מאמר שיטה

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

DOI:

10.3791/51294

⸱

10 ביוני 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Stemorgan Inc., 3Institute of Advanced Study, Technical University of Munich, 4Institute of Virology, School of Medicine, Wuhan University, 5Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, 6Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות מתוארות במאמר זה להראות כיצד להמיר מדפסת הזרקת דיו מסחרית לbioprinter עם פילמור UV בו זמנית. המדפסת מסוגלת בניית מבנה רקמות 3D עם תאים וחומרים ביולוגיים. המחקר הראה כאן נבנה neocartilage 3D.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioprinting, המבוסס על דיו להדפסה תרמית, הוא אחת הטכנולוגיות המאפשרות לאטרקטיביות ביותר בתחום הנדסת רקמות והרפואה רגנרטיבית. עם תאי בקרה דיגיטלית, פיגומים, וגורמי גדילה ניתן להפקיד דווקא לשני ממדים (2D) הרצוי ומקומות תלת ממדי (3D) במהירות. לכן, טכנולוגיה זו היא גישה אידיאלית לפברק רקמות מחקה המבנים אנטומיים האם שלהם. כדי להנדס סחוס עם ארגון האם של האזורים, הרכב תאי מטריקס (ECM), ותכונות מכאניות, פיתחנו פלטפורמת bioprinting באמצעות מדפסת הזרקת דיו מסחרית עם photopolymerization בו זמנית מסוגל להנדסת רקמות סחוס 3D. כונדרוציטים אנושיים התלויים בפולי diacrylate (אתילן גליקול) (PEGDA) הודפסו לבניית neocartilage 3D באמצעות הרכבה שכבה אחר שכבה. התאים המודפסים היו קבועים בעמדות שהופקדו המקוריות שלהם, נתמך על ידי surrounding פיגום בphotopolymerization בו זמנית. התכונות מכאניות של הרקמה המודפסת היו דומות לסחוס המקורי. בהשוואה לייצור רקמות קונבנציונלית, אשר דורש חשיפה לקרינת UV ארוכה יותר, הכדאיות של התאים המודפסים עם photopolymerization בו זמנית הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי. neocartilage המודפס הפגין glycosaminoglycan מצוין (GAG) וייצור קולגן הסוג השני, שעלה בקנה אחד עם ביטוי גנים. לכן, פלטפורמה זו היא אידיאלית לחלוקה מדויקת תא והסדר להנדסת רקמות אנטומיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioprinting מבוסס על הדפסת דיו תרמית הוא אחת הטכנולוגיות המאפשרות המבטיחות ביותר בתחום הנדסת רקמות והרפואה רגנרטיבית. עם ראשי הדפסה בקרה דיגיטלית ותפוקה גבוהה גורמי תאים, פיגומים, וצמיחה ניתן להפקיד דווקא לשני ממדים (2D) הרצוי ועמדות תלת ממדי (3D) במהירות. יישומים מוצלחים רבים כבר הושגו באמצעות טכנולוגיה זו בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית 1-9. במאמר זה, פלטפורמת bioprinting הוקמה עם 500 מערכת photopolymerization סימולטני מדפסת שונה היולט פקארד (HP) Deskjet תרמית הזרקת דיו ו. הידרוג סינטטי נוסח מפולי (אתילן גליקול) (PEG) הראו את היכולת של שמירה על הכדאיות הכונדרוציטים ולקדם את ייצור ECM chondrogenic 10,11. בנוסף, PEG photocrosslinkable הוא מסיס מאוד במים עם צמיגות נמוכה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור פולימריים בו זמניתrization במהלך bioprinting 3D. במאמר זה, כונדרוציטים אנושיים התלויים בפולי diacrylate (אתילן) גליקול (PEGDA; MW 3,400) הודפסו בדיוק כדי לבנות שכבה אחר שכבת neocartilage עם 1,400 dpi ברזולוציה 3D. הפצה אחידה של תאים שהופקדו בפיגום 3D נצפתה, אשר נוצרה רקמת סחוס עם תכונות מכאניות מעולים וייצור ECM משופר. לעומת זאת, בייצור ידני התאים שהצטברו בחלק התחתון של ג'ל במקום עמדות תחילה הופקדו עקב פילמור פיגום איטי יותר, מה שהוביל להיווצרות סחוס הומוגניות לאחר 2,3 התרבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bioprinting פלטפורמת ההקמה

שינוי המדפסת התבסס על מדפסת HP Deskjet 500 תרמית הזרקת דיו ו-HP 51626a מחסנית דיו שחורה.

  1. הסר את מכסה הפלסטיק העליון של המדפסת ובזהירות לנתק את לוח הבקרה מהכיסוי.
  2. לנתק את חיבורי כבלי 3 בין החלק העליון של המדפסת והבסיס. להסיר את החלק העליון של המדפסת מהבסיס.
  3. בחלק העליון של מדפסת, להסיר את הפלסטיק הקטן ואביזרי גומי (מערכת ניקוי ראש ההדפסה) בצד ימין מתחת למחסנית הדיו.
  4. הסר את בסיס מגש נייר עם קפיצים.
  5. הסר את הצלחת מתכתית המכסה את בר הזנת נייר הפלסטיק.
  6. חותכים את שורת הזנת נייר הפלסטיק במיקום גלגל האכלת אמצע באמצעות יד ראתה או כלי חיתוך אחרים.
  7. הסר את 2 גלגלי הזנת נייר נחשפו לאחר השלב הקודם. פלסטיק הגלגל הוא מאוד קשה ואלקטרונימסור יהיה מועיל.
  8. נקה את האבק והפסולת באמצעות מגבוני אוויר ואתנול משומרים.
  9. צרף את החלק העליון של המדפסת לבסיס.
  10. UV לעקר את המדפסת הותאם לפחות 2 שעות בזרימה למינרית לפני השימוש.
  11. חותכים את הכובע של מחסנית דיו 51626a HP באמצעות יד ראתה או כלי חיתוך אחרים.
  12. רוקן את הדיו ולהסיר את המסנן שמכסה את המאגר גם התחתון של הסחוס.
  13. יש לשטוף את המחסנית ביסודיות באמצעות מים זורמים מברז.
  14. Ultrasonicate את המחסנית במי דה מיונן (DI) ל10 דקות כדי להסיר את הדיו שיורית.
  15. בדוק את המחסנית כדי לוודא שכל הדיו הוסר. יש לשטוף או לרסס את המחסנית ביסודיות עם אתנול 70% לעיקור, ואחריו מים די מעוקרים.
  16. הגדר את מנורת אולטרה סגול ארוך גל על ​​פלטפורמת ההדפסה כדי לספק קיבולת photopolymerization בו זמנית.
  17. מודד את עוצמת קרינה בפלטפורמת ההדפסה באמצעות אור UVמטר. התאם את המרחק בין מנורת UV ופלטפורמת המדפסת כך העצמה בנושא ההדפסה היא בין 4-8 mW / 2 סנטימטר (כ 25 סנטימטר ממנורה לפלטפורמת המדפסת).

2. Bioink הכנה

  1. התרחבות הכונדרוציטים חד שכבתי
    1. צלחת 5 מיליון כונדרוציטים אנושיים לכל בקבוק תרבית רקמת T175 להרחבת תא בDulbeccos השתנה נשרים בינוניים (DMEM) בתוספת 10% נסיוב העגל ו1x פניצילין, סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG). תרבות תאים ב-C ° 37 עם אוויר humidified המכיל 5% CO 2. לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים עד שהבקבוק הוא נקודת המפגש 85%. להשתמש בתאים מאותו הקטע.
  2. ממיסים PEGDA ב PBS לריכוז סופי של 10% w / נ הוספת photoinitiator I-2959 לריכוז סופי של 0.05% w / נ סנן לעקר את הפתרון.
  3. להשעות כונדרוציטים אנושיים בתרבית בפתרון PEGDA מוכנה ב5 x 10 6 תאים / מיליליטר.

3. הדפסת רקמת סחוס

  1. הפעל את המדפסת ואת המחשב הנייד.
  2. ליצור דפוס הדפסה של עיגול מלא עם 4 מ"מ קוטר באמצעות Microsoft Word או Adobe Photoshop.
    1. להתאים את המיקום של הדפוס ולוודא שהוא יודפס בדיוק לתוך תבנית הפלסטיק.
    2. לחשב את מספר ההדפסות הנדרשות כדי להגיע לעובי הרצוי של פיגום. ל4 מ"מ גובה, 220 הדפסים נדרשים כדי ליצור את הפיגום הרצוי.
  3. טען את bioink למחסנית הדיו. כסה את המחסנית עם נייר אלומיניום כדי להגן מהחשיפה לקרינת UV הישירה בעת הדפסה.
  4. שלח פקודת ההדפסה למדפסת. משוך את חיישן נייר כאשר המדפסת מתחילה להדפיס. תהליך ההדפסה כולו צריך לקחת פחות מ 4 דקות לפיגום עם 4 מ"מ בקוטר 4 מ"מ בגובה.
  5. העברה מודפסת neocartilage לצלחת 24 היטב ומוסיפה מדיום תרבות 1.5 מיליליטר היטב כל אחד.

s = "jove_title"> 4. הערכת כדאיויות תא ב3D פיגום

  1. דגירה neocartilage המודפסת בפתרון LIVE / DEAD הכדאיות / Cytotoxicity עובד בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות בחושך.
  2. חותכים את הידרוג'ל התא עמוס במחצית ולקחת תמונות ניאון של אזור החיתוך.
  3. רוזן חיים (ירוק) ותאים מתים (אדום) על ידי משקיף סנוור בחמש תמונות אקראית שנלקחו. חישוב כדאיות תא על ידי חלוקת מספר תאי חיים במספר הכולל של תאי חיים ומתים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדפסת הזרקת דיו התרמית שונה הייתה מסוגלת לתא ותצהיר פיגום בתפוקה גבוהה וכדאיויות תא מצוינות. שילוב עם photopolymerization בו זמנית וחומרים ביולוגיים רגישים, בטכנולוגיה זו היא מסוגלת לתקן את התאים וחומרים מודפסים אחרים למקומות בם הופקדו. על פי המאפיינים של מדפסת הזרקת דיו תרמית שונה, רזולוציית הדפסת 2D הייתה 300 dpi עם אחת טיפת דיו נפח 130 pl. ישנן 50 חרירי ירי בכל ראש הדפסה בתדירות ירי 3.6 קילוהרץ 12,13. לכן למבנה מייצג של 4 מ"מ קוטר וגובה 4 מ"מ, הנפח ועובי של כל שכבה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת bioprinting זה 3D עם קיבולת photopolymerization בו זמנית מספקת רזולוציית הדפסה גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר בשיטה שדווחה בעבר הטובה ביותר של בהדפסה באתרו של מומי osteochondral באמצעות מזרק נמתחים הידרוג'ל אלגינט סלולארי 16. רזולוציית הדפסה גבוהה היא קריטית במיוחד עבור הנדסת רקמות סחוס כדי לשחזר את ארגון אזורי הסחוס אנטומיים. photopolymerization סימולטני בזמן ההרכבה שכבה אחר שכבה הוא חיוני כדי לשמור על תצהיר מדויק של תאים ופיגומים ביולוגי לבניית 3D. M...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש הסופרים אין אינטרס כלכלי במחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר את התמיכה מניו יורק אזור קפיטל אליאנס מענק המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדפסת הזרקת דיו תרמית HP Deskjet 500Hewlett-PackardC2106aהופסק. נרכש משופץ מספק אינטרנט.
מחסנית דיו שחור HPHewlett-Packard51626a
מנורת אולטרה סגולUVPB-100AP
מד אור UVGeneral ToolsUV513AB
Zeiss LSM 510 מיקרוסקופ סריקת לייזרCarl ZeissLSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)Mediatech10-013
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG)Invitrogen10378-016
מגיב דיסוציאציה של תאי AccutaseInvitrogenA11105-01
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Invitrogen10010-023
ערכת חיות/ציטוטוקסיות חיה/מתהInvitrogenL-3224
פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט (PEGDA)Glycosan BiosystemsGS700
Irgacure 2959Ciba כימיקלים מיוחדיםI-2959
כונדרוציטים מפרקיים אנושייםLonzaCC-2550

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
  4. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
  5. Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
  6. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
  7. Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
  8. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
  9. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  10. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
  11. Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
  12. Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
  13. Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
  14. Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
  15. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
  16. Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PEGDA

מאמרים קשורים