הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices במבחנה דגם של שבץ

סיכום

פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.

תקציר

בחינת מנגנונים מולקולריים מעורבים בתנאי נוירו, כגון שבץ איסכמי, יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה, ראשוני או מערכות 'דמויות עצביות "תא התרבות נמצאת בשימוש נרחב. בעוד שמערכות אלה קלות יחסית לעבוד איתו, ומערכות שימושיות מודל שבו תוצאות שונות תפקודיות (כגון מוות של תאים) ניתן לכמת בקלות, את התוצאות הנבחנות ומסלולים בנוירונים בוגרים בתרבית (כגון מסלולי מוות של תאים בתיווך הפעלת יתר רעילה) אינם בהכרח זהים לאלו שנצפו במוח בוגר, או ברקמה שלמה. לכן, יש הצורך לפתח מודלים שבו ניתן לבחון את המנגנונים תאיים ברקמה עצבית בוגרת. פיתחנו טכניקה במבחנה שיכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מסלולים מולקולריים ברקמת עצבים בשלמותה. הטכניקה המתוארת במסמך זה מנצלת רקמת קליפת המוח חולדה, אך טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לשימוש רקמהממגוון רחב של מינים (כגון עכבר, ארנב, שפן ניסיונות, ועוף) או אזורים במוח (למשל, ההיפוקמפוס, סטריאטום, וכו '). בנוסף, מגוון רחב של גירויים / טיפולים יכול לשמש (לדוגמא, הפעלת יתר רעיל, ממשל של מעכבים, וכו '). לסיכום, מודל פרוסת המוח שתואר במסמך זה יכול לשמש כדי לבחון מגוון של מנגנונים מולקולריים המעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה.

מבוא

הצורה הנפוצה ביותר של שבץ היא שבץ איסכמי, אשר מתרחש כאשר כלי דם במוח הופך להיות חסומים. איסכמיה הרקמות שתוצאה מהפסקת זרימת דם גורמת לשלילת קוטביות נרחבת של ממברנות, שחרור שליחים עצביים מעוררים, והעלאה מתמשכת של סידן תוך תאי, מה שמוביל להפעלה של מוות של תאי מסלולי ^1. תהליך זה זכה לכינוי 'הפעלת יתר רעילה', והוא מסלול משותף מעורב במוות עצבי המיוצר על ידי מגוון רחב של פתולוגיות, כולל שבץ ^2. עיכוב של מסלולי האיתות מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומפלי מוות של תאים עצביים אחרים הוא גישה מושכת להגביל את הנזק עצבי בעקבות שבץ מוחי.

זיהוי המנגנונים המולקולריים המדויקים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ושבץ איסכמי יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה עוברית ראשונית, ו( למשל neuroblasto 'כמו עצבי-'קווים הונצחו ma ואדנוקרצינומה) מערכות תרבית תאים משמשים לעתים קרובות. היתרונות העיקריים של הדגמים האלה הם שהם קלים לתפעול, יחסית חסכוני, ומוות של תאים ניתן למדוד בקלות ונרשמת. עם זאת, ניתן לשנות מסלולי איתות על ידי תנאי culturing משמשים ^3,4, ונוירונים בוגרים והנציחו קווים יכולים לבטא קולטנים שונים ומולקולות איתות בהשוואה להבשיל מוח ^5-8. יתר על כן, נוירונים בתרבית רק לאפשר הבדיקה של סוג תא אחד (או שתיים, אם נעשה שימוש במערכת coculture), ואילו רקמות מוח שלמות היא הטרוגנית, המכילות מגוון של סוגי תאים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני. מערכות פורסים תרבות Organotypic (explants הדק של רקמת המוח) משמשות גם, ומודלים אלה מאפשרים מחקר של אוכלוסיות הטרוגניות של תאים כפי שהם נמצאים בגוף חי. עם זאת, ניתן להשיג רק כמות מוגבלת של רקמות מכל בעל חיים בעת שימוש בטכניקה זו, פרוסות יכולותלא להיות מתורבת במשך זמן רב ככל שורות תאים הונצחו, ובינוני לתרבות לטווח הארוך יכול לגרום לשינויים במסלולי איתות וקולטנים בפרוסות. בעוד מוח בוגר יכול לשמש כדי ליצור פרוסות organotypic, פרוסות מהמוח בוגר הן נוחות יותר לתרבות, ויותר מנוצלים בדרך כלל. אין אפוא הצורך לפתח מודלים אשר לחקות או לייצג את המוח שלם בוגר, שהם קלים לשימוש, שבו ניתן לבחון את מסלולי איתות עצביים.

בזאת, חוץ גופית בטכניקה מעורבת ברקמת עצבים בשלמותה, שניתן להשתמש על מנת להבהיר את המנגנונים מולקולריים המעורבים במותם של תאים הבאים עלבון הפעלת יתר רעיל או איסכמי מתוארת. טכניקה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הנדרשים לביצוע ניסוי, הוא לשחזור, ויוצרת רקמת קיימא שמתנהגת בצורה מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדולות יותר. בנוסף, המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ושיתוף postsynapticmpartment נותר בשלמותה בחלקו. החיץ הפיזיולוגי המשמש מאפשר קרום התא ל'reseal ', ומאפשר לתאים להתאושש התנגדות הקרום המקורית שלהם ^9. מודל פרוסת מוח זה מסוגל לחקות בנאמנות תגובות שנצפו בעקבות ניזק מוחי הפעלת יתר רעילה בתיווך ^10, וניתן להשתמש בם כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בשבץ.

פרוטוקול

כל ההליכים מתבצעים באישור מאוניברסיטת ניוקאסל טיפול בבעלי חיים ובועדת אתיקה, וכן בהתאם להנחיות ותקנות הרלוונטיות, ובכלל זה NSW מחקר בבעלי חיים החוק, NSW בעלי החיים תקנה המחקר, והקוד האוסטרלי של תרגול עבור טיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.

1. Dissection של רקמת המוח

1. להקריב את חולדות זכרי שנים עשר בן שבוע על ידי עריפת ראש. יכולות להיות שהקריבו את חולדות על ידי מדהים ועריפת ראש, או יכולות להיות מורדמת ראשון עם isoflurane (אינדוקציה 5%, תחזוקת 1.5-2%) ב70% N ₂ ו30% O _2, ולאחר מכן ערפו את הראש.
2. הסר את המוח מהגולגולת במהירות אפשרית (באופן אידיאלי, זה צריך להתבצע בפחות מ -2 דקות).
3. הסר את קליפת המוח על ידי ביד חופשית לנתיחה. הנתיחה צריכה להתבצע במינימום הזמן האפשרי, עם נזק מועט כלמוח ככל האפשר כדי Maintain היושרה של הפרוסות.
4. על מנת להסיר את כל עור שיורית, פרווה, דם, וכו ', לטבול את המוח בכמות קטנה (3-5 מיליליטר) של 37 ° C חיץ קרבס (118 כלוריד מ"מ נתרן, אשלגן כלורי 4.7 מ"מ, סידן כלורי 1.3 מ"מ, פוספט 1.2 מ"מ אשלגן dihydrogen, מגנזיום סולפט 1.2 מ"מ, פחמה נתרן מימן 25 מ"מ, 11.7 גלוקוז מ"מ, 0.03 חומצת disodium מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), מתאזן עם חמצן 95% / 5% פחמן דו חמצני (carbogen), pH 7.4).

2. הכנת Microslices

1. מניחים את המוח על הבמה של מסוק McIlwain שבשני פרוסות של נייר סינון הוצבו והרטיבו עם חיץ קרבס חם. שמור על המוח ונייר סינון טבול בחיץ קרבס חם, אבל לא כל כך רטוב שיש נוזל חופשי על פני השטח של הנייר שיכול לגרום למוח כדי להחליק בסביבה.
2. פורסים את המוח ל250 מיקרומטר סעיפי העטרה. כמו חומרים מזינים, חמצן וחומרי פסולת הבדרך כלל החליף עם אספקת הדם הם החליפו עם נוזל המקיף את הרקמה ברקמה עצבית מבודדת, בגודל של פרוסות לא צריך להיות יותר מ -400 מיקרומטר בעובי כדי לאפשר חילופי חמצון וחומרים מזינים מספיק כדי להתעורר.
3. הפעל את הבמה McIlwain 90 מעלות.
4. פורסים את המוח לפרוסות 250 מיקרומטר sagittal. בזאת, חלקים במוח אלה (250 מיקרומטר x 250 מיקרומטר פרוסות באורך משתנה בהתאם לעובי של הרקמה) מכונים microslices.
5. הנח את microslices לתוך צינור תחתון עגול עם 10-15 מיליליטר 37 ° C חיץ קרבס (הסכום של חיץ קרבס שימוש יהיה תלוי בכמות הרקמה).

3. איזון של Microslices

1. בעדינות להתסיס עד microslices הבודד מושעים, ולאחר מכן לאפשר להם להתיישב תחת כובד.
2. מוציא בזהירות את supernatant, אשר יהיה מעונן בשל פסולת תא מושעה, ולהוסיף 10 מיליליטר הטרי 37 מעלות צלזיוסקרבס חיץ לצינור.
3. חזור על תהליך שטיפה זו ארבע פעמים, מה שיגרום להסרה של רוב הפסולת.
4. בעקבות זאת, לאזן microslices על 37 מעלות צלזיוס עם רעד / היפוך עדין, ולשנות את קרבס חיץ כל 15 דקות לשעה 1 בסך הכל.
5. בשלב זה, להוסיף 2 מיליליטר חיץ 37 מעלות צלזיוס קרבס טרי, ולהעביר 15-20 microslices (150 μl של ההשעיה microslice) לקלקר תחתית שטוח 5 מיליליטר צינורות באמצעות פיפטה קצה נוסף רחב לשעמם עם קצוות מוחלקים (שניתן ליצור על ידי חיתוך ~ 2 מ"מ מהקצה של קצה P1000). מורחים את microslices באופן שווה על הבסיס של הצינור בשכבה אחת, כך שכל microslice הוא לא יותר מאשר כמה מילימטרים מהאווירה מחומצן.

4. גירוי יתר רעיל

1. דגירה microslices על 37 מעלות צלזיוס, ועובר ללא הרף carbogen על פני השטח של ההשעיה 150 microslice μl, תוך שימוש בקו גז שהוא עמדהאד רק מעל פני השטח של ההשעיה microslice (כדי למנוע הפרעה מכאנית).
2. פנק microslices עם או 150 μl 5 גלוטמט מ"מ + 100 מיקרומטר גליצין בחיץ קרבס (גירוי יתר רעיל: ריכוז סופי גלוטמט + 50 מיקרומטר גליצין 2.5 מ"מ) או 150 חיץ קרבס μl לבד (לשלוט nonstimulated). מגוון רחב של גירויים יכול לשמש בשלב זה (לרבות, אך לא רק, AMPA, NMDA + גליצין, שלילת קוטביות KCl, ומחסור בחמצן / גלוקוז).
3. הסר את פתרון הדגירה בזמנים שונים לאחר הגירוי (0, 30, 60, 90, 120, ו300 שניות), ולהחליף אותו עם 300 μl של חיץ המגון קר כקרח (30 מ"מ טריס, 7.4, אתילן גליקול 1 מ"מ pH חומצת tetraacetic, 4 mM EDTA, 100 molybdate מיקרומטר אמוניום, pyrophosphate נתרן 5 מ"מ, פלואוריד הנתרן 25 מ"מ, orthovanadate נתרן 1 מ"מ, phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ"מ, מעכבי פרוטאז קוקטייל מלא).
4. Homogenize microslices על קרח, תוך שימוש בזכוכית טפלון Dounce Homogenizer(20 משיכות; 700 סל"ד).
5. homogenates החנות ב -80 מעלות צלזיוס, ומולקולות איתות שונות, מולקולות מוות, וכו 'ניתן למדוד על ידי כתם מערבי.

תוצאות

Microslices שנוצר באמצעות הליך זה הוא בר קיימא, ומגוון רחב של מינים (לדוגמא, חולדה, עכבר, ועוף) יכולים לשמש לייצור microslices. שלושה צעדים עצמאיים של כדאיות כבר נוצלו: קצב נשימה (איור 1), יחסי נוקלאוטיד אדנין (איור 2), ותוכן אשלגן רקמות (איור 3). שימוש באמצעים אלה, זה כבר הוכיח כי microslices להישאר קיימא לפחות 2 שעות שלאחר דור.

microslices המוח יכול לשמש כדי לב...

דיון

בזאת, טכניקה חוץ גופית בעבור הדור של microslices שיכול לשמש כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומוות של תאים בתיווך איסכמיה ברקמת מוח בוגרת בשלמותה הוא תאר. טכניקה זו מייצרת רקמת קיימא (איורים 1-3), שהיא מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדולות ^15. יתר על כן, מודל microslice מתאים מאוד לתגובה שנצפתה בעקבות ניזק מוחי הפעלת יתר רעילה בתיווך in vivo ^10. שני 90 בגירוי מבחנה של microslices המוח עם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גיליוטינה			המשמשת לעריפת ראשי בעלי חיים
		כירורגי	מלקחיים, מספריים, פינצטה, etc., להסרת מוח ונתיחה
מסוק McIlwain מסוק McIlwain מיוצרים/מופצים על ידי מגוון חברות כולל Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments ו-Ted Pella.			משמש ליצירת 100-400 & #181; מ קטעי מוח.
צינורות פלסטיק תחתונים עגולים	אמבט
			C
מכשיר אדים/אוורור			משמש לשמירת מיקרו-פרוסות בסביבה לחה ומחומצנת
צינורות פוליסטירן עם תחתית שטוחה	Nunc
Dounce Homogenizer