unspiked מתורמים מתנדבים בריאים עובדו על CSS באמצעות פרוטוקול CSSCTC הסטנדרטי. כצפוי, דגימות unspiked היו חופשיות של CTCs, 0.00 ± 0.00%, והתאוששות CTC הודגמה להיות 86.9 ± 4.71% עבור דגימות ממוסמר (איור 1 א). תמונות בגלריה CSS מתקב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות ההתפתחות של טכנולוגיות רבות CTC חדשים מאז כניסתה של CSS ב2004, טכניקה זו היא עדיין הטכנולוגיה שאושרה קליני רק על השוק היום, ולכן זה נחשב תקן הזהב הנוכחי לאיתור CTC ופקידה. כתב היד הזה הוכיח שלמרות שיש לו את CSS תקני בקרת איכות קפדניים זה יכול להיות כפוף להטית פרשנות וכי זיהוי CTC בדגימות מטופל הוא שונה בהרבה מזיהוי בדגימות ממוסמר. שש קטגוריות של פריטים נפוצים סותרים זוהו שיכול לגרום misclassifications CTC להתרחש. פריטים סותרים אלה מדגישים את הצורך במספר בודקים בכל דגימת מטופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר (ALA) זכה למימון שהועמד על ידי Janssen אונקולוגיה, אשר חברה האם של חברת Johnson & Johnson גם בעלי Janssen אבחון LLC, אשר מייצר ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון אונטריו לחקר הסרטן (# 08NOV230), קרן קנדה עבור חדשנות (# 13199), סרטן ערמונית קנדה, Janssen אונקולוגיה, התכנית למלחמה בסרטן האזורית בלונדון, ותמיכת תורמים מג'ון ודונה בריסטול דרך קרן לונדון למדעי בריאות (לALA). LEL נתמך על ידי בנטינג פרדריק ומלגות לתארים מתקדמים צ'רלס בסט קנדה דוקטורט פרס. ALA נתמך ניו פרס חוקר CIHR ופרס חוקר מוקדם ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות על ידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA
אנטי אנושי CD44-FITCBD Pharmigen555478
אנטי אנושי CD44-PEBD Pharmigen555479
אנטי אנושי HLA-Alexa Fluor 488BioLegend311415
Anti-Mouse CD45-APCeBioscience17-0451-82
Bond נוגדן ראשוני מדללLeicaAR9352
CellSave שפופרות משמרותVeridex952820 (20 חבילות) 79100005 (100 חבילות)
ערכת בקרת CTC CellSearchCTC Veridex7900003
CellSearchבקרת Veridex
CellSearch CXC ערכת בקרתVeridex7900018RUO
ערכת CXC CellSearchVeridex7900017RUO
מאגר מכשיריםVeridex7901003
Streck Cell Preservant (aka CytoChex)Streck213350
1 מ"ל מזרק
סרולוגית
1,000 ומיקרו; l פיפטה
1,000 ומיקרו; l קצות
12 מ"מ x 75 מ"מ צינורות זרימה
200 ומיקרו; l טיפים
200 ומיקרו; l פיפטה
22 גרם מחט
5 3/4 בצינור פסטר חד פעמיVWR14672-200
5 מ"ל פיפטה
פיפטור
איסוף דם נימי (EDTA)BD Microtainer365974
CellSearch Analyzer IIVeridex9555כולל מגנסטים ועגלות אימות
מערכת CellSearch AutoPrepVeridex9541
צנטריפוגה
MagCellect Magnet מו"פ D SystemsMAG997
נורת לטקס קטנהVWR82024-550
מערבולת
ערכת בקרת ערכת 7900001 10 מ"ל פיפטה פיפטותלטעינת ג'לסרולוגיתאוטומטי צינור

מקורות

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. 63 (1), 11-30 (2013).
  2. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  4. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
  5. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  6. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
  7. Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
  8. Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
  9. Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
  10. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  11. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
  12. Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
  13. Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
  14. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
  15. Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
  16. Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
  17. Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
  18. Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
  19. Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
  20. Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
  21. Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
  22. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
  23. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
  24. Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
  25. Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
  26. White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
  27. Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
  28. Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
  29. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
  30. Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  31. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  32. Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
  33. Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
  34. Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
  35. Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
  36. Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
  37. Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  38. Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Cell SearchCTCCTCEpCAMinterchangeable cartridge
עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.