הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

סיכום

טכנולוגיית הדפסה מיקרופלואידית תלת מימדית זו מדפיסה מערכי תאים על משטחים שקועים. אנו מתארים כיצד מערכי תאים מועברים באופן מיקרופלואידי, בתאי זרימה תלת מימדיים על משטחים שקועים. על ידי הדפסה על משטחים שקועים, יוצרו מיקרו-מערכי תאים המאפשרים סינון תרופות והערכת ציטוטוקסיות במספר רב של תחומים.

תקציר

הדפסת תאים ליישומי מיקרו-מערך טומנת בחובה אתגרים משמעותיים, כולל הבעיה של שמירה על פנוטיפ תאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לאחר ההדפסה, ארגון ופיזור לקויים של תאים רצויים, וחוסר היכולת לספק תרופות ו/או חומרים מזינים לאזורים ממוקדים במערך. טכנולוגיית ההדפסה המיקרופלואידית התלת מימדית שלנו מסוגלת באופן ייחודי לאטום ולהדפיס מערכי תאים על משטחים שקועים בצורה אוטומטית ומולפלקסית. העיצוב של הנוזלים התלת-ממדיים של מערך התאים המיקרופלואידיים (MFCA) מאפשר להוריד את קצה ראש ההדפסה לבאר או צלחת מלאה בנוזל ולדחוס אותו על משטח ליצירת אטימה. קצה הסיליקון הרך של ראש ההדפסה מתנהג כמו אטם ומסוגל ליצור אטימה הפיכה על ידי הפעלת לחץ או נסיגה. טכנולוגיות אחרות להדפסת תאים, כגון מדפסות סיכה או הזרקת דיו, אינן מסוגלות להדפיס ביישומים שקועים. הדפסת משטח שקוע חיונית לשמירה על פנוטיפים של תאים ולניטור תאים אלה על משטח מבלי להפריע למאפייני פני השטח של החומר. על ידי הדפסה על משטחים שקועים, מיוצרים מיקרו-מערכי תאים המאפשרים סינון תרופות והערכת ציטוטוקסיות במגוון תחומים כולל סרטן, סוכרת, דלקת, זיהומים ומחלות לב וכלי דם.

מבוא

ההתקדמות שחלה באחרונה בתעשיית התרופות הובילה לעניין מוגבר בבאמצעות מערכים הסלולר בתהליך גילוי תרופות להקרנת סמים ^1,2,3 ניתוח cytotoxicological. ההתפתחות במבחני חוץ גופית תפוקה גבוהה ושיטות הקרנה באמצעות מערכי תא יקל על הפיתוח המהיר וחסכוני של מועמדי תרופה, כמו גם לקדם את ההבנה הבסיסית של התא ^1,4. הגישה המסורתית להקרנה עם תאים משתמשת בפלטפורמות היטב צלחת קונבנציונלית; עם זאת גישה זו מוגבלת בשל העלות הגבוהה, תפוקה מוגבלת, והיכולת המוגבלת לקבלת מידע כמוני על ^1,5 תפקוד תא. בשל המגבלות הללו, מחקר בטכנולוגיות microarray הסלולרי המתפתח לאפיון מולקולרי ביולוגי, הנדסת רקמות, ^ו1,6 הקרנת סמים. היתרונות של microarrays הסלולרי כוללים שימוש מדגם קטן יותר, לוואי מינימאלי שלההטרוגניות פנוטיפ הסלולרי מיסוך מידע, והכי חשוב היכולת למכן מבחני עבור יותר יישומי תפוקה גבוהה ^1,7,8.

תעשיית התרופות כיום מנצלת מבחני מיון מבוסס תאי תפוקה גבוהה עם תרבויות monolayer תא 2D להקרנת סמים בצלחות גם microtiter ^9. תאי ריבוב בבארות של צלחות microtiter מציעים את הפוטנציאל לתפוקה גבוהה יותר עם אפשרויות ניסויים ייחודיות. יתר על כן, בטכנולוגיות עדכניות לmicroarrays הסלולר לאפשר לתאים יבשים שיכול לשנות באופן דרמטי את הפנוטיפ של התאים מin vivo ^10,11. כדי להתגבר על בעיות אלה, MFCA תוכנן ומוצגת באיור 1. העיצוב של fluidics MFCA 3D מאפשר את קצה ראש ההדפסה באיור 1 שהוריד לתוך אמבט ודחוס כנגד משטח כדי ליצור חותם. קצה סיליקון הרך של ראש ההדפסה מתנהג כמואטם ומהווה חותם הפיך. טכנולוגית MFCA מתאימה באופן ייחודי להתממשק עם משטחים מתחת למים, אשר נדרש עבור שניהם בתרביות תאים ומערכות פרוסה רקמה, וקשה או בלתי אפשרי עם רוב גישות אחרות. סיכות או הדפסת הזרקת הדיו לא תעבוד, ומכשירי microfluidic 2D אינם מתאימים להפקדה או התממשקות עם מערכים גדולים של נקודות בדידות. יתר על כן, על ידי miniaturizing והלוקליזציה של הניסוי - microarray הסלולרי - MFCA מתגבר על הבעיות העיקריות הקשורות למבחני מיון מבוסס תאי תפוקה גבוהה.

CFM משתמש ברשתות ערוץ 3D לדגימות נפח נוזל קטנות מחזור פני מקומות נקודה מיקרוסקופיים על משטח ^12,13. על ידי הדפסה עם זרימה, ביומולקולות, תאים, וחומרים כימיים אחרים נשמרות בסביבה נוזלית לאורך כל תהליך ההדפסה, המאפשרות ההדפסה של ביומולקולות ותאים הרגישים ללא חשיפה לאוויר, אשר מעכב את טכניקות הדפסת התא הנוכחיות. כמו כן ניתן להדפיס ישירות מחומר גולמי כגון hybridoma או supernatants בתנאים שיש מנגנון לכידה על פני המערך. המטרה של כתב יד זה היא להסביר בפירוט את הדפוס השקוע של שני סוגי תאים על גבי משטח.

פרוטוקול

1. תא תרבות הכנה

1. אחסן מניות תא NIH/3T3 בחנקן נוזלי עד לשימוש.
2. הכן תקשורת מלאה עבור תאי NIH/3T3 באמצעות הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 10 חיץ HEPES מ"מ, 50 יחידות / מיליליטר פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
3. להפשיר תאים ל2-3 דקות באמבט מים רועדים ב 37 ° C.
4. תאי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת ו צנטריפוגות המלאה ב1,500 XG במשך 3 דקות.
5. הסר את supernatant התא מבלי להפריע תא גלולה.
6. Resuspend תאי 5 מיליליטר של תקשורת ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
   1. הסר 10 μl של ההשעיה התא והמקום בצינור microcentrifuge 0.5 מיליליטר.
   2. הוסף 10 μl של Trypan הכחול להשעית התא ומערבבים עם קצה פיפטה.
   3. פיפטה 10 μl של התאים המוכתמים לתוך תא hemocytometer.
   4. ספירת תאים בhemocytometer ב10xההגדלה.
      1. לספור את תאי חיים (כדורים קטנים, לבן) עבור 4 מתוך 9 הריבועים גדולים. לספור רק תאי החיים שאינו מופיעים בצבע כחול כהה מכתם Trypan הכחול.
      2. חשב את המספר הממוצע של תאים לכל כיכר גדולה, וכתוצאה ממספר התאים x 10 ⁴ תאים / מיליליטר בהשעית התאים המקורי.
      3. תאי זרע בצפיפות של x10 1 ⁵ תאים / מיליליטר עם סך של 5 מ"ל בכל בקבוק T25.
   5. תרבות תאים לבין 70% וconfluency 80% לפני ניסויים מתחילים. רענן תקשורת בכל 2-3 ימים או לפי צורך.

2. הכנת שטח הדפסה

1. מארק מלבן עם סמן על החלק התחתון של רקמות שטופלה תרבות קלקר (TCTPS) 12 צלחת גם בגודל של ראש ההדפסה (7 מ"מ x 19 מ"מ).
2. פיפטה 50 μl של סרום שור עוברי לתוך השטח מלבני ופרש אותה על פני האזור כולו עם הקצה.
3. השאר את צלחת פטריבO מכסה המנוע הבטיחות הביולוגי / N סטרילי כדי לאפשר מקום הסרום להתייבש לחלוטין. צריכה להיות מוכנות צלחות אלו לא יותר מ -2 ימים לפני השימוש.

3. הדפסה השקועה

1. יש לשטוף את ראש ההדפסה עם מים מזוקקים.
   1. למלא צלחת פטרי 60 מ"מ עם מים מזוקקים ולעגן את ראש ההדפסה על גבי המשטח.
   2. זרימת מים מזוקקים באמצעות כל אחד מהקווים למשך 2 דקות ב150 μl / min באמצעות משאבת פנאומטי.
   3. מחק את המים מצלחת פטרי ולמלא אותה במים נקיים.
   4. הזז את ראש ההדפסה מעלה ומטה בתוך המים 3 פעמים.
2. לעגן את מרכז ראש ההדפסה על המקום מצופה בסרום בצלחת גם מוכנה מראש 12.
3. ראש בראש ההדפסה עם תקשורת מלאה מראש חיממה, 300 μl לכל ערוץ.
4. הדפסה מושעה תאים בריכוז של 50,000 תאים / מיליליטר על פני השטח ו60 μl / דקה, לכל ערוץ 100 μl.
5. הנח את ראש ההדפסה, עזב עגן נגדפני השטח, והסעפת בתרבית תאי חממה מוגדרת 5% CO ₂ ו37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
6. לאחר הדגירה 2 שעות, הסר את ראש ההדפסה והנח את המכסה על צלחת התרבות. הזמן שבו ראש ההדפסה הוסר נחשב נקודת זמן 0 שעות.

4. תרבית תאים רגילה

1. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש לאחד של צלחת TCTPS 12 גם הסרום-הבחין מוכנה בשלב 2.
2. קח 1 מיליליטר של ההשעיה התא שנותרה משלב 2 וטפטפו לתוך באר בודד של צלחת TCTPS 12 היטב. זה יהיה לייצר תרבות המכילה 50,000 תאים במנה.
3. מניחים את צלחת תרבית התאים באינקובטור ב C ° 37 במשך שעה 2.
4. לאחר הדגירה 2 שעות תתחיל עיתוי; לעקביות בין דגימות מודפסות וזריעה, זה נחשב לנקודת הזמן 0 שעות.

5. יזואליזציה התרבות

1. לאחר 0, 2, 24, ו48 תאים לקחת שעות מכל אחת משתי השיטות דescribed לעיל ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה סטנדרטית.
   1. כתם התאים באמצעות יודיד propidium, כתם ניאון אדום ששולב רק לתוך הגרעין של תאים מתים.
      1. לשטוף בעדינות את התאים 3 פעמים עם 1 מיליליטר של בופר פוספט סידן ומגנזיום (PBS + +) כדי להסיר כל פסולת.
      2. הוסף 1 מיליליטר של PBS חימם מראש + + לכל כלי תרבות.
      3. הוסף 1 μl של פתרון מניות יודיד propidium (1 מ"ג / מיליליטר) לכל כלי תרבות.
      4. דגירה התאים מוכתמים יודיד propidium על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. תמונת התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ב10x ו 40X ההגדלה.
2. מחק את התאים במכל Biohazard מתאים.

תוצאות

תאי NIH/3T3 שורת תאי פיברובלסטים הודפסו או זורעים על פני השטח מתחת למים. התאים גדלו לצפיפות של 5 X 10 ⁴ תאים לכל מיליליטר. תאי זרע תוך שימוש בטכניקות תא תרבות מסורתיות. תאים היו שהודפסו בפורמט גדול, ראש הדפסה תא עשר זרימה שבו הערוצים גדולים יותר (~ 500 מיקרומטר) מCFM משמש לחלבונים וביומולקולות אחרות. התאים היו מודפסים או זורעים על פני השטח בסרום מצופה. תהליך ההדפסה מוצג באיור 1.

לאחר ה...

דיון

טכנולוגיית הדפסת microfluidic 3D שתוארה כאן היא מסוגל מערכי הדפסת microfluidically של תאים באופן ייחודי לנוזל מילא היטב, כלומר משטח מתחת למים. על ידי הדפסה על משטחים מתחת למים, ניתן לייצר microarrays התא, כי לשמור על הפנוטיפ רלוונטי מבחינה פיזיולוגית התאי של תאים, כמו גם את היכולת זמנית תאים בחלק התחתון של איור ויחיד 4. התוצאות של המחקר מראה כי microfluidically הדפסת תוצאות בתאים קובץ מצורף תא עם מורפולוגיה של תאים דומים וכדאיות; לעומת זא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוספוטר זרימה רציפה	Wasatch Microfluidics
תאי NIH/3T3 ATCC		CRL-1658
Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	מדיה בסיסית לתאים
מאגר HEPES	Invitrogen	15630-080	תוסף מדיה תאית (pH בקרה)
נתרן פירובט	Invitrogen	11360-070	תוסף מדיה סלולרית
פניצילין-סטרפטומיצין	תוסף מדיה תא	Invitrogen
כחול Trypan	כחול Invitrogen	15250-061	תא כתמים לספירת
המוציטומטר	פישר	267110	תא תא לספירת תאים
Nikon Eclipse TS100	Nikon		משמש לבדיקת תאים
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		משמש לאיסוף תמונות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (עם סידן ומגנזיום)	Invitrogen	14040-133	שטיפת תאים לפני המעבר ולפני צביעה עם PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	משמש להסרת תאים מפני השטח