מאמר שיטה

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

DOI:

10.3791/51305

⸱

16 באפריל 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 4Department of Medicine, University of Minnesota Medical School, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני זמנית יכולים לספק מידע מועיל למנגנונים תאיים בסיסיים ולמנוע בזבוז של חומרים כימיים וניסויים חוזרים מיותרים. אנו מתארים כאן assay פעילות זמנית caspase-3/7, תוך שימוש בשיטות ניאון ומבוסס זורח, כדי לקבוע כדאיות תא במודל ההיפותלמוס במבחנה הבאה אתגר חמצוני עם חומצה פלמיטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת זמנית מבחני במחקרים של מנגנונים תאיים מורכבים מבטלת את הצורך בניסויים חוזרים ונשנים, מספקת בקרות פנימיות, ומצמצמת בזבוז בעלויות וחומרים כימיים. כאן אנו מתארים אופטימיזציה של assay זמנית להעריך אפופטוזיס הבאים חומצה פלמיטית אתגר (PA) במודל ההיפותלמוס במבחנה, באמצעות שני ניאון וזורח מבוסס מבחני כדי למדוד ספירת תאי קיימא וcaspase-3/7 פעילות ב96 היטב פורמט צלחת microtiter. בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית, תאי קיימא נקבעו על ידי assay ניאון מבוסס resazurin. Caspase-3/7 פעילות הייתה אז נקבע באמצעות מצע luminogenic, DEVD, ומנורמל למספר סלולרי. assay הריבוב זוהי טכניקה שימושית לקביעת שינוי בפעילות caspase הבאה גירוי אפופטוטיים, כגון אתגר חומצת שומן רווי. חומצת השומן הרווי הרשות יכולה להגדיל את לחץ חמצוני ההיפותלמוס ואפופטוזיס, המציין את פוטנציאל importaNCE של מבחני כגון זה שתואר כאן בחקר הקשר בין חומצות שומן רוויות ותפקוד עצבי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאטות עשירות בחומצות שומן רוויות, כגון חומצה פלמיטית (PA) נמצאו קשורות להשמנת יתר ומחלות רקע אחרים, כוללים מחלת סוכרת 1, 2 לב וכלי דם. דיאטות שומן גבוהה יש גם הוכחו כדי להגדיל את לחץ חמצוני, אפופטוזיס, וניוון עצבי בהיפותלמוס, רגולטור חשוב של תיאבון והאנרגיה ההוצאה 3-7. הבנת המנגנון שבאמצעותו חשיפת דיאטת שומן גבוה גורמת לחוסר ויסות ההיפותלמוס כן ​​חשובה לפיתוח של טיפולים תרופתיים להשמנת יתר. עם זאת, המנגנונים התאיים שבאמצעותו שומן משפיע על תפקוד עצבי עדיין אינם ברורים. הבנה טובה יותר של איך שומנים כגון הרשות הפלסטינית עלולים לעורר התפרצות של מסלולים אפופטוטיים ההיפותלמוס היא צעד ראשון הכרחי לקראת מטרה זו. מטרת מאמר זה היא לתאר זמנית assay לבדיקות במבחנה של תגובה העצבית לחשיפה של הרשות הפלסטינית, שפותח עבור שימוש במחקרים של שעותניוון מוחיים ypothalamic. אנו מספקים תיאור מפורט של assay במבחנה 96 היטב תבנית זמנית למדידת caspase 3/7 פעילות למספר כולל של תאים בשורה מובחנת הונצחה עכבר המבוגר ההיפותלמוס תא (המיועדת A12) לאחר אתגר חמצוני עם הרשות הפלסטינית 8.

בקצרה, כדאיות תא נקבעת בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית באמצעות assay resazurin מבוסס. Resazurin היא תרכובת חדירה תאים שעוברת הפחתה האנזימטית בתאים פעילים מטבולית, תהליך המחשבה להתרחש באמצעות המיטוכונדריה 9. תאי קיימא ברציפות להמיר resazurin לresorufin, הפקת אות ניאון פרופורציונלית למספר תאי קיימא. פעילות caspase-3/7 אז הוא ניתח באמצעות assay lumogenic מבוסס DEVD. DEVD הוא רצף חומצות אמינו (ASP-Glu-Val-ASP) ביקע ידי caspase-3. כאשר רצף זה הוא מצמידים את חומר lumogenic, עם הפעלה של caspase-3/7 תאיים ומחשוף שלאחר מכןשל מצע DEVD, המוצר זורח הוא שוחרר. תגובה זו היא מידתית לפעילות caspase ובכך לאינדוקציה של אפופטוזיס. ככל שתאים מתים לא יכולים לייצר caspase, caspase-3/7 פעילות היא על ידי חולף טבע; לכן ניתוח אמור להסתיים בין 30 דקות עד 4 שעות לאחר אתגר, תלוי באפקטיבי של לחץ בתא. כדאיות תא עומד ביחס הפוך לפעילות caspase-3/7 והוא יכול לשמש כדי לקבוע מנגנונים של מוות של תאים. לדוגמא, בשיטה זו יש בעבר נהגה להראות טיפול מקדים שעם הורמון פפטיד orexin מפחית אפופטוזיס בתאי ההיפותלמוס תיגר עם מי חמצן, מה שמרמז כי המנגנונים מושפעים מטיפול זה הם חשובים בהגנה מפני נזק חמצוני 10. חשוב לציין, מבחני אלה הם תא קו ורקמות תלויות, כפי שהם סומכים על פעילות המיטוכונדריה להפחית ריאגנטים assay. פרוטוקול זה כבר מותאם לההיפותלמוס עכבר בוגר (A12) תאים; עם זאת,שיטות שתוארו ניתן לשנות כדי שיתאימו למסגרת של מחקר דומה.

מבחני ריבוב מתרבות אחת גם מספק יתרון על פני השיטה המסורתית של ביצוע מבחני בודדים מכמה סיבות. בנוסף לחיסכון בזמן, דגימות תאים, וחומרים כימיים תרבות, מבחני ריבוב יכולים גם לספק ידע של הישרדות תא ומוות, מספקים בקרות פנימיות, ולבטל את הצורך בניסויים חוזרים ונשנים 11, 12.

שיטות אלטרנטיבי יש לסמוך על כתמים מערביים או ELISAs, שהם מבחני אמינים, אבל הם יקרים וזמן רב (1-2 ימים), במיוחד בעת שימוש בפורמט 96 היטב. לא כולל את הזמן שלוקח לתאי תרבות עבור assay הריבוב, הזמן הכולל הוא פחות מ -3 שעות. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם A12 תאים, זה יכול להיות שונה לשימוש במודלים אחרים, תוך שמירה על בגורמים נפשי שעלולות להשפיע על שלמות תא. להרתיעכרייה אם פרוטוקול זה יעבוד עבור סדרה של ניסויים תלויה במספר דוגמאות או תנאי ניסוי ועל ניסויים במורד הזרם מתוכננים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציפוי ותחזוקה של תרבית תאים

  1. תקשורת ותרבות הנשר בינוני השתנה Dulbecco החם (DMEM) (FBS +10% DMEM + 1% פניצילין / סטרפטומיצין / neomycin) 37 ° C.
  2. השג המניה של A12 תאים קפואים מ-80 ° C.
  3. במהירות להפשיר תאים ב37 אמבט מים מעלות צלזיוס; מופשר פעם אחת, בעדינות תאי פיפטה להעביר לבקבוק תרבות פרקה 75 2 ס"מ ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת ותרבות.
  4. דגירה לילה בקבוק ב 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. תקשורת לשאוב לאחר 24 שעות ולהחליף עם תקשורת טרי. להמשיך ולצמוח תאים עד מפגש 70-80% מתקבל (צמיחת 2-3 ימים).

2. תאי ספירה וציפוי

  1. DMEM חם ופתרון 1x-טריפסין-EDTA 37 ° C.
  2. תקשורת לשאוב מהתאים ולשטוף פעמיים עם שנאגרו מלוח פוספט סטרילי (PBS).
  3. הוסף 500 μl של פתרון טריפסין ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
  4. לנתקתאים מבקבוק באמצעות מגרד ולהשעות תאים 5 מיליליטר של תקשורת. עובר תאים דרך מסננת ותעבור דרך מסננת תא לתוך צינור מיליליטר נקי 50. ייתכן שיצטרך לעבור תאים דרך מסננת יותר מפעם אחת, אבל לא חוזר יותר משלוש פעמים.
  5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע כמות תאים לתרבות לזרע 6,000 תאים / היטב בצלחת 96 היטב ברורה תחתונה שחורה או לבנה מוקפת חומה בנפח סופי של המדיה 100 μl. דגירה צלחת ב 5% CO 2 ב-C ° 37 ל24 שעות.

3. קביעת כדאיויות תא וcaspase-3/7 פעילות

  1. העבר את הרשות הפלסטינית לבקבוקון זכוכית 5 מיליליטר סטרילי וsolubilize ב100% sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל פתרון הרשות הפלסטינית מניית 1:10 ב DMSO ולהוסיף אותו לprewarmed DMEM כדי להשיג ריכוז עבודה סופי של 0.1 מ"מ הרשות הפלסטינית. לבקרת מדיה, להוסיף אותו הריכוז של DMSO שמתווסף לתקשורת המכילה הרשות הפלסטינית.
  2. הסר את המדיה בכל טוב ולהחליף עם 50 תקשורת μl + / -הרשות הפלסטינית. דגירה את הצלחת לשעה 2 ב5% CO 2 ב 37 ° C. לאחר מכן להוסיף 5 מגיב resazurin μl ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. באמצעות קורא microplate אופניים, הקרינה שיא (560 EM EX / 590) כדי למדוד כדאיות תא. תוצאות מוצגות כיחידות יחסי הקרינה (RFU).
  4. לאותה הצלחת, להוסיף 55 μl של מגיב caspase ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
  5. שוב באמצעות קורא microplate, הארה שיא כדי למדוד את פעילות caspase-3/7. תוצאות מוצגות כיחידות יחסי הארה (RLU), עם הארה ביחס ישר לcaspase-3/7 פעילות.
  6. לנרמל את פעילות caspase-3/7 לספירת תאים, לחלק את תא הכדאיות (RFU) על ידי caspase-3/7 פעילות (RLU).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול לעיל מתאר את תוצאות בשני מבחני נפרדים הריבוב לקבוע מנגנונים של מוות של תאים. איור 1 מציגה סקירה כללית של הפרוטוקול כדי לקבוע כדאיות תא וcaspase-3/7 פעילות. פעילות caspase הייתה גדלה באופן משמעותי בתאי תיגר עם הרשות הפלסטינית לאחר 2 דגירה שעה (איור 2 א ולוח 1). אובדן שלמות קרום תא הוא שינוי המורפולוגי הקשורים לגרימת מות תאים מתוכנת, שבאה לידי ביטוי בתאים לאחר חשיפת 2 שעות לרשות פלסטינית (איור 2). איור 3 מתאר את מסלול הפוט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זמנית assay הוא טכניקה מקובלת היטב כי כבר בשימוש על ידי מדענים במספר רבים של יישומים כגון microarrays PCR, immunodetection, ושיטות המבוססים על חלבונים אחרים זיהוי 13, 14. לאחרונה, מבחני ריבוב הפכו מנוצלים יותר ויותר בניסויים במבחנה המבוססת על צלחת ואומת כשיטת מדויקת להערכת cytotoxicity וכדאיות 12. בפרוטוקול לעיל, אנו מדגימים את היעילות של מבחני ניאון וזורח ריבוב לקבוע פעילות caspase-3/7 וכדאיויות תא בתאים A12 הבאים אתגר הרשות הפלסטינית. כדאיות תא נקב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש הסופרים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה המתוארת כאן מומנה על ידי משרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא במעבדת המחקר ביו ופיתוח BX001686-1A1 ומחקר שיקום VA ופיתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קו תאי היפותלמוס של עכבר בוגר mHypoA-1/2 סלוטיונס ביוסיסטמס בע"מCLU172
דולבקו s Modified Eagle' s MediumInvitrogen10313-039
סרום בקר עוברי PAA LabsA15-751
פניצילין/סטרפטומיציןInvitrogen15070-063
חומצה פלמיטיתסיגמא-אולדריץ'P0500
דימטי סולפוקסיד Sigma-AldrichD2650

PrestoBlue מגיב כדאיות תאים		InvitrogenA13262
Caspase-Glo 3/7 מערכות בדיקהPromegaG8091
96 W צלחת תחתונה אופטית, פוליסטירן שחור, תרבית תאים מטופלת, עם מכסה, סטריליתרמו פישר 165305
SpectraMax M5 מכשירים מולקולריים רב-מצביים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
  2. Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
  3. Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
  4. Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
  5. Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
  6. Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
  7. Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
  8. Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
  9. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  10. Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
  11. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  12. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
  13. Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
  14. Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
  15. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  16. Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
  17. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Caspase 3 7DEVD

מאמרים קשורים