אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים, ננוטכנולוגיה שומנים בדם, וניתוח מבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד: אדם וחזירי. המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו כדי לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) הוא תאר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM) 1 היא גישה רבת עוצמה כדי לחקור את המבנה התפקודי של חלבונים ומתחמים בסביבת מדינה וקרום התייבשות 2.
קרישת פקטור VIII (FVIII) 3 הוא גליקופרוטאין פלזמה דם מרובה תחומים. פגם או חסר של FVIII הוא הגורם לסוג המופיליה - הפרעת דימום חמורה. עם הפעלת מפרקי חלבונים, FVIII נקשר לפרוטאז סרין פקטור IXA על הממברנה של טסיות הדם הטעונה השלילי, שהוא קריטי לקרישת דם נורמלית 4. למרות התפקיד המרכזי FVIII משחק בקרישה, מידע מבני למצב הקרום הנכנס שלה הוא 5 לא שלמים. תרכיז FVIII רקומביננטי הוא התרופה היעילה ביותר נגד סוג המופיליה וFVIII זמין מסחרי יכול לבוא לידי ביטוי כאנושי או חזירי, שני מתחמים פונקציונליים להרכיב עם אדם פקטור IXA 6,7. "> במחקר זה אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM), ניתוח ננוטכנולוגיה שומנים בדם והמבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד:. אנושי וחזירי המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) מתואר. תוצאות הנציג להוכיח כי הגישה שלנו היא רגישה מספיק כדי להגדיר את ההבדלים בארגון הסליל בין שני מאוד הומולוגי ברצף (זהות רצף 86% חלבונים). פרוטוקולים מפורטים לארגון הסליל, Cryo-EM וטומוגרפיה אלקטרון (רכישת נתונים) ET מקבלים. דו ממדי (2D) וניתוח מבנה התל ממדים (3D) מיושם כדי להשיג שחזורי 3D של אדם וחזירי FVIII-LNT נדונה. מבני FVIII-LNT הציגו אנושיים וחזיריים להראות את הפוטנציאל של המתודולוגיה המוצעת לcalculatדואר הארגון הפונקציונלי, הקרום הנכנס של פקטור VIII קרישת דם ברזולוציה גבוהה.
מבוא
קרישת דם פקטור VIII (FVIII) הוא גליקופרוטאין גדול של 2,332 חומצות אמינו מאורגן בשישה תחומים: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. על טרומבין הפעלת FVIII פועל כcofactor לפקטור IXA במתחם Tenase הקרום הנכנס. עקידת FVIII הופעל (FVIIIa) לFIXa באופן תלויי קרום משפרת את יעילות פרוטאוליטי FIXa יותר מ -10 5 פעמים, שהוא קריטי לקרישת דם יעילה 4. למרות התפקיד החשוב FVIII משחק בקרישה וההיווצרות המורכבת Tenase, מבנה FVIII קרום הנכנס הפונקציונלי הוא עדיין לא נפתר.
לכתובת זו, צינורות בודדים bilayer שומנים (LNT) עשירים בphosphatidylserine (PS), מסוגלים מחייב FV....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. לדוגמא הכנה
- אדם מטבע חיץ FVIII-BDD 14 והחזירי 15 FVIII-BDD נגד חיץ HBS-Ca (20 HEPES מ"מ, 150 mM NaCl, 5 מ"מ CaCl 2, pH = 7.4) ולהתרכז ל1.2 מ"ג / מיליליטר. שמור את פתרון החלבון ב -80 ° C.
- הכן צינורות שומנים (LNT) על ידי ערבוב GalactosylCeramide (GC) וphosphatidylserine (PS) ב1:04 w / פרופורציות בכלורופורם. להתאדות כלורופורם תחת ארגון וsolubilize השומנים בחיץ HBS עד 1 מ"ג / מיליליטר. שמור את פתרון LNT ב 4 ° C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנושי רקומביננטי וFVIII חזירי אורגנו בהצלחה על helically טעון שלילי LNT bilayer יחידה, שמזכירים את משטח טסיות הדם מופעל. ארגון הסליל של האדם והחזירי FVIII-LNT היה עקבי דרך micrographs הדיגיטלי שנאסף (איור 2). LNT השליטה והאנושית וצינורות סליל FVIII-LNT חזיריות נבחרו ומפולח עם GUI e2helixboxer.py וערכות נתונים ראשוניים שנוצרו עם GUI e2workflow.py, אפשרות חלקיקים בודדת (טבלת 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעבודה זו המתודולוגיה מוצגת להבחין בין שני ארגוני קרום הנכנס של חלבונים הומולוגיים מאוד: FVIII האנושי והחזירי בצינורות שומנים בדם בתנאים נתקלו בגוף האדם התאספו עצמי.
בהליך המתואר, אנושי וחזירי FVIII מאורגן בהצלחה helically על צינורות שומנים בדם, המהווים את השלב הקריטי ביותר. השלב הקריטי הבא הוא לשמר את הדגימה בקרח אמורפי דק על ידי הבזק הקפאה בנוז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה, והם יכולים להיות קשר ישיר לגבי כל הנהלים שפורסמו בכתב היד הזה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק לאומי למדען לפיתוח מאיגוד הלב האמריקאי: 10SDG3500034 וUTMB-NCB להתחיל את הכספים לSSM. המחברים מודים מתקני Cryo-EM ומדעי מחשוב במרכז Sealy לביולוגיה מבנית בUTMB (www.scsb.utmb.edu), כמו גם בני הזוג. סטיב Ludtke ואד Egelman לעזרה עם אלגוריתמי שיקום סליל 2D and 3D.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| JEM2100 עם LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | פעל ב-200 קילו וולט |
| עם תוכנת TEMCON | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 מחזיק קריו | Gatan, Inc. | 626.DH | מקורר ל-175 ו-deg; C |
| עם יחידת בקרת טמפרטורה | Gatan, Inc. | ||
| מצלמת Gatan 4K x 4K CCD | Gatan, Inc. | US4000 | 4,096 x 4,096 פיקסלים ב-15 μ m / פיקסל רזולוציה פיזית |
| סולארוס דגם 950 מנקה פלזמה | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| פחמן מצופה פחמן 300 רשת רשת נחושת 3 מ"מ | Ted Pella | 01821 | פלזמה מנוקה למשך 10 שניות בעוצמה גבוהה |
| Quantifoil R2/2 300 רשת | אלקטרונים Microscopy Sciences | Q225-CR2 | מצופה פחמן 300 רשת רשת Cu רשתות עם חורים בקוטר 2 מ"מ |
| אורניל אצטט דיהידרט | טד פלה | 19481 | תמיסה 1%, מסוננת |
| גלקטוזיל סרמיד | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| תוכנת EM Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM תוכנה EMAN | להורדה | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ תוכנת | |
| EM עכביש | להורדה | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM תוכנה IHRSR | להורדה | תוכניות זמינות מ- אדוארד ה. אגלמן | |
| http://people.virginia.edu/~ehe2n/ תוכנת EM (IMOD) | להורדה בחינם | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM תוכנה (SerialEM) | הורדה | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | להורדה | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
מקורות
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
