Nanopodia ערוצי קרום דקים אך שבירים שמרחיבים עד 100 מיקרומטר מהאחורי המוביל קדמי או נגרר של תא ולחוש את הסביבה הסלולרית. קיבעון ישיר על 37 ° C, כביסה עדינה, והימנעות מממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון ושל X-100 ריכוזי טריטון גבוהים יותר נדרש כדי לבחון מבנים הסלולר אלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Nanopodia - תחזיות דקה, שבירה ממברנה עם תפקידים בתנועת תא ואינטראקציות בין תאית
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים חסיד בתרבות לשמור על מדינה מקוטבת כדי לתמוך בתנועה ויחסי גומלין בין תאית. Nanopodia דק, מוארך, במידה רבה, ה-F-אקטין שלילי תחזיות קרום בתאי האנדותל והסרטן שניתן דמיינו באמצעות TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) מכתים immunofluorescence. אשכולות TM4SF1 בקוטר 100-300 מיקרומטר TMED (ה TM 4SF1 nriched omains ד מיקרו) המכילה 3 עד כמה ש14 TM4SF1 מולקולות בודדות. TMED מסודר לסירוגין לאורך nanopodia במרווח קבוע של 1 עד 3 TMED למ μ ותקיפות לעגן nanopodia למטריקס. זה מאפשר nanopodia להאריך יותר מ -100 μ מ 'מהחלק האחורי המוביל קדמי או נגרר של תאי האנדותל או גידול מקוטבים, וגורם לשאריות קרום להישאר מאחור בmatrix כאשר התא עובר משם. TMED וnanopodia כבר התעלמו בגלל השבריריות הקיצוניות שלהם והרגישות לטמפרטורה. שטיפה וקיבוע שיגרתי לשבש את המבנה. Nanopodia נשמרים על ידי קיבוע ישיר בparaformaldehyde (PFA) ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריה חשיפה קצרה ל0.01% טריטון X-100 לפני הצביעה. Nanopodia לפתוח אופקים חדשים בביולוגיה של תא: הם מבטיחים לעצב מחדש את ההבנה של איך תאים לחוש את סביבתם שלנו, לאתר ולזהות תאים אחרים במרחק, ליזום אינטראקציות בין תאית במגע קרוב, ושל מנגנוני האיתות מעורבים בתנועה, שגשוג, ותא תאי תקשורת. השיטות שפתחו ללימוד nanopodia נגזר TM4SF1 עשויות להיות שימושיות עבור מחקרים של nanopodia היוצרים בסוגי תאים אחרים דרך הסוכנות של tetraspanins הקלאסי, בעיקר CD9 הביע כל מקום בגוף, CD81, וCD151.
מבוא
במהלך קיטוב לתנועה, תאים של בעלי החיים להאריך מגוון של בליטות דינמיות, קרום מהשטח שלהם, ובכלל זה filopodia, lamellipodia, סיבי הכחשה, וסלסולי 1. לאחרונה התווסף לרשימה זו היתה nanopodia, סוג מוכר חדש של דק (100-300 מיקרומטר קוטר), הקרנה מוארכת (באורך של עד 50-100 מיקרומטר) קרום המספקים ערוצי קרום להארכה של מבני F-אקטין כגון filopodia וסיבים הכחשה, וכתם שחיובי עם TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) בתאי אנדותל וגידול בתרבית 2,3.
TM4SF1 הוא חלבון עם טופולוגיה כמו tetraspanin-שהיה ידוע במקור אנטיגן תאים סרטניים 4 לפני הגילוי כי המו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תא תרבות בדיסק זכוכית מצופה קולגן
- דיסקי זכוכית מקום (12 מ"מ קוטר) בתוך צנצנת זכוכית (4 גר ') וחיטוי לעקר את הדיסקים.
- שים 25 מיליליטר 70% אתנול בצינור פלקון 50 מיליליטר ולמקם אותו במכסת מנוע בתרבית תאים. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים עד לרמה של הפתרון יורדת ל 20 מיליליטר.
- הנח מלקחיים חדים עם נקודת קנס נוספת באתנול 70% למשך 5 דקות לפני השימוש בו לטיפול בזכוכית קשיח.
- מוציא בז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבור שלב 1:
אם תאים (כגון HUVEC וPC3 השתמש במחקר זה) יכולים לגדול באופן נורמלי, תאים יצרפו לדיסק מצופה קולגן בתוך 30 דקות אחרי שהם זורעים, לקטב ולהיות ניידים זמן קצר לאחר מכן, ולהאריך nanopodia קדימה הנתיב שלהם של תנועה. 1A ו-1B דמויות בהתאמה תערוכות HUVEC. איור 2A מקוטב ומתרבה מראה תאי PC3 מקוטבים במצב נייד.
עבור שלב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Nanopodia ערוצי הממברנה תאית דקים שבתקיפות לצרף מטריקס דרך TMED ויכול להאריך יותר מ -100 מיקרומטר מתא סלולרי מקוטב לחוש את הסביבה ולתווך אינטראקציות בין תאית 2,3. Nanopodia לדבוק מטריצה כך בתוקף כי שאריות הם השאירו מאחוריהם כמהלכי תא משם (איורים 1 ו -2). Nanopodia וכך מאפשר לנו ללמוד כיצד תאים לחוש את סביבתם ולקבוע את דרכה של תנועת תא, וכיצד תנועת שינויי טיפול ביטוי גנים או בסמים. עם זאת, בשל שריריותם של מבנים אלה קרום הדק (100-300 רו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
אנו מכירים ד"ר הרולד דבוז'ק לדיונים מועילים כולל ההצעה לנסות קיבעון ב37 מעלות צלזיוס PFA. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH CA92644 P01 ועל ידי חוזה מהקרן הלאומית לחקר הסרטן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דיסקי זכוכית | פישר סיינטיפיק | 12-545-82 | צנצנת זכוכית בקוטר 12 מ"מ |
| פישר סיינטיפיק | 02-912-310 | צנצנות זכוכית שקופות נקיות ישרות, 4 גרם | |
| שקופיות זכוכית | פישר סיינטיפיק | 12-544-1 | שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה פרימיום פישר |
| 50 מ"ל שפופרת פלקון | BD פלקון | 352070 | צינור צנטריפוגה חרוטי מפוליפרופילן 50 מ"ל בהירות גבוהה, דירוג 16,000 RCF. עקר. |
| צינור פלקון 15 מ"ל עם מתלה קלקר | קורנינג | 430790 | קורנינג 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה PP |
| מלקחיים חדים | פישר סיינטיפיק | 13-812-42 | ניתוח מלקחיים מחודדים דקים במיוחד 24 |
| בארות צלחת תרבית תאים | BD Bioscience | 353047 | צלחת תרבית תאים 24 בארות |
| 150 מ"מ צלחת תרבית תאים | BD Bioscience | 353025 | צלחת תרבית תאים 150 מ"מ |
| 19 G 1 ו-frac12; מחט מזרק | BD Bioscience | 309635 | 19 גרם 1 ו-frac12; |
| מעבדות אתנול דקון בע"מ | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof | |
| Collagen Solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, ריכוז גבוה, זנב עכברוש, 100 מ"ג |
| טריפסין/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% טריפסין-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM גלוקוז גבוה (1x), נוזלי, עם L-גלוטמין, ללא נתרן פירובט |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, תמיסה פי 10, pH 7.4 |
| PFA (פרפורמלדהיד) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% ב-PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | סרום בקר עוברי |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 בסיסי בינוני 500 מ"ל ו-EGM-2 SingleQuot ערכת תוסף & גורמי גדילה |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | מסיס במים. תמיסת מלאי 4% וריכוז עבודה הוא 0.4%. |
| נוגדן TM4SF1 אנטי-אנושי לעכבר | Millipore | MAB3127 | Epitope ממוקם בתחום החוץ-תאי |
| נוגדן CD9 אנטי אנושי של עכבר | BD Bioscience | 555370 | Epitope ממוקם בתחום החוץ-תאי |
| Alexa Fluor 488 חמור נגד עכבר נוגדן שני | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 חמור נגד עכבר IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | מצומד רודמין |
| מצומד פלואידין נגד דהייה מדיית הרכבה | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent עם DAPI |
| 70% אתנול | 17.5 מ"ל אתנול (200 הוכחה) 7.5 מ"ל מים נטולי יונים | ||
| 10x PBS (להכנת 200 מ"ל) | 20 מ"ל של 10x PBS 180 מ"ל מים נטולי יונים | ||
| 20% Triton X-100 (להכנת 20 מ"ל) | 4 מ"ל Triton X-100 16 מ"ל מים נטולי יונים | ||
| 4% NaN3 (להכנת 25 מ"ל) | 1 גרם NaN3 25 מ"ל מים נטולי יונים | ||
| 50 ננוגרם/מ"ל תמיסת קולגן בקר ב-PBS (להכנת 5 מ"ל) | תמיסת מלאי של 50 μ גרם/מ"ל (50 מ"ל) 830 μ l קולגן I (3 מ"ג) 50 מ"ל PBS | ||
| בופר חוסם ICC (50 מ"ל) | 49 מ"ל PBS 2% FBS (הוסף 1 מ"ל) 0.04% NaN3 (הוסף 100 μ l של 4% NaN3) | ||
| מאגר חוסם ICC/0.01% Triton X-100 (להכנת 50 מ"ל) | 50 מ"ל של מאגר חסימת ICC 25 μ l של 20% Triton X-100 | ||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| קולט אדים לתרבית תאים | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (סדרה 60) ארון בטיחות ביולוגי |
| 37 מעלות; C, 5% CO2 חממת תרביות תאים | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 כרית חימום אינקובטור עם מעטפת מים |
| K& H ייצור | 1020 | K& H Lectro כרית מחוממת עם כיסוי פליז חופשי (www.amazon.com) | |
| צנטריפוגה | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) צנטריפוגה שולחנית |
| המוציטומטר | סיגמא-אולדריץ' | Z359629 | המוציטומטר קו בהיר |
מקורות
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogen....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
