יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב
במאמר זה
סיכום
תקציר
הנדסת חלבונים רקומביננטיים ניצלה חיידקי Escherichia מערכות (E. coli) ביטוי לכמעט 4 עשורים, והיום ה coli הוא עדיין אורגניזם מארח בשימוש נרחב ביותר. הגמישות של המערכת מאפשרת התוספת של moieties כגון תג ביוטין (עבור אינטראקציות streptavidin) וחלבונים תפקודיים גדולים יותר כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק או חלבון אדום דובדבן. כמו כן, השילוב של חומצות אמינו לא טבעיות כמו chelators יון מתכת, קבוצות פונקציונליות ייחודי תגובתי, בדיקות ספקטרוסקופיות, ומולקולות הקניית לאחר translational שינויים אפשר מניפולציה טובה יותר של תכונות חלבון ופונקציונליות. כתוצאה מכך בטכניקה זו יוצרת חלבוני היתוך להתאמה אישית שמציעים כלי משמעותי לתחומי מחקר שונים. באופן ספציפי יותר, רצף חלבון biotinylatable כבר שולב לתוך חלבוני יעד רבים בגלל האינטראקציה זיקה הגבוהה בין ביוטין עם avidin וstreptavidin. תוספת זו סייעה בשיפור זיהוי וטיהור של חלבונים מתויגים, כמו גם לפתוח דרך ליישומים משניים כגון מיון תא. לכן, מולקולות שכותרתו ביוטין להראות השפעה גוברת ונרחבת בתחומים bioindustrial ויו. לצורך המחקר שלנו יש לנו מהונדס חלבוני היתוך biotinylated רקומביננטי המכילים גורם עצב צמיחה (NGF) וsemaphorin3A (Sema3A) אזורים פונקציונליים. יש לנו דיווח בעבר כיצד חלבוני היתוך biotinylated אלה, יחד עם רצפי חלבון פעילים אחרים, יכולים להיות קשורים לחומרים ביולוגיים להנדסת רקמות ומטרות רגנרטיבית. פרוטוקול זה מתאר את היסודות של חלבוני biotinylatable ההנדסה בקנה מידת מיליגרם, ניצול וקטור T7 Lac מושרה וא מארחים coli ביטוי, החלו משינוי בהיקף של למעלה וטיהור.
מבוא
חלבונים לכסות טווח רחב של ביומולקולות כי הם אחראים לתפקודים ביולוגיים רבים, סופו של דבר מוביל להיווצרות רקמה תקינה וארגון. מולקולות אלה ליזום אלפי איתות מסלולים השולטים עד ויסות ו / או למטה רגולציה של גנים וחלבונים אחרים, שמירה על שיווי משקל בגוף האדם. שיבוש של חלבון יחיד משפיע על אינטרנט זה שלם של אותות, אשר יכול להוביל להתפרצות של הפרעות או מחלות הרסניות. הנדסת חלבונים בודדים במעבדה מציעה פתרון אחד למאבק בתופעות הלוואי הללו ומציע אלטרנטיבה לתרופות מולקולה קטנות. ב1977, גן מקודד רצף סומטוסטטין חומצת אמין 14 היה אחד מפוליפפטידים הראשונים המהונדסים שנוצרו באמצעות ה coli 1. זמן קצר לאחר מכן בשנת 1979, אינסולין....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. עיצוב של חלבון המטרה
- באמצעות המרכז הלאומי לאתר מידע ביוטכנולוגיה (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) להשיג רצף אמינו לחלבון המטרה לקחת בחשבון את המין של עניין וכל גרסאות אחוי. בחר את רצף החומצות האמיניות שמתאים לאיזור הפעיל בעניין של החלבון.
הערה: לקבלת Sema3A, חומצות אמינו 21-747 נבחרו. חלבון היתוך נועד עם NGF בו הרצף של barstar, חומצת אמינו 1-90, התווסף לחומצות אמינו NGF 122-241. - לN-סופית להוסיף את הרצפים הבאים: תג 6X-לטיהור (hhhhhh), וירוס הטבק Etch (TEV) אתר פרוטא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיבוט וביטוי מבחן
כאשר ציפוי מבוצע כראוי, מושבות מבודדות אחת צריכה טופס כדי להגדיל את הסיכוי של מריטת תאי חיידקים הפכו משובט (איור 2 א). עם זאת, אם יותר מדי תאים הם מצופים, הצלחות מודגרת יותר מדי זמן ב-C ° 37 או שינוי הוא בספק, מושבות עשויות לכסות את הצלחת אגר או ליצור אגרגטים גדולים יותר של תאים (2B דמויות ו2C). במהלך ביטוי בדיקה, NGF וSema3A היו מושרה ראש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה חזקה מאוד שמשתרעת על פני תחומים רבים. זה חסכוני, מתכונן והליך פשוט יחסית, המאפשר הייצור של תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד. חשוב לציין כי עיצוב ולבטא חלבוני מטרה הוא לא תמיד פשוט. ביטוי בסיסי ויציבות חלבון רקומביננטי תלויה בבחירות ספציפיות של וקטור, E. זני coli תא, שנוספו תג פפטיד ופרמטרי טיפוח. קריטריון העיצוב הספציפי שלנו מנצל א מבוסס היטב coli זנים להנדסת חלבונים. בנוסף, וקטור פלסמיד מכיל אמרגן לא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להכיר אוניברסיטת אקרון למימון שתמך בעבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 גרם |
| 2-הידרוקסיאתילמרקפטן ובטא;-מרקפטואתנול | Chem-Impex International | 642 | 250 מ"ל |
| חומצה אצטית, | EMD | AX0073-9 | 2.5 ליטר |
| אגר | ביושופ | AGR001.500 | 500 גרם |
| מלח נתרן אמפיצילין | סיגמא-אולדריץ' | A9518 | 25 גרם |
| נגד קצף 204 | סיגמא-אולדריץ' | A6426 | 500 גרם |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 ומיקרו; g | |
| BL21(DE3) תאים מוכשרים | Novagen | 69450 | 1 מ"ל; Expression Host |
| מגיב ברדפורד | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 מ"ל |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 מ"ל |
| סינון ג'ל סטנדרטי | Bio-Rad | 151-1901 | 6 בקבוקונים |
| גליצרול | ביושופ | GLY001.1 | 1 ליטר |
| גואנידין הידרודיוריד אמיופורממידין הידרוכלוריד | Chem-Impex International | 152 | 1 ק"ג |
| His-Pur Ni-NTA שרף | Thermo Scientific | 88222 | 100 מ"ל |
| חומצה הידרוכלורית | EMD | HX0603-3 | 2.5 ליטר |
| אימידזול | Chem-Impex International | 418 | 250 גרם |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 גרם |
| מאגר דגימת Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | 30 מ"ל |
| מלח נתרן לאוריל סולפט, משטח נתרן דודציל | Chem-Impex International | 270 | 500 גרם |
| מרק LB | סיגמא-אולדריץ' | L3022 | 1 ק"ג |
| NovaBlue תאים מוכשרים Novagen | 69825 | 1 מ"ל; שיבוט מארח | |
| פוספט חוצץ | מלח Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 חבילה |
| אשלגן כלורי | Chem-Impex International | 01247 | 1 ק"ג |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 ומיקרו; g | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 ליטר |
| נתרן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | S5886-1KG | 1 ק"ג |
| נתרן הידרוקסיד | פישר סיינטיפיק | S318-500 | 500 גרם |
| נתרן פוספט דיאבסיסי | סיגמא-אולדריץ' | S5136-500G | 500 גרם |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא-אולדריץ' | S5011 | 500 גרם |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 ק"ג |
| טטרציקלין הידרוכלוריד | Chem-Impex International | 667 | 25 גרם |
| Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 ליטר |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 ק"ג |
| טריפטון, | לבלב EMD | 1.07213.1000 | 1 ק"ג |
| תמצית שמרים, EMD מגורען | 1.03753.0500 | 500 גרם | |
| Ä KTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | כולל ערכות ואביזרים |
| שייקר אורביטלי שולחני | Thermo Scientific | SHKE4000 | אנזים MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | מגיע עם מאגרי תגובה ותמיסת ביוטין |
| קלטת דיאליזה | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (חוזק נוסף) |
| צינורות | דיאליזהמעבדות ספקטרום | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 ו-50,000 |
| שסתום הסחת זרימה FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| ערכת בדיקת כימות ביוטין של FluoReporter מדפי | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950, מתלה C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| אספן שברים Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | כולל ערכות ואביזרים |
| סירקולטור מחומם/מקורר | VWR | 13271-102 | דגם 1156D |
| תנור חימום קלסר | מסדרת FD | דגם FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | הופסק - מוצר חלופי: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti צנטריפוגה | בקמן קולטר | 393126 | |
| JA 25.50 רוטור | בקמן קולטר | 363055 | |
| JLA 8.1 רוטור | בקמן קולטר | 969329 | כולל בקבוקי פוליפורפילן 1 ליטר |
| JS 5.3 רוטור | בקמן קולטר | 368690 | |
| קולט אדים זרימה למינרית | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 סדרה נקייה ספסל |
| קורא מיקרופלייט | TECAN | אינסוף M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel אנכי מערכת אלקטרופורזה |
| Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים | Bio-Rad | 456-9036 | כל kDa, מסרק 15 בארות |
| Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 מ"ל נפח ECONO-Column |
| פלסמיד מיני-פרפ ערכת | אומגה ביו-טק | D6943-01 | |
| PowerPac HC ספק כוח | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| צינורות קופולימר פוליפרופילן תחתון עגול | VWR | 3119-0050 | 50 מ"ל צינורות לרוטור JA 25.50 |
| רכזי Spin-X UF | קורנינג | 431488, 431483 | 20 ו -6 מ"ל; MWCO: 10,000 Da |
| Subcloning Service | GenScript USA Inc. | שירותי חלבון | |
| מעבד אולטרסאונד | קול-פארמר | 18910445A | דגם CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | דגם G560 |
מקורות
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
