Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

סיכום

Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים.

תקציר

ויטמין C (ascorbate) ממלאת תפקידים רבים חשובים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם יצאו לאור רק בשנים האחרונות. לדוגמא, בתוך המוח, ascorbate פועל באופן הגנה עצבי וneuromodulatory שכרוך רכיבה על אופניים ascorbate בין הנוירונים והאסטרוציטים vicinal - מערכת יחסים שנראה כחיוני להומאוסטזיס ascorbate המוח. בנוסף, יש ראיות המתעוררות מראות כי יש ascorbate תפקיד התרחב מאוד בויסות חילוף חומרים של ברזל תאי ומערכתיים יותר מוכר בסגנון קלאסי. ההכרה הגוברת בתפקיד נפרד של ascorbate בפיזיולוגיה תאית והאורגניזם נורמלי וחוסר פיקוח ממשלתי דורשת מגוון של טכניקות אנליטיות בינונית תפוקה ורגישות גבוהה שיכולות להתבצע ללא הצורך בציוד מומחה יקר מאוד. כאן אנו מספקים הוראות מפורשות למדיום תפוקה, assay microplate הספציפי וזול יחסית לקביעת בוascorbate התוך תאי וה בתרבית תאים.

מבוא

גילוי האופי הכימי של חומצה אסקורבית (ויטמין C), וזיהוי שלה בתור "הגורם אנטי scorbutic" המיוחל, על ידי אלברט Szent-ג'ורג'י ואחרים במאמרים שפורסמו 1928-1934 ¹ היה אירועי ציון דרך בהיסטוריה לביוכימיה. ואכן, תגליות אלה תרמו לSzent-ג'ורג'י שזכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 1937. החבילה המתרחבת של תפקידים לascorbate בפיזיולוגיה של בעלי חיים וצמחים, כמו גם על בריאות אדם, תמשיך להיות הנושאים מדעיים פעילים חקירה ומחלוקת.

L-Ascorbate הוא reductant פיסיולוגי בשפע ואנזים cofactor במערכות יונקים, ותורם לתגובות אנזימטיות מוגדרות היטב רבות מעורבים הידרוקסילציה קולגן, קרניטין וביוסינתזה נוראפינפרין, חילוף חומרים טירוזין והורמון פפטיד amidation ^2. מסקרן, evide הרכבהNCE עולה כי ascorbate משחק תפקיד בגירוי dioxygenases ברזל תלוי אחר, כגון hydroxylases prolyl וasparaginyl המעורב בהידרוקסילציה ומיקוד של גורמי היפוקסיה מושרה 1α (HIFs) ו2α ^3. דו"ח שפורסם לאחרונה מצביע על כך שascorbate משחק תפקיד בהבשלת תאי T המשפיע על דרך demethylation הכרומטין באמצעות פעילותו במגרת hydroxylases הגרעיני, Jumonji C חלבוני תחום (JmjC); האחרון שבם מופיעים לדרוש ascorbate לפעילות מלאה ^4. ואכן, הגירוי של אנזימים כגון על ידי ascorbate נראה להתרחש על ידי מנגנון דומה לגירוי על ידי ascorbate של hydroxylases HIF וקולגן. בין השפעות קלאסיות אחרות, ascorbate תורם באופן משמעותי לantioxidation הסלולרי כמחסל ⁵ רדיקלי מסיסים במים שבירת שרשרת ולמחזור של קרום הפלזמה α-טוקופרול (ויטמין E) באמצעות ההפחתה של α-tocopheroxyl ⁶ רדיקלי, Which חשוב בהגנה מפני חמצון של שומנים בממברנה ^7. חשוב מכך, למרות שרוב היונקים מסוגלים סינתזה כבדית דה נובו של ascorbate מD-גלוקוז, פרימטים גבוהים יותר, שרקנים ועוד כמה עטלפים תלויים במקורות תזונתיים של הוויטמין ^8. זאת בשל איון של גן GULO, orthologues אשר ביונקים מושפעים לקודד האנזים, γ-gulono-lactone מונואמין ^9-13. אנזים זה נדרש לתגובה האחרונה בביוסינתזה ascorbate ^מ13 גלוקוז.

בעקבות קליטה בתיווך טרנספורטר מלומן מעיים בבני אדם, ascorbate מופץ בכל הגוף על ידי מערכת הדם. הוויטמין נמצא בדרך כלל בצורה המצומצמת שלה בmillimolar ריכוזים intracellularly (עם החריג הבולט של אריתרוציטים שבריכוזים הם בדרך כלל דומים לריכוז הפלזמה הרווח), ובקונצרט כלשהו מייקרוentrations (למשל 50-200 מיקרומטר) ברוב הנוזלים תאיים ^14,15.

בתנאים פיסיולוגיים, ascorbate בדרך כלל עובר חמצון אחד אלקטרונים הפיכים לרדיקלי ascorbyl בחינם (AFR; הידוע גם בmonodehydroascorbate או semidehydroascorbate). בעוד AFR הוא ¹⁶ רדיקליים יציבים יחסית, בהיעדר הירידה המהירה שלה מאלקטרון אחד האנזימטית חזרה לascorbate, שתי AFRs יכול לקדם dismutate לascorbate אחד וdehydroascorbate אחד (DHA) ^9,13,17. בתוך הפנים של התא, מוצר חמצון שני אלקטרונים של ascorbate, DHA, ניתן להפחית במהירות בחזרה לascorbate ידי גלוטתיון וNAD (P) H האנזימטית תלויות ותגובות אינן אנזימטית ^13.

בזמן שהוא קיבל באופן קלאסי שהתפקיד המשמעותי היחיד של ascorbate במטבוליזם של ברזל הוא כדי לעורר ספיגה תזונתית של ברזל מהמקור צמחי ^18, אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות שלtrongly מצביע ascorbate שמשחק תפקיד התרחב מאוד בחילוף החומרים של מתכת זו. ראשית, ascorbate כי הוא שוחרר על ידי תאי ascorbate-גדוש מופיע לשחק תפקיד חשוב בויסות הספיגה של ברזל שאינו מאוגד transferrin על ידי תאים ^19,20, וראיות מאוד לאחרונה עולה כי ascorbate גם מודולציה את הספיגה של ברזל בכריכת transferrin על ידי תאים ^21, האחרון שבם מתאים למסלול פיסיולוגי עיקרי ברזל ספיגת ^22.

Ascorbate הוא חיוני לתפקוד תקין של מערכת עצבים מרכזי ביונקי ^23,24. יחד עם luteum קליפת המוח, בלוטת יותרת המוח, בלוטת התימוס, הרשתית וקורפוס יותרת הכליה, המוח מכיל ריכוזים גבוהים של ascorbate יחסית לרקמות אחרות בגוף ^23,25-27. בנוסף, החשיפה של שני האסטרוציטים ^28,29 ותאים כמו נוירון ³⁰ לגלוטמט ידוע כדי לעורר את שחרורו של ascorbate לתוך חלל החוץ תאי, שם ascorbatהוא חשב דואר כדי לעזור להגן על נוירונים נגד תפקוד עצבי הנגרם גלוטמט ^{ביום 31.} בעוד המנגנון של שחרור ascorbate-Induced גלוטמט מהאסטרוציטים המדויק אינו ידוע, יש לנו לאחרונה סיפקנו ראיות המצביעות על מעורבותם של תאי נפיחות נגרמת על ידי ספיגת גלוטמט על ידי גלוטמט astrocyte וטרנספורטר aspartate (GLAST; איזופורם הידוע גם חומצת אמינו מעוררת טרנספורטר 1 [EAAT1 ] בבני אדם) והפעלה הסוגר של osmolyte ואניון ערוצי נפח רגיש (VSOACs) שהם חדירים לאניונים אורגניים קטנים כגון ascorbate ^32. הזהויות מולקולריות של תעלות קרום הפלזמה מעורבות בהיווצרות VSOAC להישאר להיות מזוהות ^33,34.

למרות מבחני רבים פותחו לקביעת ascorbate בדגימות ביולוגיות, הכוללות מבחני spectrophotometric, fluorometric וchromatographic ^35,36, יש הרבה גיוון בסגולי, רגישות, interferencדואר על ידי מזהמים כימיים, טווח ליניארי אפקטיבי ויציבות של אנליטי נקודת הקצה. בנוסף, גורמים משמעותיים נוספים המשפיעים על הבחירה של assay הם מהירות, קל שימוש וגישה לציוד יחסית מיוחד כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מנגנון (HPLC).

כאן אנו מציגים assay microplate colorimetric פשוט ומאוד ספציפי לקביעת ascorbate תאית בתאים בתרבית, כמו גם assay נפרד לקביעת ascorbate-זרימה מהתאים בתרבית. Assay האחרון נועד לעקוף את הבעיה של הערכה נמוכה מדי של שחרור ascorbate מהתאים עקב ספיגה מחדש מהירה של ascorbate שפורסם על ידי מובילי נתרן תלוי ascorbate (SVCTs). למרות ששתי השיטות האלה הופיעו בחלק מהפרסומים הקודמים שלנו ^{19,20,32,37,38,} כתב היד הזה מספק סט מפורש של הוראות והנחיות לביצוע היעיל שלהם.

פרוטוקול

1. קבע Ascorbate תאיים בתאים בתרבית

1. תרבית תאים וקציר
   1. לגדול השעיה (למשל erythroleukemia האנושי, K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים ראשוניים) באמצעות נהלי תרבות סטנדרטיים ^19-21,32,38. הערה: כדי להבטיח תאים מכילים ascorbate, טענו תאים בתרבית עם ascorbate או כascorbate או DHA ^33,39.
2. יצירת תמצית סלולרית המכיל ascorbate
   1. דגירה מספר מתאים של פוספט שנאגרו מלוח השעיה (PBS) דהוי או תאים חסיד עם 450 μl של תא קר כקרח permeabilization הצפת [CPB; 0.1% saponin (w / v) ב-PBS; 4 ° C]. הערה: קבע את מספרם של התאים הנדרשים להשגת ערך הספיגה בטווח ליניארי של assay (ראה להלן) באופן אמפירי על ידי משתמש הקצה. הערה: ניתן להשתמש גם בתמציות רקמה (ראה דיון לפרטים נוספים).
   2. Agitaתאי te על קרח דק 10 כדי להבטיח תמוגה הסלולרית יסודית.
   3. יצירת תמצית תאית המכיל ascorbate הובהרה על ידי הסרת פסולת תאית על ידי צנטריפוגה של lysate הגולמי בגרם × 16,000 במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בקירור (4 מעלות צלזיוס).
   4. מוציא בזהירות 4 x 100 aliquots μl מכל מדגם ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה גם 25 μl / טוב של PBS ("-AO") בלבד או 25 μl / טוב של 45.5 U / מיליליטר פתרון מניות של L-ascorbate-מונואמין (AO) ב-PBS ("+ AO"). הערה: זה צריך להיעשות במקביל להכנת התקנים (ראה להלן).
3. הבנייה סטנדרטית עקומת ascorbate (חייבת להיות בנויה מחדש לכל assay)
   1. הכן פתרון מניות של חומצה אסקורבית 10 מ"מ קר כקרח PBS. הערה: בדוק את הריכוז של ascorbate spectrophotometrically באמצעות קובט קוורץ עם 1סנטימטר נתיב באורך ב265 ננומטר (מקדם הכחדה = 14.5 מ"מ ^-1 סנטימטר ^{-1) 40.}
   2. להכין בקפידה סדרה של סטנדרטים ascorbate בין 0 ל 20 מיקרומטר.
   3. במקביל לצעד 1.2.4, להסיר בזהירות 4 × aliquots 100 μl מכל תקן ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה 25 μl / טוב של PBS ("-AO") או 45.5 פתרון מניות U / מיליליטר של AO ב PBS ("+ AO"). הערה: בסטנדרטים ascorbate מעל 100 μl יכיל 0-2 nmole של ascorbate. שים לב, המטרה של AO היא לשלוט על התרומה של reductants הלא ascorbate לferricyanide הפחתה.
4. לקבוע ascorbate תאיים - שלב 1: להסיר באופן סלקטיבי ascorbate וכמותית לחמצן ascorbate עם ferricyanide
   1. Orbitally לערבב את צלחת 96 היטב ב550 סל"ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך על ידי כיסוי את הצלחת בנייר כסף. הערה: Tהצעד שלו צריך לחמצן כל ascorbate בבארות "+ AO" לDHA. בארות "-AO" אינן צריכות להיות מושפעות.
   2. הוסף 50 μl של 3.5 ferricyanide אשלגן מ"מ (המכונה במסמך בשם "ferricyanide") ב-PBS לכל הבארות. מ"מ הסופי [ferricyanide] = 1. שים לב: השתמש multipipettor.
   3. Orbitally לערבב את הצלחת ב550 סל"ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות נוספות בחושך. הערה: צעד זה אמור לגרום להפחתת ferricyanide לשל ברזל על ידי ascorbate ביחס stoichiometric של 2 מולקולות של ferricyanide מופחתות לכל מולקולה 1 של ascorbate חמצון.
   4. מייד להוסיף 25 μl של פתרון זה עתה נבנה מכיל 50% (v / v) חומצה אצטית ו30% (w / v) חומצת Trichloroacetic (TCA). שים לב: השתמש multipipettor.
5. לקבוע ascorbate תאיים - שלב 2: לכמת את כמות של הברזל נוצרה ³⁷
   1. הוספה של פתרון נחישות של ברזל ³⁷ 100 μl לדוארACH כן. הערה: פתרון עבודה צריך להיעשות מייד לפני שימוש: 2 מיליליטר של 3 M Na-אצטט (pH 6.0); 0.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית (~ 17.4 M חומצה אצטית); 2 מיליליטר של 0.2 M חומצת לימון; 2 מיליליטר של 3.3 מ"מ FeCl ₃ ב0.1 חומצה אצטית M; 1 מיליליטר של 30 מ"מ ferene-S. הנפח הסופי של פתרון עובד זה צריך להיות 7.5 מיליליטר.
   2. Orbitally לערבב את הצלחת בחושך ב550 סל"ד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
   3. קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר (כלומר המקסימום ספיגת של Fe (II) (ferene-S) ₃ המורכבים).
   4. לחשב את כמות ascorbate תאית כascorbate nmoles למיליון תאים בתחילה על ידי הפחתת ₅₉₃ ערכי _ננומטר לבארות '+ AO' ממקבילים - הבארות "AO" עבור כל דגימה ולאחר מכן ביון מעקומת סטנדרט ascorbate (ראה שלב 1.3 ). בעת בניית עקומת הסטנדרט, עלילה "ערך הבדל" זה עבור כל תקן כנגד הסכום של ascorbאכלתי בכל טוב.

2. קביעת Ascorbate-זרימה מתאים בתרבית

1. תרבית תאים וקציר
   1. לגדול השעיה או תאים חסיד כאמור לעיל (ראה שלב 1.1). הערה: לבצע את assay להלן בפורמט פלאט 24 גם עם השעיה ותאים חסיד לתוצאות הטובות ביותר.
   2. תאי השעיה resuspend, או כיסוי תאים חסיד, עם 400 μl של מראש חיממתי פתרון שנאגר מלוח HEPES, עם או בלי סידן ומגנזיום, ומכילים 5 מ"מ D-גלוקוז (HBS / D; pH 7.3, 37 מעלות צלזיוס) בבארות של 24 גם צלחת. מוסיף את אותו הנפח של HBS / D לבארות ללא תא שצוינו על כל צלחת 24 גם להיבדק. הערה: יהיה זה האחרון משמש כשולט ללא תא לתגובה הבסיסית (ראה להלן).

3. לקבוע את סכום Ascorbate פורסם

1. צריכים להיות מוכנים פתרונות המניות הבאים מראש: 120U / AO מיליליטר בHBS / D (להכין טרי); 2.4 מ"מ Ferene-S בHBS / D; 120 מיקרומטר FeCl ₃ ו600 מיקרומטר Na-ציטראט בHBS / D (להכין באופן מיידי מפתרונות מניות מרוכזים יותר).
2. כדי להתחיל את תגובת ferrireduction (נפח סופי לכל גם צריך להיות 600 μl), להוסיף הכמויות של חומרים כימיים לבארות בודדות כבר מכילות 400 μl של HBS / D הבאים:
   1. הוסף 50 μl של AO (120 U / ml) או HBS / D כדי לזווג בארות בשלושה עותקים. ריכוז AO הסופי צריך להיות 10 U / ml. הערה: לייבל לזווג בארות כ" - AO "ו" + AO ".
   2. מערבבים את הצלחות עם ערבוב מסלולית עדין במשך 5 דקות ב37 ° C.
   3. הוסף 50 μl של 2.4 מ"מ ferene-S לכל הבארות. ריכוז ferene-S הסופי צריך להיות 200 מיקרומטר. מערבבים את הצלחות כאמור במשך 5 דקות ב37 ° C.
   4. הוסף 50 μl של ציטרט וברזל 120 מיקרומטר מוכן טרי. הברזל הסופי וריכוזי ציטראט צריך להיות 10 ברזל מיקרומטר ו50 ציטראט מיקרומטר. מערבבים היטב.
3. בשלוש בארות שליטה בשלושה עותקים, לשאוב את המדיום שמעליה ולהוסיף 600 HBS / D μl מכיל saponin .0.1%. הערה: אלה ישמשו פקדי "100% תא תמוגה" לקטט דהידרוגנז LDH () assay שחרור שנערך במקביל (ראה בהמשך).
4. דגירה של 60 דקות בחושך על 37 ° C.
5. בסופו של assay ascorbate-בזרימת, במהירות לשאוב 500 μl מכל טוב ולהוסיף לכותרתו כראוי בארות בצלחת 24 גם. הערה: לתאי השעיה, בתחילה להסיר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C.
6. הוסף 300 aliquots μl של supernatant לצלחת 96 היטב ולאחר מכן קרא ב593 ננומטר.

4. קביעת Ascorbate התאי

1. קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר.
2. לחשב את כמות ascorbate תאי כascorbate nmoles לחלבון מ"ג (או למיליון תאים) כפי שתואר לקביעת ascorbate תאיתבשלב 1.5.4. הערה: למשתמש הקצה צריך לייעל את תנאים, כך ששחרור ascorbate אינו מוגבל על ידי ascorbate תאיים.

5. קביעת שחרור LDH

1. עם 200 μl הנותר של פתרון תאי מכל מדגם לנהל assay שחרור LDH ^32,41 כדי לקבוע את מידת תמוגה הסלולרית. הערה: לחשב כ% מLDH releasable המוחלט. לקבוע LDH releasable מהדגימות שטופלו בsaponin .0.1%.

תוצאות

קביעת Ascorbate תאית בתאי השעיה מתורבתים

ב assay הראשון (איור 1), ascorbate תאיים נקבע, בעקבות ascorbate ספציפי הפחתה (AO רגיש כלומר) של ferricyanide לשל ברזל, תוך שימוש בנחישות רגישה מאוד של של ברזל על ידי הליך שפורסם בעבר ^37. זיהוי של ascorbate מבוסס על קלאציה colorimetric של ברזל ברזל שנוצר על ידי הפחתת ascorbate תלוי של ferricyanide לשל ברזל, ואחריו הירידה של ברזל ברזל ברזל ע...

דיון

במאמר זה אנו מציגים שני מבחני microplate colorimetric מהירים, ספציפיים ורגישים יחסית לקביעת ascorbate נגזר מתאי התוך וחוץ תאיים בתאים בתרבית. ניתן להשלים מבחני עם גישה לציוד מעבדה סטנדרטית וחומרים כימיים. מגיב רק יקר באופן מתון הנדרש לassay הוא AO, שהוא חיוני כפי שהוא מקנה גבוהה מידת הספציפיות אנליטי כלפי L-ascorbate. מבחני הם גם מתאימים לשני תאי השעיה (למשל K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים מכרסמים עיקריים HepG2 או), וכבר מועסקי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות תחתונות שטוחות Nunc 96 באר	Thermo	269620	ניתן להשתמש בכל צלחת עם תחתית שטוחה של 96 בארות
מיקרוצנטריפוגה ספסל מקוררת	Eppendorf	5415D	ניתן להשתמש גם במיקרוצנטריפוגה לא מקוררת שאוזנה לטמפרטורה בחדר קירור
צנטריפוגה ספסל מקוררת	Eppendorf	5810R	דלי
נדנדהBio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		ניתן להשתמש בכל ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות המסוגל לקרוא ב-593 ננומטר ומומלץ. אם נעשה שימוש בקורא לוחות מבוסס מסנן, בחר את אורך הגל הקרוב ביותר האפשרי והשתמש בשיטת העקומה הסטנדרטית.
Ependorf MixMate (מערבל אורביטלי מיקרופלייט)	Eppendorf		זהו מערבל מיקרו-פלטות רב תכליתי ואמין מאוד ועובד טוב מאוד עבור מבחנים אלה
מאגרים
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), תמיסת מלח חוצצת MOPS pH 7.4
(MBS); 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 15 מ"מ MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 מ"מ D-גלוקוז (MBS/D)
תמיסת מלח חוצצת HEPES + 5 מ"מ D-גלוקוז (HBS/D); 137 מ"מ NaCl, 5.2 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl2• 2 H2O, 0.8 mM MgSO4• 7 H2O, 5 מ"מ D-גלוקוז, 20 מ"מ HEPES-Na+, pH 7.3)
חוצץ חדירות תאים (CPB; 0.1% ספונין ב-PBS)
כימיקלים
חומצה L-אסקורבית או נתרן L-אסקורבט	סיגמא-אולדריץ		יש להשיג דימר
חומצה דהידרו-L-אסקורבית (DHA)	Sigma-Aldrich	30790	תמיסות מימיות מניבות תיאורטית 2 שומות של מונומר DHA לכל שומה של דימר DHA
ציטוכלזין B	Sigma-Aldrich	C6762	תמיסות מלאי שהוכנו ב-DMSO או אתנול
אסקורבט אוקסידאז (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	ניתן להכין תמיסות מלאי (120 U/ml) ב-PBS או MBS ולאחר מכן להקפיא במכסות
אשלגן פריציאניד (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	טריהידראט
פרן-S (3-(2-פירידיל)-5,6-די(2-פוריל)-1,2,4-טריאזין-5&פריים;,5&פריים; &פריים;-חומצה דיסולפונית מלח דיסודיום)	סיגמא-אולדריץ'	92940
נתרן L-גלוטמט	סיגמא-אולדריץ
L-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'
ספונין	סיגמא-אולדריץ'	47036	הכן תמיסת מלאי של 0.1%
פתרונות מלאי לבדיקת
3 M נתרן אצטט (pH 6.0)
חומצה
0.2 M חומצת
3.3 מ"מ FeCl<תת>3 ב-0.1 M חומצה
30 מ"מ ferene-S
50% (v/v) חומצה אצטית + 30% (w/v) חומצה טריכלורואצטית (TCA)
פתרונות מלאי לבדיקת
AO (120 U/ml)
2.4 מ"מ פרן-S
0.12 מ"מ FeCl<תת>3 ב-0.6 מ"מ נתרן-ציטראט