מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

סיכום

אנו מתארים שיטה למיפוי תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). אנו מתמקדים כיצד לתעד שינויים מכניים המתרחשים בדפנות התא במהלך התפתחות הצמח בקנה מידה בינוני בשדה רחב, מה שמאפשר לתאם את השינויים האלה עם גדילה ומורפוגנזה.

תקציר

אנו מתארים שיטה שפותחה לאחרונה למדידת תכונות מכאניות של פני השטח של רקמות צמח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מיקרו / ננו חריצים, לAFM JPK. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה אנו מודדים את מודול יאנג לכאורה של קירות תא ברזולוציות subcellular על פני אזורים של עד 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר בmeristems הפרחוני, hypocotyls, ושורשים. זה דורש הכנה מדוקדקת של המדגם, הבחירה הנכונה של מיקרו indenters ועומק כניסה. כדי להסביר את דופן תא אך ורק נכסים, מדידות מתבצעות בתמיסות מרוכזות מאוד של מניטול כדי plasmolyze תאים ובכך להסיר את תרומתו של לחץ turgor התא.

בניגוד לטכניקות קיימות אחרות, באמצעות indenters שונה ועומקי כניסה, שיטה זו מאפשרת מדידות multiscale בו זמנית, עם זאת, מספר מגבלות יישארו: השיטה יכולה לשמש רק על דגימות קטנות למדי (כ -100 מיקרומטר קוטר) ורק ברקמות חיצוניות; השיטה היא רגישה לטופוגרפית רקמות; הוא מודד רק היבטים מסוימים של תכונות מכאניות המורכבת של הרקמות. הטכניקה מפותחת במהירות וסביר להניח כי רוב המגבלות האלה ייפתרו בעתיד הקרוב.

מבוא

צמיחה בצמחים מושגת על ידי ההרחבה מתואמת של קירות תא הנוקשה המקיפים כל תא ותא של האורגניזם. צבירת ראיות מצביעה על כך שזאת היא באמצעות השינוי של דופן תא כימיה שצמחים מקומיים לשלוט התרחבות זו. הוא חשב ההתרחבות שמונעת בעיקר על ידי לחץ על דפנות תאים, הנגרמות על ידי לחץ turgor הגבוה של התא; תגובת זן זה ללחץ turgor נשלטת על ידי התכונות מכאניות של קירות תא ^1. מעט ידוע על התכונות מכאניות הללו וכיצד הם משתנים במהלך התפתחות. יתר על כן מעט מאוד ידוע על איך התכונות מכאניות האלה נשלטות והאם פידבקים לתרום לשנות דופן תא כימיה באופן שמתואם, ככל הנראה, על פני רקמה. אם אנו רוצים להבין את הקשר בין שינויים כימיים ומכאניים בקירות תא צמח במהלך פיתוח, וסופו של דבר איך האינטראקציות מיקרוסקופיות האלה למשול צמחצמיחה מקרוסקופית של, שיטה שיכולה לפקח על תכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בקנה המידה התאי או רקמות נדרשת.

שיטת מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) שתוארה כאן, המבוססת על לחיצות רקמת מיקרומטר או ננומטר או חריצים, פותח בדיוק כדי למדוד את התכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בו זמנית ברזולוציות subcellular ועל פני אזורים שלמים של רקמות. יש שיטות אחרות או ברזולוציה שהיא נמוך מדי או גבוהה מדי: extensometer היא רק מסוגלת למדוד את התכונות מכאניות הממוצעת של כל רקמה בקנה מידת מילימטר ^2-4, בקנה מידה שהיא למשל גדול מדי כדי למדוד את האירועים בתחילת organogenesis; microindenter יכול לקחת מדידות ברזולוציה subcellular בקנה המידה ננומטרי, אבל זה מוגבל למדידת תאים מבודדים ולא קבוצות של תאים או איברים ^5-7. עם AFM, דורשרקמת ד, סלולרית, והחלטות subcellular יכולים להיות מושגת על ^8-10. לאחרונה כמה פרוטוקולים פותחו במיוחד כדי למדוד את המכניקה של רקמות צמחים שיכולים לשמש גם ^{11, 12.}

אנו נציג כאן כיצד להעריך את האלסטיות של הרקמות באמצעות מדידה של מודול יאנג לכאורה ^13.

מודול יאנג משמש בדרך כלל כדי לתאר את הקשיחות של חומר. במהלך עיוות קטנה את הכוח הדרוש כדי לעוות חומר הוא יחסי לאזור של כניסה. מודול יאנג הוא מקדם זה. במקרה של חומר הומוגני רציף אותו מקדם יימדד ללא קשר לסוג הכניסה (גודל וצורה), אבל ישתנה עם המהירות של המדידה. במקרה של המבנה המורכב של רקמת צמחים, ראה עד כה כי הכוח הוא פרופורציונאלי לעיוות המאפשרת הקביעהמקדם של מידתיות שאנחנו שם "מודול הצעיר לכאורה". בניגוד לכך מבמדיות מתמשכת בצמחים, מודול הצעיר לכאורה זו הוא רגיש לגודל של הכניסה. זה לא מתאימות לmoduli הצעיר של דופן תא טהורה. זה הכי טוב מתאר את האלסטיות של הפיגומים של תא הקיר של הרקמה.

פרוטוקול

1. הכן זכוכית שקופיות להרכבה לדוגמא

1. הכן imbedding תקשורת agarose: 0.7% agarose התכה הנמוך במניטול 10% (במים).
2. באמצעות מכשיר מתכת חזק (טיפ לדוגמא: תרגיל, סיד), לחרוט את אזור סנטימטר 0.5 x 0.5 במרכז שקופית זכוכית מיקרוסקופית. או במקום, להדביק חתיכה קטנה של lamella זכוכית (כ -20 x 200 מיקרומטר) לשקופית הזכוכית באמצעות דבק Araldite. הערה: זה לחספוס פני השטח על מנת להקל את ההדבקה של agarose כדי להבטיח כי מקלות agarose תקשורת או תיקונים לשקופית. ניתן לעשות שימוש חוזר שקופית זו.
3. מקם טיפה של כ -20 μl של imbedding תקשורת agarose על האזור הצרוב של שקופית הזכוכית. זה נותן שכבה דקה של agarose.
4. אחסן את שקופיות הזכוכית בקופסא לחה ולחכות לתקשורת agarose כדי לחזק.

2. ביתור והרכבת דוגמאות meristem

1. meristems Microdissect לImagi confocalng: להסיר את ניצני פרחים אחד אחד מהגזע על ידי משיכת אותם עם פינצטה העדינה במיוחד. חשוב להסיר את כל ניצני הפרחים עד הניצנים שאינו מציגים עלי גביע (כלומר primordia P1 ^14).
2. באמצעות סכין גילוח או הקצה של פינצטה, חתך את meristem מהגזע. החתך צריך להיות מקביל לאזור של פני השטח meristem שיימדד עם AFM. השיא שהושג צריך להיות בין 300 מיקרומטר ומיקרומטר 600 גבוה להתאים מתחת לקצה AFM.
3. דחוף את הקודקוד לסרט של מדיה agarose מוכנה בשלב 1.1.4. בחר מיקום בשקופית זכוכית / agarose ולדחוף בעדינות כך שmeristem הוא גם ישירות במגע עם שקופיות הזכוכית ובולט החוצה מן agarose. זה חיוני כדי למקם את meristem בagarose בתוך כמה שניות שאחרי החתך שלה מהגזע. הערה: זו על מנת למנוע meristem מייבוש. בשלב זה, meristem יעמוד בCRACk כי agarose שבר על הפעלת לחץ.
4. הכן כמה meristems דרך זו להדמיה אצווה, ובלבד שהם באותו הגובה וממוקמים פחות מ -500 מיקרומטר זה מזה בשקופית. שמור meristems הכין בתיבה הלחה בזמן לנתח דגימות נוספות.
   הערה: הוא מגביל את הווריאציה המגיעה מהכיול. באופן אידיאלי 2 דוגמאות של כל תנאי יכולה להיות מוכנות ונמדדו באופן אקראי. עד כה אין השפעה נצפית של הדמיה אצווה על המדידה (תגובת לחץ מושרה). זה יכול להיות הודות לדילול של מולקולות איתות מתח באגר ו / או הפתרון הגובר. לחלופין תגובת הלחץ היא זהה, ללא קשר לכמות המדגם מוכן.
5. לפני שעברתי לשלב הבא, ודא שהגבול בין meristem וניצני פרחים יבש. אם לא, להסיר בעדינות את המים העודפים באמצעות נייר סינון. זה צריך למנוע בשלב הבא שנמסagarose מציף המדגם בשל כוחות נימיות.
6. עם טפטפת 20 μl, להוסיף מספיק נמס ההרכבה agarose כדי למלא את הסדק שנוצר בשלב 1.2.3. ולהקיף את כל meristem. Agarose צריך להגיע לרמה של הצלקת של הניצן שהוסר הפרח (primordium). כדי להשיג זאת, ייתכן שיהיה צורך להוסיף agarose בכל קצה של הסדק.
7. כאשר agarose הוא הוסיף, זה יציף במהירות לתוך הסדק; באמצעות פיפטה, למצוץ את חלק מומס ההרכבה agarose כדי להבטיח שmeristem הוא הנקודה הגבוהה ביותר בשקופית. זה מתקן את meristem כך שהוא לא יכול לזוז במהלך הדמיה.

3. דוגמאות שורש או hypocotyl הרכבה

1. לשורשים וhypocotyls, לא לנתיחה היא הכרחית. בשכבה הדקה של agarose בשקופית הזכוכית מוכנה, לעשות חריץ באופן ישיר מעל לחרוט בזכוכית או יחד lamella זכוכית. מקם את השורש או hypocotyl בחריץ זה להבטיח כי היא נמצאת בקשר עםזכוכית לכל אורכו.
2. לפני שעברתי לשלב הבא, לוודא כי המדגם הוא יבש על פני השטח שלה. אם לא, בעדינות להסיר את עודפי מים באמצעות נייר סינון.
3. הוספה נמס הרכבה agarose סביב המדגם כמו בשלב 1.2.6.

4. AFM הכנה ורגישות כיול (לJPK Nanowizard AFM)

1. הר שלוחה על AFM. שלוחה צריכה להיות מותקנת עם indenter בצורה עגולה. הרדיוס יקבע את x, y, z ברזולוציה ועומק הכניסה שבמדידה מדויקת יכולה להיות בארכיון.
   1. לקחת מידות טווינה-ננו על פני השטח של האפידרמיס, השתמש indenter עגול 50 רדיוס ננומטר; לקחת מידות mesoscale, השתמש indenter עגול מיקרומטר רדיוס 0.5; לקחת מידות microscale (מול 2-3 תאים), השתמש indenter עגול 2.5 מיקרומטר רדיוס.
2. מקם את הלייזר בקצה שלוחה. יישר את הלייזר לאמצעשל השובה באמצעות המראה.
3. מקם כוס נקייה מתחת AFM.
   הערה: את הפעולות הבאות מוגדרת להפוך את האות של עמדת הלייזר על קולט AFM לעיוות של שלוחה, ועל ידי הערכת קבוע הקפיץ של שלוחה, לתרגם אותה לכוח.
4. גישה עם "נקודה להגדיר" כוח היעד של V. 1
5. בחר "ספקטרוסקופיה כוח". האם כניסה על ידי קביעת "הנקודה להגדיר יחסי" המקסימלי ל2 V, "להרחיב את המהירות" ל40 מיקרומטר / שנייה, ואת "אורך z" עד 5 מיקרומטר.
6. מתפריט "כיול מנהל", בחר את החלק הליניארי של העקומה קדימה כדי להתאים את הרגישות באמצעות הכפתור "בחר טווח בכושר". "הנקודה להגדיר יחסי" צריכה להפוך מ" וולט "ל" מטר ".
7. מתפריט "מנהל כיול", בחר "קבוע קפיץ" כדי להעריך את אלasticity של שלוחה באמצעות תנודות תרמיות. לחץ על "הפעל" כדי להשיג את עלילת הצפיפות ספקטרלית של שלוחה. מצא את שיא התהודה עם התדר הנמוך ביותר. להתאים אותו באמצעות הכפתור "בחר טווח בכושר".
   הערה 1: לפרטים נוספים על כוונון תנודות תרמיות, לקרוא קוק ואח' ^15.
   הערה 2: עדיף להשתמש בשיטה ישירה כדי להעריך את האלסטיות של שלוחה באמצעות שלוחה התייחסות (או חומר עם קשיחות ידועה). אחד משמש כאן נתרם באדיבות על ידי עאטף Asnacios ^16.
8. הוסף 200 μl של 10% פתרון מניטול תחת קצה שלוחה. ליישר מחדש את הלייזר לאמצע השובה באמצעות המראה.
9. לכייל מחדש את הרגישות: מתפריט "כיול מנהל", לחץ על הכפתור "לא ידוע"; חזור על שלבים 2.3 דרך ל2.5.

. 5 קליטים נתונים: מודול מיפוי של יאנג לכאורה

1. מקם את הדגימות הרכובים תחת AFM ולהוסיף טיפת 500 μl של 10% פתרון מניטול על המדגם. פתרון מניטול plasmolyzes התאים בתוך דקות.
2. גישה עם כוח יעד ("להגדיר נקודה") של 20 ננ ("נקודה מוגדרת" לא צריכה להיות יותר מ 3 V)
3. כניסה עם "נקודת מערכת יחסי" של 200 NN, "להרחיב את המהירות" של 40 מיקרומטר / sec, ו" אורך z "של 5 מיקרומטר.
4. התאם את "נקודה להגדיר יחסי" על מנת לקבל כניסה של 100 ננומטר ל200 ננומטר רכובים שלוחה או 0.5 מיקרומטר לשלוחה רכוב 1 מיקרומטר / 5 מיקרומטר.
5. במצב "כוח מיפוי", בחר אזור לסריקה: לmeristems, 70 מיקרומטר x מיקרומטר 70 עם רזולוציה ("פיקסלים") של 64 x 64; לhypocotyls ושורשים, עם רזולוציה של 64 x 64 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר.
6. העיתונות לסרוק להשיק את הניסויים. שמור את הפלט.

. 6 ניתוח נתונים: חישובי מודול יאנג לכאורה

1. פתח את קובץ הנתונים בתוכנה לניתוח נתונים.
2. בחר "עיבוד אצווה" כדי להחיל את אותו ניתוח לכל העקומות של מפה אחת.
3. בחר באפשרות "לתקן את הגובה עבור הכיפוף של שלוחה" כך כדי לחלץ את עומק הכניסה.
4. בחר "הפונקציה של יאנג מודולוס כושר" שתניח הכוח הוא פרופורציונאלי לאזור של כניסה. הגדר את "צורת הקצה" לParabolic להניח שצורת הכניסה היא parabolic.
5. ציין את הרדיוס של הקצה.
6. בחר מעדיף את העקומה "לסגת" לניתוח משום שהוא פחות רגיש לטופוגרפיה מאשר עקום "להאריך". עם זאת, אם יש דבק משמעותי של החללית במהלך "לסגת", להשתמש בעקומה "להאריך", שאינה רגיש לדבק.
7. ערכהיחס פואסון ל0.5. לחץ על לנתח ולשמור את הפלט.

תוצאות

באיור 1 אנו מציגים מפות טיפוסיות יאנג moduli של meristems הפרחוני (איורים 1 א ו-1B) hypocotyls, צעיר ומבוגרת (דמויות 1C-F), וmeristem שורש (איור 1G ו1H). בכל הניסויים indenter הוא חצי כדור, אבל הרדיוס שלו שונה, כך שיכולות להיות מושגת על החלטות מרחביות שונות דמויות 1C ו1D להראות תוצאות אופייניות לindenters טווינה-ננומטרי (50 רדיוס ננומטר) עם חריצים טווינה-ננומטרי (ננומטר 50 עומק).; . Cartographs לח...

דיון

בצמחים, תכונות מכאניות משתנות לשחק תפקיד מרכזי בהכוונת צמיחה והמורפוגנזה. נכון להיום חלה התקדמות רבה בהתרת הרשתות הגנטיות וכימיות השולטות בגידול צמחים, אבל הידע של איך רשתות אלה תורמות ל, ומושפע משינויים בתכונות מכאניות שלנו הוא מתוצרת מקומית. שיטה זו אמורה לאפשר לנו למלא את הפער הזה, וכך זה צריך להיות אינטרס חזק למדענים ללמוד כל היבט של גידול צמחים או המורפוגנזה. כעת אנו מסכמים את האתגרים ומגבלות של השיטה, והתחזית לעתיד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AFM	JPK	NanoWizard	כל הדור השלישי מסוגל לעשות את העבודה באותה העדפה.
שלב AFM	JPK	CellHesion	נדרש לדגימה עם טופוגרפיה נמוכה (פחות מ-11 ומיקרו; m בין הנקודה הנמוכה ביותר לגבוהה ביותר באזור סריקת הכוח).
אופטיקה של AFM אופטיקה	JPK	Top View	חשוב מאוד על מנת למקם את המדגם. ניתן להחליף במשקפת ארוכת טווח או במיקרוסקופ.
מיקרוסקופ סטריאו	Leica	M125	כל סוג של מיקרוסקופ סטריאו יכול לעשות.
שלוחה רכובה 150 ננומטר	ננו-חיישנים Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 נוישאטל, שוויץ	R150-NCL-10	כדי למדוד רק את דופן התא על פני האפידרמיס השתמש.
1 ומיקרו; m רכוב שלוחה	ננו-חיישנים Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 נוישאטל, שוויץ	SD-Sphere-NCH-S-10	למדידת המכניקה של דופן התא אורתוגונלית לפני השטח של האפידרמיס.
שלוחה ללא קצה	ננו-חיישנים Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 נוישאטל, שוויץ	TL-NCH-20	כדי למדוד את המכניקה המקומית של הרקמה (רוחב 2-3 תאים) השתמש ב-5 ומיקרו; שלוחה רכובה מ '. חיברנו 5 ומיקרו; m חרוז בורוסיליקט לשלוחה חסרת קצה.
5 ומיקרו; m מיקרוספירות סיליקון	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, צרפת		Araldite לקיבוע החרוז לשלוחה חסרת הקצה.
פישר נמסה	, ניו ג'רזי 07410	BP160-100	34-45 & #176; טמפרטורת ג'לציה
C D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, סנט לואיס, MO 63103 ארה"ב	M4125-500G
2 נירוסטה מס' 5 פינצטה	Ideal-Tek 6828 Balerna, שוויץ