ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 'סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים במבחנה

Summary

RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.

Abstract

סוף '3 של mRNAs היונקים לא נוצר על ידי הפסקה פתאומית של שעתוק על ידי RNA פולימראז II (RNPII). במקום זאת, RNPII מסנתז mRNA המבשר מעבר לסוף RNAs הבוגר, ותהליך פעיל של פעילות endonuclease נדרש באתר ספציפי. מחשוף של RNA המבשר בדרך כלל מתרחש 10-30 NT במורד הזרם מאתר הקונצנזוס הפולה (AAUAAA) לאחר dinucleotides קליפורניה. חלבונים ממתחם המחשוף, חלבון מורכב multifactorial של כ 800 kDa, להשיג פעילות nuclease הספציפית הזה. רצפי הרנ"א ספציפיים מעלה או במורדו של האתר הפולה לשלוט על הגיוס של מתחם המחשוף. מייד לאחר מחשוף, טרום mRNAs הם polyadenylated ידי פולימראז הפולה (PAP) כדי לייצר להבשיל הודעות RNA יציבים.

עיבוד של סוף '3 של תעתיק הרנ"א ניתן ללמוד באמצעות תמציות גרעיניות סלולריות עם מצעי RNA רדיואקטיבי ספציפיים. לסיכום, ³² ארוכים ^</ Sup> RNA מבשר uncleaved P-שכותרתו הודגרו עם תמציות גרעיניות במבחנה, ומחשוף נבחנים על ידי ג'ל אלקטרופורזה וautoradiography. כאשר מחשוף ראוי מתרחש, קצר יותר 5 'ביקע מוצר מזוהה וכימות. כאן, אנו מתארים assay המחשוף בפירוט משתמשים, כדוגמא, עיבוד הסוף '3 של HIV-1 mRNAs.

Introduction

ביוסינתזה של רוב RNAs הבוגר אוקריוטים הודעה (mRNAs) דורשת מספר שינויים לאחר תעתיק כגון מכסת, שחבור וpolyadenylation. שינויים אלה הם בדרך כלל בשילוב כדי להבטיח עיבוד נכון ¹ ומאוד להגדיל את היציבות של mRNA.

3 'היווצרות סוף מראש mRNAs יונקים מופקת על ידי מחשוף endonucleolytic של RNA המתהווה אחריו תוספת של שאריות adenylate ל5' ביקע מוצר על ידי פולי פולימראז (א) (PAP) ^2-4. ביונקים, מחשוף מושגת על ידי חלבון מורכב multicomponent, של כ 800 kDa, אשר מרכיב על רצפים מראש RNA ספציפיים. פולי () רצף אות, AAUAAA רצף hexanucleotide הקנונית השמור ביותר, מכוונים את אתר המחשוף בכ 10-30 NT במורד הזרם. אתר זה מוכר במיוחד על ידי גורם המחשוף וpolyadenylation הסגוליות (CPSF) ומקטע KD 73 שלCSPF מכיל את פעילות endonuclease. גורם גירוי המחשוף (CstF) נקשר יותר מנוון רצף אלמנט GU-U או עשיר במורד הזרם של פולי (א ') באתר. נדרשו גם למחשוף הוא גורם היונקים המחשוף אני (CFIm), וגורם היונקים המחשוף השני (CFII). CFIm נקשר אתרי UGUA (N) הספציפיים באלמנטים במעלה הזרם רצף (שימושים) שהוגדרו עבור מספר גנים ונראה שהם מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים חשובים ^5-8.

במבחנה, תגובות עיבוד RNA מנותחות בדרך כלל על ידי השימוש במצעי RNA רדיואקטיבי ^9-12. אלה עשויים להיות מסונתזים על ידי שעתוק נגר מT7 אמרגן bacteriophage או SP6. כאשר לומדים אתר polyadenylation שלא אפיין בעבר, יש צורך להשתמש בהדנ"א הגנומי ולא cDNA כדי ליצור את מצע RNA, כרצפים במורד הזרם חשובים לא יכולים להיות נוכחים בcDNA. מצעי עיצוב לכלול לפחות 150 upstrea NTמ 'ו50 NT במורד הזרם מאתר המחשוף / סיום על mRNA הבוגר. מוצר המחשוף נודד מהר יותר מאשר המצע; עם זאת, בגלל שברים אחרים עלולים להיווצר על ידי פעולת nuclease שאינו ספציפית, את הספציפיות של התגובה צריכה להיות מאומתת על ידי תלותה ברצפי עיבוד אותות הנכונים. לכן, מצעי RNA עם מוטציה נקודתית ברצף AAUAAA (למשל AAGAAA) ישמשו כביקורת שלילית לתגובת המחשוף.

בהתחשב בעובדה שכמות קטנה של RNA רדיואקטיבי משמשת לתגובות המחשוף, RNases הווה בשפע הגבוה ביותר בתמציות הגרעיניות יכולה להיות בעייתית, ולהגביל את הבחירה של החומר המוצא להכנת תמצית. תאי הלה נוטים להכיל רמות נמוכות של RNases אנדוגני, ובכך לבצע גם במבחנים אלה.

מחשוף endonucleolytic של מצעי RNA in vivo ו במבחנה ומייד אחריו פולי (א) בנוסף לכך, ה 'ים ביניים ביקע אינם נוכחים בכמויות לזיהוי. לכן, כדי ללמוד או רצף RNA ספציפי או חלבונים מעורבים בתגובת מחשוף, ניסויים נעשים בתנאים המונעים polyadenylation התרחשות. אין תלות של מחשוף בpolyadenylation, או להיפך, ולכן אחד לא יכול לעצור polyadenylation מבלי לפגוע בתגובת המחשוף. לפיכך, ה-ATP מוחלפת אנלוגי שרשרת סיום שחסרת ​​קבוצת הידרוקסיל '3, כך שרק נוקלאוטיד יחיד יכול להיות משולב באתר פולי () ורק RNA ביקע ניתן לאתרם.

בהתחשב במורכבות וברמה גבוהה של ייחוד של סוג זה של assay, אנו מתארים פרוטוקול וידאו מפורט ללמוד מחשוף endonucleolytic ידי מכונות מחשוף / midi () של מבשרי ה-mRNA במבחנה. אנו מתארים כיצד להכין תמציות גרעיניות המוסמכות, לייצר מצעי RNA רדיואקטיבי, לבצע את תגובת הביקוע, ולנתח ולפרש את התוצאהמוצרי ing. איור 1 מציג דוגמא של RNAs מצע קידוד לסוף '3 ​​של HIV-1 מראש mRNAs לשמש לassay מחשוף. סוף '3 ​​של הגנום RNA HIV מורכב מהרבה רצפים רגולטוריים חשובים כגון אתר פולי (א'), אזור עשיר G + U, ואת אלמנט שימוש, אשר כולם הכרחיות להתבגרות יעילה של תעתיקי mRNA הנגיפי ¹³ . בדוגמא זו שהיינו מצפה מצע RNA הקלט להיות 338 NT ועל מחשוף 237 NT. אם polyadenylation הורשה להתרחש, כתם של מוצרים יהיה נצפה בין 237 ו437 NT.

Protocol

1. הסתגלות של תאים חסידים להשעיה

(זו היא צעד אופציונלי. תאי השעיה בדרך כלל לעשות תמציות גרעיניות טובות יותר, לעומת זאת תאים שגודלו בצלחות עשויים לשמש גם.)

1. להתאים את התאים חסיד לצמיחה בהשעיה באמצעות MEM של Joklik שונה בתוספת 5-10% בסרום יילוד עגל או בסרום שור העובר ו1% L-גלוטמין: פניצילין, סטרפטומיצין. הפץ תאים בצלוחיות טווה עם מכסה מסנן על 37 ° C עם 8% CO _2.
2. כאשר התאמת תאים, להתחיל עם בבקבוק 500 טווה מיליליטר 100 מיליליטר. לשמור 0.3 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר מינימום ולהחליף את המדיום כל 1-2 ימים עד ששיעור הצמיחה הנאותה מושגת (בדרך כלל 2-6 שבועות). מותאם ברגע, תאי הלה בהשעיה צריכים להכפיל בערך כל 24 שעות הערה:. בשלב ההסתגלות, זה ייקח קצת זמן לכדי להחזיר את התאים לקצב ההכפלה הרגיל שלהם.
3. לשמור על התאים בדןsity של 0.5-0.8 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בנפח הסופי הרצוי (בדרך כלל 1-10 L)
4. תאים נקצרים בדרך כלל בשלב אמצע יומן (כ 0.5-.65 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ו> 90% קיימא). השתמש בבקבוק טווה בגודל המתאים לכמות הרצויה של תקשורת ותרבות.

2. תמציות גרעיניות

1. חיץ ומגיב הכנה
   הערה: עקירות מבוצעות הבא אל Dignam et שונה (1983) ¹⁴ הליך תמצית גרעינית..
   1. הכן ופר פוספט 1X, חיץ, חיץ C, וחיץ D (טבלת 1) היום לפני שתמשיך עם עקירות ולאחסן ב 4 ° C.
      הערה: תשואות גבוהות יותר, בדרך כלל, שהושגו עם חיץ מוכן טרי; לעומת זאת, החיץ הוא יציב במשך כמה שבועות. חשוב שכל המאגרים, מנגנונים והציוד הם מראש מקוררים וכל זמן קר לשלמות של עקירות.השתמש בחדר קר לצעדים רבים ככל האפשר ו / או לשמור את הכל על קרח. הוספת DTT וPMSF מייד לפני השימוש.
2. איסוף ושטיפת תאים
   1. יוצקים תאים לארבעה 250 מיליליטר בקבוקים וספין חרוטי ב XG 500 למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה עם נדנוד או הרוטור זווית קבועה. supernatants למזוג ולהוסיף עוד מדיום תרבית תאי 250 מיליליטר לכל בקבוק. חזור על ספינים עד שכל התאים כבר pelleted.
   2. Resuspend כדורים סופיים משולבים בסך של 250 מיליליטר של PBS קר כקרח ובריכה לתוך בקבוק חרוטי אחד 250 מיליליטר. ספין התאים ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה דלי מתנדנד.
   3. יוצקים את supernatant ו resuspend התא גלולה ב קר כקרח PBS כך הנפח הכולל אינו עולה על 50 מיליליטר. לשחרר את הכדור באמצעות פיפטה ולהעביר צינור צנטריפוגות 50 חרוטי מיליליטר.
   4. ספין התאים שוב ב XG 500 במשך 6 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה דלי מתנדנד. יוצקים את supernatant והערכה ולב גלולה נפח תא (CPV) בצורה מדויקת ככל האפשר. השתמש במים בצינור התאמה נפרד, לשם השוואה, אם גלולה נמוכה מסימוני הנפח על הצינור.
3. תמוגה תא
   1. הוספת DTT למאגר א Resuspend גלולה במאגר באמצעות 5 כרכים של אומדן CPV. פיפטה כדי לשבור את גלולה ולדגור על קרח למשך 10 דקות.
   2. ספין התאים ב931 XG 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה דלי מתנדנד.
   3. בזהירות לשאוב supernatant במקום decanting. גלולה הנפח צריך מוגבר בערך פי שניים בגודלם עקב נפיחות של התאים.
   4. הוספת CPV 1 של חיץ לתאים. בעדינות לשבור את גלולה ולהסיר aliquot קטן (כ -50 μl) לצינור microfuge על קרח. להעביר את תאי resuspended לתוך homogenizer בגודל מתאים Dounce (בדרך כלל 15 גודל מיליליטר) מקורר בקרח.
   5. Lyse התאים עם 12-15 משיכות איטיות אך יציבים מסוג B (tigHT) העלי. הסרת aliquot קטן של lysate ולבחון תחת מיקרוסקופ לתמוגה מלאה (גרעינים קטנים וחשוכים ללא פגע בהשוואה לתאים נפוחים) על ידי צביעת trypan הכחולה. תאים שלמים יהיו ברורים). המשך homogenation עד תמוגה 90% מושגת ולעצור כאן, מעל douncing עלול להשפיע לרעה על איכות של תמציות גרעיניות.
   6. העבר את lysate לתוך צינורות ultracentrifuge ultraclear ולב הנפח הכולל. לאזן על ידי שקילת הצינורות והספין ב1,069 XG 10 דקות ב 4 ° C.
      הערה: ultracentrifuge משמש בשלב זה, למרות מהירות הסחיטה הנמוכה בגלל אותו הצינור יהיה הסתחרר במהירות גבוהה יותר בשלב הבא. הספין הזה יניבו גלולה הדוקה למדי מכסה את החלק התחתון של הצינור עם supernatant המעורפל לעיל, אשר עשוי להיות שנאסף ומשמשת לתמציות S100 cytosolic. אם יש שכבת שומנים גלויה בחלק העליון של הצינור, ניתן להסיר אותו.
   7. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולהעביר אותו לanoth.. צינור אה הימנע מלהפריע גלולה הגרעינית הערה: זה יהיה חשוב לדעת את הנפח הסופי של supernatant על ​​מנת לקבוע נפח ארוז גרעיני (PNV).
4. הכנת תמצית הגרעינית
   1. ברגע supernatant הוסר בזהירות, תטווה מחדש את גלולה תמצית גרעינית הגולמי ב25,453 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C באותו הצינור.
   2. הסר את supernatant הנותר (שהוא אמור להיות כמות קטנה של נוזל שקוף) ולהוסיף אותו לאוסף supernatant הקודם. מדוד את הנפח הסופי של supernatant. לחשב את PNV על ידי הפחתת נפח זה מהנפח הכולל של lysate המקורי שצוין קודם לכן. לחלופין, אם גלולה היא גדולה מספיק, הנפח שלה יכול להיות מוערך על ידי השוואה עם נפח דומה של מים בצינור זהה.
   3. הוסף 1 PNV נפח של החיץ C (בערך 1 מיליליטר / מיליליטר של תאים). לעקור בזהירות את הכדור עם קצה פיפטה ולהעביר לתוך כראוי sihomogenizer Zed Dounce. אם משתמש באותו homogenizer כמו קודם, prerinse homogenizer עם מים deionized סטרילי.
   4. Resuspend את הכדור עם ~ 5-10 משיכות באמצעות homogenizer Dounce באמצעות העלי הדוק.
   5. העבר את lysate הגרעיני הומוגני לתוך צינור צונן ומערבבים על ידי היפוך ל30 דקות ב 4 ° C. אם הנפח הוא גדול מספיק, להתסיס באמצעות צלחת ומערבבים מגנטית ובר ספין.
   6. העבר את lysate לתוך צינור צנטריפוגות ultraclear חדש ולהסתובב ב25,453 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. גלולה צריכה להיות קומפקטית. כ -5 דקות לפני הספין היא מוחלטת, מימה קלטות דיאליזה או צינורות שיש לי משקל ראוי מולקולרי מנותק (MWCO) (לדוגמא: 7,000 KDA).
   7. הסר את supernatant (תמצית גרעינית) מהצינור לתוך צינור חרוטי צונן באמצעות פיפטה העברה ולאחר מכן להמשיך עם דיאליזה.
5. דיאליזה
   1. הזרק תמציות לקלטות דיאליזה התייבשות כמו לכל יצרן 'של הוראות וdialyze תמציות הגרעיניות ב500 מיליליטר של הצפת ₅₀ D עבור השעה 1 ב C ° 4 עם ערבוב.
   2. החלף את החיץ עם 500 מיליליטר, D הצפת הטרי קר כקרח ₅₀ וdialyze עבור 4 שעות נוספות ב 4 ° C. שלב 4 שעות זה יכול להיות מפוצל לשני שינויים 2 שעות במקום.
   3. הסר את תמציות מתוך קלטת הדיאליזה ולהעביר לצינורות צוננים. ספין תמציות במשך 5 דקות ב1,500 XG ב 4 ° C.
   4. Aliquot תמציות לתוך צינורות צוננים, Eppendorf ולהצמיד הקפאה בחנקן נוזלי (50-100 μl לaliquot). חנות ב -80 ° C לשימוש עתידי.

3. RNA Probe סינתזה

1. הכנת תבנית
   הערה: תבניות המשמשות לשעתוק יכולות להיות שברים או פלסמידים המכילים T7 או SP6 אמרגן במעלה הזרם, ומייד בסמוך לבדיקת הרצף הרצוי ה-PCR. תבניות פלסמיד חייבת להיות לינארית במורד הזרם של רצף התבנית של interest. שציינו תשואה גבוהה יותר מתבניות ה-PCR.
   1. אמרגן T7/SP6 יכול להיות מוכנס במהלך תגובת PCR. עיצוב פריימר התחושה עם מעלה זרם אמרגן T7/SP6 של רצף היעד.
   2. להגביר את הרצף הרצוי ב2-3 תגובות לתבנית באמצעות PCR לכל ההוראה של היצרן באמצעות פולימראז באיכות גבוהה.
   3. שלב תגובות שווה ערך ולטהר על ידי מיצוי ג'ל.
   4. רצף מוצרי ה-PCR כדי לוודא דיוק תבנית. (אופציונאלי)
2. RNA תמלול עם ³² תיוג P
   1. לבצע בשעתוק במבחנה מ1 מיקרוגרם של תבנית עם ערכה זמינה מסחרי התואמת את האמרגן (SP6 או T7) בשינויים הבאים. השתמש 1 μl של UTP הטרי 3,000 Ci / מילימול ^[α-32 P], 0.5 μl של 10 מ"מ UTP הקר, 0.1 μl של 10 מ"מ GTP, ו0.9 μl של 10 מ"מ m7G (5 ') PPP (5') RNA G כובע בנפח סופי כולל של 20 μl.
      הערה: ה-G-הכובע משפר את היציבות של תעתיקי רנ"א בתמציות גרעיניות (כובע: GTP) 10:01 יחס. UTP הקר מתווסף למניעת ³² P-UTP מלהיות המגיב המגביל.
   2. לסנתז סולם גודל RNA כמשמעות מעל בלי כובע G. תבניות מסחריות זמינות ליצירת סמן גודל RNA.
   3. דגירה תגובות השעתוק על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (לשימוש SP6 40 מעלות צלזיוס). לאחר השלים, לבצע עיכול DNase של התבנית ל15 דקות ב 37 ° C.
   4. בעקבות עיכול, להוסיף 1 μl של 0.5 M EDTA ו5 μl של חיץ הטעינה השני למצעי RNA. הוסף 20 חיץ טעינת μl השני את הסמן.
   5. מחממים את סמן RNA ובדיקות על 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולאחר מכן מניח על קרח.
3. יציקת ג'ל polyacrylamide / בדיקה אלקטרופורזה
   1. הכן 1 ליטר של 6% ג'ל polyacrylamide תמהיל (עמוד) ו400 מיליליטר של עמוד 10%. כדי להפוך 6%, לערבב 150 מיליליטר של 40% 19:01 acrylamide: bis-crylamide עם של 10X טריס / Borate / EDTA (TBE) 100 מיליליטר ו460 אוריאה גרם. להביא עד 800 מיליליטר עם מים deionized סטרילי ומערבבים על פלטה חמה תוך יישום חום נמוך (סביב 50-80 מעלות צלזיוס). השלם ל1 ליטר עם מים deionized.
      הערה: התגובה היא אנדותרמית. חימום מקדם solubilization של האוריאה. מסירים מהאש בהקדם האוריאה מתמוססת ולהביא הפתרון ל1 ליטר עם מים deionized. לחלופין מערבבים בטמפרטורת חדר למשך לילה; חום רב מדי יכול ליזום פילמור.
   2. הגן על תמהיל עמוד מהאור עם רדיד אלומיניום ולאחסן בטמפרטורת חדר. ניתן להכין תערובות עמוד לפני הזמן והם יציבים במשך מספר חודשים.
   3. הכן 400 מיליליטר של 10% תמהיל עמוד על ידי שילוב של 40% acrylamide 19:01 100 מיליליטר: bis-acrylamide, 40 מיליליטר של 10x TBE ו184 אוריאה גרם. לאחר המסת האוריאה, להביא עד 400 מיליליטר עם מים deionized.
      לחלופין, להכין 20% פתרון acrylamide 19:01 ו0% wi פתרון acrylamideחיץ ה ואוריאה בלבד; אלה אז יכולים להיות מעורבים בשיעור כלשהו לתת לכל אחוז בין 0 ל 20%; האוריאה היא תמיד איטית לפזר.
   4. הכן 10-50 מיליליטר של תמיסת 10% persulfate אמוניום (APS) במי deionized סטרילית בהתאם למספר של ג'לים להיות יצוקים.
   5. שטוף 20 סנטימטר x 22 צלחות ג'ל זכוכית סנטימטר עם 70% אתנול (EtOH). יבש עם מגבוני מוך גדולים ללא תשלום.
   6. לשטוף את הצלחת הרגילה עם 1 מיליליטר של 5 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) ולאחר מכן לשטוף מחדש עם EtOH 70%. מעיל צלחת מחורצים עם פתרון siliconizing להדוף ג'ל ידי מנגב את הצלחת עם Kimwipe קטן רווי.
   7. להרכיב את הלוחות על ידי הצבת הצלחת הקבועה על תיבה ריקה פיפטה קצה או חתיכת הקלקר כדי לרומם אותו מהשולחן עם הצד ניקה פונה כלפי מעלה. הנח 0.4 מפרידי מ"מ בקצה של כל צד ארוך.
   8. בזהירות להניח את צלחת מחורצים על מפרידי כך שהצד המצופה יהיה בצד הפנימי של ג'ל. השתמש בסכין גילוח או מכשיר דק אחר כדי להסיט אתמפרידי ליישור סומק בתחתית והצדדים של צלחות ג'ל אז בטוחים עם קליפים קלסר בכל צד של צלחות ג'ל על מפרידי.
   9. הכן 30 מיליליטר של 8% תמהיל עמוד לג'ל על ידי ערבוב 15 מיליליטר של 10% ו -6% מתערבבים כל אחד בצינור 50 מיליליטר. להוסיף במהירות 300 μl של 10% APS ואחריו 30 μl של N, N, N ', N'-טטרה methylethylenediamine (TEMED) ל8% תמהיל ג'ל.
      הערה: אחוזי ג'ל המתאימים לגדלי בדיקה אדם צריכים להיבחר על ידי הנסיין.
   10. השווי ו2x להפוך ולשפוך את הפתרון לאזור המגרעת של צלחות ג'ל. הקפד להעלות מעט הצלחות ביד ולשמור אפילו לשפוך עד שהתערובת מתחילה עמוד לטפטף אל מחוץ לתחתית.
   11. מנמיכים את הצלחות בחזרה לרמה ולהכניס מייד את מסרק מלבן 8 היטב הגדול ל0.4 מ"מ x 20 ג'ל סנטימטר. בועות קטנות בחלקו התחתון לא תשפיע על הריצה, אבל לא צריכה להיות שום בועות בבארות.
       הערה: <מגבות נייר / strong> מקום על השולחן מתחת לחלק התחתון והעליון של ג'ל כדי ללכוד כל דליפות במהלך מזיגה.
   12. לאפשר תמהיל עמוד לפלמר לפחות 30 דקות.
   13. העבר את הג'ל polymerized לחדר הקר ולהרכיב את מנגנון אלקטרופורזה. הוסף חוצץ TBE קר לקווי המילוי בתאים העליונים ותחתונים.
   14. הסר את המסרק ולהשתמש בסכין גילוח כדי להסיר כל פסולת. הגדר את הג'ל במנגנון ושימוש בקליפ קלסר להחזיק את הצלחת לחותם. הוספת TBE הקר לתא העליון עד שהוא זורם לתוך הצלחות.
   15. לשטוף את הבארות עם 30 מיליליטר syringe/21 מחט G 1-1/2 "מלא בTBE הקר רק לפני טעינת מצעי RNA שכותרתו. מניחים צלחת אלומיניום לחלק האחורי של הזכוכית כדי לסייע בחלוקה שווה של חום בזמן הריצה.
   16. טען 3 μl של הסמן וכל תגובת שעתוק 25 μl של כל מצע RNA בבארות נפרדות. השאר גם בין תעתיקים בגודל דומה לעמזיהום צולב Revent. Bromophenol צבעי cyanol הכחולים וקסילן בחיץ הטעינה ניתן להשתמש כדי להעריך הגירת גודל על הג'ל.
   17. הרץ את הג'ל על הספק קבוע מתאים לגודל של בדיקות RNA (למשל 25 ואט לשעה 2 לבדיקות של 600 NT).
4. מיצוי RNA שכותרתו וטיהור
   1. בעקבות אלקטרופורזה, לנקז בזהירות את התא העליון של מנגנון ג'ל. רוב הרדיואקטיביות יהיה בג'ל והתא התחתון; לעומת זאת, החיץ העליון עשוי להכיל כמה חומר רדיואקטיבי.
   2. השתמש במגש כדי להעביר את הג'ל אם עובר לאזור אחר רדיואקטיביים עבודה מהותית. מוציא בזהירות את מפרידי ידי משיכת החתיכה הבולטת לצדדים הרחק מג'ל.
   3. בעדינות להפריד את הצלחות. הג'ל צריך להיצמד לצלחת שלא siliconized. מניחים חתיכת הניילון נצמדת מעל צלחת הג'ל וזכוכית.
   4. הנח glogos autorad מדבקת סמן בעטיפת הפלסטיק על האםשל הג'ל שהוא נקי מכל דגימות.
   5. בחדר חשוך, הנח חתיכת סרט autoradiography על כל הצלחת ולחשוף לדקות לפחות 1. לפתח את הסרט.
   6. מניחים את הסרט שפותח על משטח אור. ומניח את חלק הפלסטיק של ג'ל עם פנים כלפי מטה על הסרט וליישר את סמן autorad מג'ל לסמן נחשף בסרט. מיושר פעם אחת, השתמש בטוש שחור כדי לסמן את המיקום של הלהקות הרצויות על משטח הזכוכית.
      הערה: לחלופין, ליישר ג'לים / סרט באופן הבא כדי לגזור להקות RNA. בחדר החשוך, הנח את ג'ל העטוף על שולחן, הנח את הסרט על גבי זה ולמקם את קלטת (או ספר, וכו ') על גבי חתיכת סרט. פליק על מתג האור בחדר לזמן קצר, ולאחר מכן להפעיל את אם. זה יהיה 'קדם מבזק מבזיק' סרט יצירת קווי המתאר של כל הבארות בסרט בשל הלחץ / ההגנה מפני אור שהקלטת על גבי מספקת. זה עושה את זה קל כדי ליישר את הסרט על הג'ל ולחתוךאת הלהקה ללא שימוש בסמני ניאון.
   7. מוציא בזהירות את הניילון הנצמד ולהשתמש בסכין מנתחים או סכין גילוח טריים עבור כל מצע RNA, ולהסיר את הלהקות מג'ל ומקום לתוך צינורות microfuge נפרדים 1.7 מיליליטר. השתמש nutator להסתה עדינה במהלך elution.
   8. הוסף 500 μl של חיץ elution RNA (אצטט 0.5 M אמוניום, 10 מ"מ MgCl _2, 1 mM EDTA, 0.2% SDS) לצינור אחד. בקצרה צנטריפוגות להטביע את בר ג'ל. דגירה בטמפרטורת חדר בחושך במשך שעות 3-16 תלוי בגודל חללית.
   9. העבר את כל 500 μl חומר eluted לתוך צינור חדש. הימנע מהעברה כל חתיכות ג'ל כפי שהם יפריעו לטיהור. הוסף 1 μl של גליקוגן (20 מ"ג / מיליליטר) יחד עם 500 μl של פנול, כלורופורם קר, חומצי (לRNA).
   10. בקצרה מערבולת, הפתרון צריך להופיע מעונן. ספין בטמפרטורת חדר במהירות שיא (~ XG 16,000) עבור 5-6 דקות.
   11. טרנס בזהירותfer העליון (המימית) שכבה לצינורות חדשים איסוף ככל האפשר, תוך הימנעות מכל פסולת ביניים. מוסיף כמות שווה של כלורופורם לשכבה המימית שהועברה. חזור על שלב 3.4.10 ולהעביר את החלק העליון (מימיים) שכבה לצינור חדש. הוסף 1 מיליליטר של 95-100% קרים כקרח EtOH לחומר שנאסף. לדגור על -80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות הערה:. RNA עשוי להיות מאוחסן לילה אם רוצה.
   12. גלולה RNA ל30 דקות ב 16,000 XG ב 4 ° C. יוצק בזהירות את supernatant לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית ולהוסיף 1 מיליליטר של 70% כיתה מולקולרית קר כקרח EtOH לכל גלולה.
   13. גלולה RNA XG 16,000 ל15 דקות ב 4 ° C, לשפוך את supernatant, ספין שוב דקות 1 ולהסיר כל EtOH שיורי באמצעות פיפטה ומשאיר בטמפרטורת חדר עם כובעים פתוחים על מנת לאפשר לאידוי כל EtOH הנותר.
   14. Resuspend את כדורים ב20-30 μl מים RNase ללא. RNA שכותרת עשויה להיות מאוחסנת ב -80 ° C.
       הערה: יש להשתמש במד סקר רדיואקטיביים לאורך כל הליך המיצוי כדי לוודא שכותרתו RNA לא אבד במהלך כל צעד ושעל.
5. Quantitation של RNA שכותרת לתגובה מראש mRNA 3 'mRNA מחשוף
   1. משוער molarity של מצעי המחשוף באמצעות ההליך הבא.
      1. קח, למשל, μl 1 של 3,000 Ci / מילימול UTP ^[α-32 P] ו10 mCi / מיליליטר. (במועד התייחסות תווית, הריכוז הכימי של פתרון מניות זה יהיה 3.3 UTP מיקרומטר. לפני המועד בו הוא גבוה יותר ואחד מחצית חיים (~ 13 ימים) לאחר התאריך זה ~ 1.6 מ"מ, וכו ') שכותרתו תרומת UTP לריכוז התגובה הסופית היא בדרך כלל זניחה כאשר ריכוז UTP הקר סופי מעל _{מ 'UTP} K משמש. _מ T7 RNAP K לUTP הוא 114 מ"מ ^15.
      2. לדלל את μl 1 ב39 μl מים. לאחר מכן להוסיף 1 μl של [המדולל α- ^{32 P] UTP לנפח מתאים של נוזל נצנץ בבקבוקון נצנץ. (הערה: נצנץ נוזל לא נדרש בפועל לפעילות הספציפית הזה של 32 P כספירת Cerenkov תיתן ערכי העתקים לאמינים מדי בדוק את המדריך למונה הנצנץ לבחור את הערוץ הנכון לספירת Cerenkov ולספור 1 מיליליטר נפח 1 דקות.).}
   2. לדלל 1 μl של כל מצע RNA שכותרתו לתוך צלוחיות נפרדות עם כמות שווה של נוזל נצנץ משמש בשלב הקודם. ודא שיש בקבוקון עם נוזל נצנץ רק לחשב רקע. לכמת רדיואקטיביות במונה נצנץ.
   3. הכפל את הספירה לדקה (CPM) למדגם UTP ^[α-32 P] על ידי 40 גורם בדילול הראשוני ולחסר הרקע מתקבל על ידי נוזל הנצנץ לבד. הכפל את הספירה עבור כל בדיקה RNA על ידי כמות המים RNase חינם (20-30 μl) המשמש לresuspend RNבדיקות. זה נותן את העתקים הכולל של RNA המטוהרים.
      לדוגמא:. העתקים למקסימום = (CPM ^[α-32 P] UTP - רקע) x 40 דוגמא RNA שכותרת 1 = 20,000 עותקים לדקה x 20 = 400,000 עותקים לדקה (אם 20 μl משמש לresuspension)
   4. אם סכום שאינו 1 μl של UTP ^[α-32 P] שימש כדי להפוך את התמלילים, ולאחר מכן גורם לכרך זה לדקה האחרונה של UTP ^[α-32 P] על ידי הכפלת עותקים לדקה ל[ P ^α-32] מדגם UTP לפי כמות שימוש.
      לדוגמא: 2 μl של UTP ^[α-32 P] משמשת כדי להפוך את התמלילים. עותקים לדקה מחושבת ל1 μl UTP ^[α-32 P] הוא 500,000 עותקים לדקה. הכפל 500,000 * 2 = 1,000,000 עותקים לדקה
   5. לחלק את עותקים לדקה מחושבת RNA שכותרתו על ידי העתקים שמחושבים לUTP ^[α-32 P] לבד. זה פחות או יותר יהיה להעריך את אחוז UTP שכותרתו המשולב.
      דוגמא: 400,000 / 1,000,000 = 0.40 או 40%התאגד
   6. מאז אנזים אינו יכול להבחין בין איזוטופים, אחוז זהה של UTP המסומן וללא תווית הוא שולב RNA במהלך שעתוק. לחשב את כמות UTP הקר בשומות שמתווספת לתגובת השעתוק (0.5 μl של פתרון 10 מ"מ = 5.0 x 10 ^-9 שומות של UTP).
   7. הכפל את UTP השומות בתגובה על ידי אחוזים המשולבים (המכונים מUTP החם לספור לעיל), ולאחר מכן לחלק את זה על ידי מספר uridines ברצף RNA.
      לדוגמא: 5.0 x 10 ^-9 שומות של UTP x 0.40 = UTP 2 x 10 ^-9 שומות
      UTP 2 x 10 ^-9 שומות / 73 U לתמליל = 2.7 x 10 ^-11 שומות של RNA
   8. המרת שומות של RNA לmolarity על ידי חלוקת הנפח של פתרון resuspension RNA התאושש.
      לדוגמא: 2.7 x 10 ^-11 שומות של RNA / 20 μl = 1,370 RNA ננומטר. לתמלילי T7 RNAP עשויים מעל 1 מיקרוגרם ליניאריized פלסמיד וresuspended ב20 מים μl, ערכים של 200 עד 1,400 ננומטר הם טיפוסיים.
      הערה: הריכוז טוחנת של RNA משמש כדי להבטיח שריכוז המצע מראש mRNA הסופי בתגובת מחשוף במבחנה הוא פחות מ -5 ננומטר לכל תגובת מחשוף. יעילות מחשוף יכולה להקטין אם את ריכוז RNA הוא העלה באופן משמעותי מעל 5 ננומטר.

4. 3 תגובת mRNA המחשוף '

1. תגובת מחשוף מגיב הכנה
   1. הכן את כל חומרים כימיים הדרושים לתגובת המחשוף. הפוך 10% אלכוהול פוליוויניל (PVA) על ידי מים רותחים ולהוסיף את הכמות הנכונה של אבקת PVA לאט. PVA 10% יהיה צמיג ולוקח זמן להתמוסס. אחסן בטמפרטורת חדר או -20 ° C.
   2. הכן פוספט 1 M קריאטין (CP) ולאחסן ב -80 ° C. חשוב להשתמש CP M 1 שהוא בן פחות מ -4 חודשים.
   3. הכן 1 M DTT וחנותב -20 ° C. הפוך דילול M DTT טרי 0.2 מM DTT 1 רק לפני ביצוע תגובת המחשוף.
   4. הכן ETS (פתרון מחשוף להפסיק): 10 מ"מ טריס pH 7.8, 10 mM EDTA, 0.5% SDS. לאחסן בטמפרטורת חדר.
2. תגובת מחשוף
   1. מחממים את RNA שכותרת 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואז למקם על קרח.
   2. בעדינות מערבולת ולאחר מכן לסובב את PVA 10% במהירות השיא ל2-3 דקות כדי להסיר בועות.
   3. מיקס מאסטר 1: לתגובה אחת, לשלב 3.125 μl PVA 10%, 0.625 μl CP M 1, 0.25 μl 0.5 M tRNA, 0.125 μl 100 מ"מ dATP, 0.13 μl 40 U / מעכב RNase μl, 0.25 μl 0.1 M-pH EDTA 8 , 0.1 μl 0.2 M-DTT, ו0.645 מים RNase ללא μl. לוותר 5.25 תמהיל μl אמן 1 לכל צינור על קרח.
   4. מיקס מאסטר 2: השתמש 6.25 μl / תגובה של תמציות גרעיניות בריכוזים גבוהים יותר מ 2 מ"ג / מיליליטר. תמציות גרעיניות עשויות להיות מדוללים בהצפה ₅₀ D אם ביתטוליפ אין.
   5. מערבבים את 6.25 μl של תמצית גרעינית עם העבר חילק 5.25 μl של מיקס מאסטר 1. הוסף 1 μl של מצע RNA שכותרתו כי הוא מדולל ל50 ננומטר. לחלופין, RNA עשוי להיכלל בתמהיל מאסטר 1 בלבד שהוא הוסיף לאחר מעכב RNase, DTT וtRNA הערה:. השימוש <ננומטר 5 של מצע RNA שכותרתו.
   6. בעדינות מערבולת וסחרור מהיר מדגם זה כדי להסיר בועות. דגירה ב30 מעלות צלזיוס עד לשעה 2, אבל כמובן שזמן צריך להתבצע לתוצאות אופטימליות. incubations יותר עשוי להגביר השפלה רקע.
3. Proteinase K עיכול וטיהור
   1. הסר את הדגימות מהאש ומוסיף 182.5 μl של ETS להפסיק פתרון לכל תגובה. הוסף 5 μl של 20 מ"ג / מיליליטר proteinase K ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. חלץ את הרנ"א על ידי הוספת נפח 1 (200 μl) של פנול, כלורופורם חומצה, 1/10 ^ה נפח (20 μl) של 3 מ 'נתרןאצטט, ו1 μl של 20 גליקוגן מ"ג / מיליליטר. להמשיך עם עקירות, כמתואר בסעיפים 3.4.9-3.4.14.
   3. לאחר מיצוי RNA הושלם, הקפד להסיר את כל EtOH שיורית. Resuspend את הכדור ב 8 μl של חיץ טעינה (פוראמיד 90%, 10 mM EDTA, עם bromophenol הכחול (BFB) (וקסילן או Cyanol כחול)). דוגמאות ניתן לאחסן ב -80 ° C או להמשיך עם ג'ל אלקטרופורזה.
4. אלקטרופורזה תגובת מחשוף
   1. הכן ג'ל acrylamide 6% כאמור בסעיפים 3.3.1-3.3.17 עם כמה שינויים. השתמש 20 סנטימטר x 42 צלחות ג'ל רצף סנטימטר עם 2 קליפים קלסר בכל צד ארוך. להשתמש במסרק 32 היטב ולהכין 40 מיליליטר של תערובת ג'ל.
   2. טען את הג'ל עם 3 μl של סמן ו5 μl של כל דגימה. למטב את הגדרות אלקטרופורזה לפי גדלים מראש מחשוף ומוצר ביקע.
   3. כאשר אלקטרופורזה תושלם, בצע את הסעיפים 3.4.1-3.4.3 </ Strong> לפרק את הג'ל. במקום ניילון נצמד, לחתוך פיסת נייר סינון לגודל של צלחת הג'ל ובזהירות למקם אותו בצד אחד של ג'ל החשוף.
   4. לחץ על נייר הסינון בחוזקה על ג'ל, ואז להפוך על הצלחת כדי שנייר המסנן נמצא בתחתית והזכוכית היא על העליונה. לחץ בחוזקה את הכוס על השולחן, כדי להבטיח שהג'ל הוא לופת את נייר הסינון באופן שווה.
   5. לאט לאט לקלף את נייר הסינון, שאמורה לקבל את הג'ל קשור אליו, מאחד הקצוות קצרים עד שכל נייר הסינון עם ג'ל המצורף הוא להסיר את צלחת הזכוכית.
   6. כסה את צד הג'ל נחשף בניילון הנצמד. תדביק את הניילון הנצמד לנייר הסינון.
   7. מניחים את הג'ל על מייבש ג'ל עם צד המסנן מול צד הוואקום. יבש במשך 15 דקות או עד ג'ל הוא יבש לחלוטין.
      הערה: אם מייבש ג'ל אינו זמין, סרט X-ray ניתן להשתמש כדי להמחיש את להקות RNA. חשיפה צריכה להתבצע בניהול תאורהקלטת לא חזק עם מסך החרפה ב -80 ° C. זמן חשיפה נקבע באופן אמפירי. זהירות: ג'לי acrylamide אחוזים נמוך עלול להיסדק על הקפאה.
   8. ג'ל עשוי כעת לשמש כדי לחשוף את הסרט או להשתמש בו עם phospho-תרמי. זמן חשיפה תלוי בכוחו של RNA שכותרתו. בתחילה חשיפה 24 שעות ניתן להשתמש. אם אתם משתמשים בסרט, חושף ב-80 ° C עם מסך התעצמות ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני הפיתוח.
   9. למדוד את היחס בין RNA ביקע ובלתי ביקע בכל דגימה לכמת את יעילות מחשוף.

Results

תוצאות נציג של assay מחשוף של פולי RNA () אתרים של HIV-1 (איור 2). אנחנו יכולים לראות את מצע RNA uncleaved, המהווה את הלהקה הנודדת האיטית ביותר בחלק העליון של הג'ל. המוצר ביקע הספציפי הוא להקת שבר קצרה יותר האינטנסיבית ביותר שפועלת מהר יותר בג'ל בגודל הצפוי, ודווקא נעדר מassay המחשוף של mutpoly () שליטה המכיל מוטציה נקודתית ברצף הפולה RNA (mutPolyA) מצע. מוצרים פגומים של מצע הקלט עשויים לעתים להיות שנצפו. כימות של פעילות המחשוף עשויה להיקבע על ידי עלילת densitomet...

Discussion

התגובה במבחנה 'מראש mRNA 3 מחשוף, שבוצעה בתמציות גרעיניות תא הלה או עם גורמי מחשוף מופרדים מתמציות אלה, אפשרה זיהוי של גורמי מחשוף הליבה והמכלולים העיקריים שלהם ^16-21. לאחרונה חלבונים רבים יותר הקשורות לגורמים אלה זוהו ^22, והתגובה במבחנה יכולה להמשיך ולשפוך אור על כמה חלבונים אלה תורמים לתגובה. אולי בגלל התגובה in vivo נראית ²³ cotranscriptional, או משום שכמה גורמים תורמים עלולים ללכת לאיבוד בעת חילוץ ודיאליזה, היעילו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
בקבוק Celstir 1 L	Wheaton	356884	גדלים שונים זמינים
4 מצבים מערבל במהירות איטית	VWR	12621-076
צנטריפוגה דלי מתנדנדת	בקמן קולטר		אלגרה x-15R עם SX4500 רוטור
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר		אופטימה L-100 XP Ultra עם SW41 רוטור
צנטריפוגה שולחנית 5417R	אינקובטור
		430776
	50 מ"ל צינורות צנטריפוגה	Falcon
Ultraclear	בקמן קולטר	344059
JOKLIK שונה MEM	Lonza	04-719Q
סרום בקר עוברי	Atlas	F-0500-A	מומת בחום
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
מגנזיום כלוריד	פישר	BP214-500
אשלגן כלורי	MP ביו-רפואי	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
גליצרול	פישר	BP229-4
5 M תמיסת נתרן כלורי	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0.5 M תמיסת	Sigma-Aldrich	E7889-100 מ"ל
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
אמוניום גופרתי	פישר	A702-500
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA רוש		04 693 132 001
ערכת קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66372	MWCO 7,000 0.5 מ"ל-3 מ"
ל 15 מ"ל סט מטחנת רקמות Dounce	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	גדלים שונים זמינים
הרחב ערכת PCR בנאמנות גבוהה	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM כל נוקלאוטיד
ערכת MaxiScript SP6/T7	אמביון	AM1322
m7G(5')ppp(5') G כובע RNA	ניו אינגלנד Biolabs	S1404S
תבנית סמן המאה בתוספת	אמביון	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μ Ci	Perkin Elmer	BLU507H250UC
מאגר טעינת ג'ל II	אמביון	8546G
DEPC מים מטופלים	אמביון	AM9906
10x TAE	פישר	BP13354
10x TBE	אמרסקו מדעי החיים	0658-4L
10x PBS	פישר	BP399-20
אוריאה	פישר	BP169-212
אמוניום פרסולפט	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
אמוניום אצטט	פישר	A637-500
40% 19:1 אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד	Bio-Rad	161-0144
גליקוגן	רוש	10 901 393 001
100% אתנול מוחלט 200 הוכחה	Acros	61509-0040
פנול חומצה: כלורופורם	אמביון	9720	לנוזל
זינוק	פישר	SX18-4
מעכב Rnase	Promega	N261B
אלכוהול פוליוויניל- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
קריאטין פוספט	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
יחידת רצף מתכווננת	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
קליפס קלסר	Office Depot	838-056
20 ס"מ x 42 ס"מ לוחות זכוכית	Sigma-Aldrich	Z352543	1 סט
לוחות זכוכית 20 ס"מ x 22 ס"מ	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 סט
20 ס"מ x 42 ס"מ לוחות קירור אלומיניום	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
0.4 מ"מ x 22 ס"מ מרווחים	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
מרווחים 0.4 מ"מ x 42 ס"מ	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
מסרק 8 בארות	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
מסרק 16 בארות	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
32 בארות מסרק	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
ציפוי דוחה ג'ל	C.B.S. Scientific	SGR-0401	או SGR-0101 לבקבוק בודד
טיפים לטעינת ג'ל	Rainin	GT-10-4	0.1-10 μ l
רצף PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5,000 V/500 mA/400 W
מייבש ג'ל דגם 583	Bio-Rad	דגם 583
משאבת ואקום הידרוטק למייבש ג'ל	Bio-Rad
Glogos II סמני זוהר בחושך	420201		אג'ילנט
8 x 10	סרט Midsci	BX810
14 x 17	Phoenix	F-BX1417
קלטת Autoradiography פישר		FBCA 1417	8 x 10 גודל זמין