הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ליגנין Down-תקנה של

13K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51340

⸱

23 ביולי 2014

 ,  ,  , 
1The School of Plant Sciences, University of Arizona, 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, 3The Institute for Sustainable and Renewable Resources, The Institute for Advanced Learning and Research, 4Department of Plant, Soil and Microbial Sciences, Michigan State University

במאמר זה

סיכום

טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותחים.

תקציר

כדי להקל על השימוש בביומסה lignocellulosic כמשאב יואנרגיה חלופי, במהלך תהליכי גיור ביולוגיים, יש צורך בצעד מקדים לפתוח את המבנה של דופן תא צמח, הגדלת הנגישות של דופן תא הפחמימות. ליגנין, חומרי polyphenolic נוכח סוגים רבים דופן תא, ידוע להיות מכשול משמעותי לאנזים גישה. ירידה בתוכן יגנין לרמה שאינו מפריעה למערכת יושרה והגנה המבנית של הצמח עשויה להיות צעד חשוב כדי להפחית את עלויות ייצור bioethanol. במחקר זה, יש לנו למטה מוסדר מבחינה גנטית אחד מהגנים הקשורים לביוסינתזה ליגנין, רדוקטאז cinnamoyl-CoA (ZmCCR1) באמצעות טכניקת התערבות גדילים כפולה RNA. מבנה ZmCCR1_RNAi שולב בגנום התירס בשיטת הפצצת חלקיקים. צמחי תירס מהונדסים גדלו בדרך כלל בהשוואה לצמחי ביקורת הפראית מהסוג ללא בterfering עם צמיחה ביומסה או מנגנוני הגנה, הפרט להצגה של חום צבע באמצע צלעות מהונדסות עלה צמחים, קליפות, וגבעולים. הניתוחים המיקרוסקופיים, בשיתוף עם assay היסטולוגית, גילו כי סיבי sclerenchyma העלה היו דלילים אך המבנה והגודל של רכיבי מערכת כלי דם גדולים אחרים לא שונו. תוכן ליגנין בתירס המהונדס הופחת ב 7-8.7%, התוכן תאית גבישים הוגדל בתגובה להפחתת ליגנין, וhemicelluloses נותר ללא שינוי. הניתוחים עשויים להצביע על כך זרימת פחמן שאולי הייתה זזה מביוסינתזה יגנין לביוסינתזה תאית. מאמר זה מפרט את הנהלים המשמשים ללמטה להסדיר את תוכן ליגנין בתירס באמצעות טכנולוגיית RNAi, ואת דופן תא ההלחנה ניתוחים משמש לאימות את ההשפעה של השינויים בתא קיר המבנה.

מבוא

הייצור של דלק ביולוגי מביומסה lignocellulosic רצוי מאוד בשל השפע הנוכחי שלה בארה"ב 1, ובמקרה של קציר קיימא של שאריות חקלאיות וייעור, את היכולת לא להתחרות ישירות לשדה יבול המשמש לייצור מזון למזון ובעלי חיים. עם זאת, בניגוד לגרעיני תירס, המהווה את המקור העיקרי של דלק ביולוגי שנוצר כיום בארה"ב, חומרי lignocellulosic באופן משמעותי יותר מורכב וקשה לשבור. בנוסף לפחמימות ארוכת שרשרת, תאית hemicellulose, שהם המקורות העיקריים של סוכרים במהלך התסיסה של חומרי lignocellulosic, סוגים רבים של קירות תא הצמח מכילים גם ליגנין, פולימר phenylpropanoid המספק כוח, הגנה מפני התקפת הפתוגן, והידרופוביות לקירות תא. אמנם הכרחי לגידול צמחים והישרדות, ליגנין גם מציג מכשול משמעותי להמרה האנזימטית המוצלחת של התאית וhemicelluלהפסיד לסוכרים מסיסים. חומרים בעלי תוכן ליגנין גבוה הם בדרך כלל חומרים פחות רצויים עבור שני הדלק הביולוגי (דרך מסלולי גיור ביולוגי) ותעשיות עיסת נייר בשל ההשפעות השליליות על מאפייני עיבוד ואיכות מוצר. לפיכך, מניפולציה גנטית של חומרים צמחיים ליגנין הפחתה ברמה שלא תפריע לכוח מבני יבול ומערכות הגנה עשויה להיות חשובה לצמצום עלויות ייצור עבור שני הדלק הביולוגי lignocellulosic ותעשיות עיסת נייר.

בתירס (Zea mays), ליגנין הוא קוולנטית צולבים לhemicellulose בקיר התא הראשוני באמצעות ferulate וגשרי diferulate 2. מורכב ליגנין-hemicellulose נקשר microfibrils תאית באמצעות קשרי מימן, ויוצר מטריצה ​​מורכבת שמעניקה שלמות וכוח לקיר התא המשני. החוזק המכני של קירות תא הצמח נקבע במידה רבה על ידי הסוג של lignin יחידות משנה 3-5. במחקרים קודמים, לשנות את הפרופורציות של יחידות משנה ליגנין לא הראה מגמה ברורה בעיכול אנזימטי 6-11. עם זאת, ירידות בתוכן ליגנין בדרך כלל מראות שיפור בהמרות 12,13 ועשוי להיות מפתח להגדלת הנעכלות של חומר צמחי על ידי אנזימי hydrolytic כולל endocellulases, cellobiohydrolases, וβ-glucosidases 14.

הנדסה גנטית כדי לווסת את רמת הביטוי של תעתיקים כבר התאמנה באופן נרחב כדי לשפר את יבול תכונות. טכניקות מתקדמות, ובכלל זה נגד תחושה 15 ושיתוף דיכוי 16 טכנולוגיות, מאפשרות יעילות למטה רגולציה של גנים המטרה. עקום החוצה גן שלם גם הושג באמצעות בונה גן מקודד RNA-שחבור אינטרון עם מבנה סיכת ראש 17. יתר על כן, התערבות RNA פעמיים תקועה טכניקה (dsRNAi), כלומר תקשורת ביטוי גנים חזקה ויעילהטור שעובד או על ידי השפלת תמליל מיקוד או דיכוי תרגום, מספק אמצעים חזקים כדי לגרום למגוון רחב של תופעות דיכוי על היעד mRNA 18. טכניקות השתקת גנים להראות כמה מגבלות. טכניקות אלו דווקא לא לווסת את הרמה של שעתוק וזה יכול לגרום לתופעות בלתי צפויות בהשתקת גנים הומולוגיים אחרים.

בשיטה זו, אנו מועסקים הפצצת חלקיקים לבצע dsRNAi בונה לתוך הגנום התירס. נכון להיום, מגוון רחב של מיני צמחים כבר שינה בהצלחה באמצעות הפצצת חלקיקים, שינוי בתיווך Agrobacterium, electroporation, ושיטות microinjection. בשינוי גנטי תירס, שיטת הפצצת חלקיקים יש יתרון על פני כל השיטות האחרות, מכיוון שהוא יעיל ביותר. הפצצת חלקיקים אינה תלויה בחיידקים, ולכן השיטה היא ללא אילוצים ביולוגיים כגון הגודל של הגן, מינים של גן אוigin, או גנוטיפ הצמח. מערכת מסירת transgene הפיסית מאפשרת DNA משקל מולקולרי גבוה ומספר רבים של גנים כדי להיות הציגה לתוך הגנום של צמח, ובמקרים מסוימים לכלורופלסטים ביעילות שינוי גבוה 19. הפחתת ליגנין במערכת כלי הדם של אמצע צלע העלים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) אשר מועילה לבחינת הטופוגרפיה ואת ההרכב של דגימות.

בצמחי תירס, שתיים מרדוקטאז cinnamoyl-CoA (ZmCCR1: X98083 וZmCCR2: Y15069) גנים נמצאו בגנום התירס 20. רדוקטאז Cinnamoyl-CoA מזרז את ההמרה של אסטרים hydroxycinnamoyl-CoA לאלדהידים cinnamyl. אנחנו בחרנו בגן ZmCCR1 ללמטה לווסת אנזים זה, כי הגן מתבטא בכל רקמות lignifying. 523 נוקלאוטידים בתחנה הסופית של '3 של גן ZmCCR1 נבחרו לdsRNAi לבנות כי הרצפים שנראהמגוון יותר בהשוואה לאלו של ZmCCR2. לפיכך, מבנה dsRNAi הייתי דווקא להיקשר רק לZmCCR1, הימנעות מחוץ יעד השתקת 21. מבנה ZmCCR1_RNAi תוכנן לImpactVector1.1 תג מערכת ביטוי cytoplasmic (IV 1.1) המכיל את אמרגן הרקמות הספציפי הירוק, ribulose-1, oxygenase 5-bisphosphate carboxylase (RuBisCO).

כדי לחקור את ההשפעות של dsRNAi לבנות על צמחים מהונדסים, תוכן ליגנין היה לכמת. המדידה ליגנין Klason (חומצה לא מסיס) ידועה להיות מדויקים יותר בהשוואה לשיטות הכימות ליגנין חומר ניקוי החומצה שsolubilize כמה ליגנין 22. לכן, ליגנין Klason נמדד בגבעולי תירס מהונדסים. הליך זה מורכב מחומצת הידרוליזה שני שלבים שממירה פחמימות פולימריים למונוסכרידים מסיס 23. ביומסה שעברה הידרוליזה הייתה אז מופרדת לmateri מסיסה ובלתי מסיסה החומצהals וליגנין מסיס החומצה נמדדו על פי מחקרים קודמים 23,24. באופן אידיאלי, ניתוח ליגנין צריך לכלול עקירות עם מים ואתנול לפני צעד הידרוליזה, על מנת להסיר חומרים מסיסים שיכול להטות את התוצאות, ובעירה שלאחר הידרוליזה של שאריות ליגנין לתת דין וחשבון לכל אפר נוכח בשאריות. ללא צעדים אלה, תוכן ליגנין של המדגם יכול להיות מנופח באופן מלאכותי. השיטה המלאה מוצגת כאן, עם זאת לניסויים שלנו לא הצליחו לבצע את שני הצעדים האלה בשל ההיקף הקטן של חומר זמין לבדיקות

שני מרכיבים אחרים של דופן תא, תאית hemicellulose נותחו גם בליגנין קווי תירס מהונדס למטה מוסדר. זה כבר דווח כי צמחים מהונדסים שהיו למטה מוסדר באו אמונית האנזים זה פנילאלנין (PAL) 25, 4 coumarate-: האנזים CoA (4CL) 26, או cinnamylדהידרוגנז lcohol (CAD) 27 להראות עלייה ברכיבים מבניים דופן תא אחרים. כצעד ראשון במחקרים שלנו, תאית גבישים נמדד תוך שימוש בשיטת Updegraff 28. שיטה זו תוכננה במקור לקביעת תאית במספר רב של חיידקים ופטריות cellulolytic. בקצרה, טופלו מניות התירס הסתובבו עם מגיב Updegraff (חומצה אצטית: חומצה חנקתית: מים) כדי להסיר hemicellulose, ליגנין, וxylosans. תאית גבישים הייתה הידרוליזה לחלוטין לגלוקוז באמצעות הידרוליזה Saeman על ידי הוספת H 2 SO 4. תאית גבישים הייתה אז assayed בשיטת anthrone colorimetric 29. כדי לוודא אם תוכן hemicellulose שונו, תמציות monosaccharide מגבעולים הסתובבו היו הידרוליזה באמצעות חומצת trifluoroacetic, derivatized בשיטה אצטט alditol ולאחר מכן נותחו על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) 30. הנהלים מפורטים עבור טלפונים סלולר גבישיםניתוחי הרכב סוכרים תוכן ומטריצת lulose מתוארים בפוסטר et al. (2010) ביום 31.

כאן, אנו מתארים את הנהלים המשמשים ליגנין למטה רגולציה בתירס באמצעות טכנולוגיית RNAi, שינוי הפצצת חלקיקים, וניתוח ליגנין לפירוק מואץ של ביומסה lignocellulosic תירס לסוכרים תסיס לדלק ביולוגי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה של מבני dsRNAi משמש לDown-תקנה של ZmCCR1

  1. פריימרים ספציפיים גן העיצוב כוללים אתרי אנזים הגבלה הכרחיים להכנת dsRNAi לבנות לעקום החוצה את גן ZmCCR1. שתי קבוצות פריימר נועדו להגביר שני מגזרים שבר של ZmCCR1 cDNA:. בר 523 נ"ב מנוקלאוטיד 748-1271, ושבר נ"ב 285 מנוקלאוטיד 986-1271 ZmCCR1 cDNA נמסר מאריזונה מכון הגנום (AGI). פרטים נוספים מתוארים באיור 1.
  2. להגביר את הבר הגדול על ידי תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מתבנית ZmCCR1 cDNA באמצעות ZmCCR1_748F_BglII פריימרים (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ") וZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3"). להגביר את הבר הקטן יותר (285 נ"ב) באמצעות ZmCCR1_986F_BglII פריימרים (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ") וZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ").
  3. בנפרד ולקשור את השברים לתוך pGEM-T קל בעקבות הוראות היצרן.
  4. לבצע בידוד פלסמיד דנ"א מיני הכנה מtransformants הבודד, כל אחד שמכיל את pGEM-T בונה באמצעות ערכת פלסמיד מיני הכנה מסחרית.
  5. לעכל שני pGEM-T :: ZmCCR1 (523 נ"ב) וImpactVector (IV) -1.1 (וקטור ביטוי ציטופלסמה) עם שני BglII וNcoI.
  6. ולקשור את הבר הגדול מתעכל ג'ל מטוהר ZmCCR1 (523 נ"ב) לתוך הג'ל מתעכל מטוהר IV-1.1.
  7. לעכל את pGEM-T :: ZmCCR1 (285 נ"ב) וIV-1.1 :: ZmCCR1 (523 נ"ב) עם שתי BglII וSACI כדי להכניס את הבר הקטן לתוך IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 נ"ב).
  8. ולקשור את הג'ל מתעכל הקטן בר מטוהר ZmCCR1 (285 נ"ב) לתוך הג'ל מתעכל המטוהרים IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 נ"ב).
  9. Clone שני נ"ב 523 ו285 fragmen נ"בts לIV-1.1 לעשות RNAi ZmCCR1 לבנות, שבו יש רצף חוזר הפוך 285 נ"ב עם spacer נ"ב 238 באמצע שברים חוזרים ההפוך (ראה איור 1).
  10. העבר את זה לבנות לתוך Escherichia coli (E. coli), לגדל אותם ולבצע בידוד פלסמיד דנ"א גודל פוליפוני-הכנה כדי להשיג פלסמיד דנ"א מספיק לשינוי גנטי תירס.

2. תירס טרנספורמציה הגנטית

  1. הכנה של חלקיקי טונגסטן
    1. הנח 60 מ"ג של חרוזים טונגסטן (M10) בצינור 1.5 מ"ל ולשטוף עם 1 מיליליטר של אתנול 70% על ידי vortexing למשך 2 דקות. דגירה של 10 דקות ב23 מעלות צלזיוס אז צנטריפוגות ב18,894 XG במשך 2 דקות וזורקים supernatant.
    2. לשטוף 3x עם 1 מיליליטר של 100% אתנול, צנטריפוגה למשך 2 דקות ושלכת supernatant. הוסף 1 מיליליטר של גליצרול 50% סטרילי כדי להביא את ריכוז microparticle 60 מ"ג / מיליליטר.
  2. הכנה של ה-DNA לפצצה
    1. Plאס 50 μl (3 מ"ג) של חרוזים טונגסטן ערוכים גליצרול 50% לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הוסף 5 μl (1 מיקרוגרם) של IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi פלסמיד דנ"א, 50 μl של 2.5 M CaCl 2, ו20 μl של 0.1 M spermidine. בקצרה מערבולת בין כל תוספת של חומרים כימיים לעיל.
    2. ורטקס בקצרה טונגסטן חרוז-DNA התערובת ו צנטריפוגות ב XG 18,894 ל30 שניות. יוצקים את supernatant ו resuspend את כדורים ב140 μl של 70% אתנול. הסר את הנוזל וזורק. הוספת 140 μl של 100% אתנול. הסר את הנוזל וזורק.
    3. הוספת 48 μl של 100% אתנול. להשתמש מייד או לאחסן על קרח לתקופה של עד 4 שעות לפני ההפצצה.
  3. הפצצה
    1. הנח calli 3-5 סנטימטר קוטר Hi-II תירס embryogenic (בתנאי ממרכז שינוי תירס של אוניברסיטת איווה סטייט) באמצע 100 מ"מ צלחות פטרי המכילות תקשורת N6OSM 32 (כosmotium) לפחות 4 שעות לפני ההפצצה.
    2. Preparדואר מכשיר משלוח החלקיקים PSD-1000/He על פי הוראות היצרן 33.
    3. לעקר קיר חדר עם 70% אתנול. טען קרע דיסק 650 psi סטרילי לתוך כובע התמך סטרילי. מורחים 5-6 μl של פתרון M10-DNA על פני השטח של macrocarrier, בקצרה יבש. macrocarrier עומס והפסקת מסך להרכבת השקת microcarrier.
    4. הנח ההרכבה השקת microcarrier וcalli תירס בחדר במרחק שנבחר מהמסך העצירה (L2 = 6 ס"מ) ודלת נסגרת. להאיץ בחלל ריק של 27 psi נגד מסך רשת תיל.
    5. לחץ על לחצן האש עד פרצי קרע דיסק ולחץ הליום מד יורד לאפס. שחרר את לחצן האש.
    6. דגירה calli מופגז בצלחת פטרי המכילה N6OSM (בינוני האוסמוטי) 32 ל16 שעות בחושך ב27 ° C. לשבור את calli לכעשר חתיכות ויעבירו לN6E (בינוני אינדוקציה יבלת) 32 בצלחות פטרי ודגירה במשך 5 ימים אניn החושך ב27 מעלות צלזיוס.
  4. בחירה
    1. לאחר 5 ימים בN6E, להעביר את calli על מדיום N6S (תקשורת בחירה) 32. תת כל calli על מדיום בחירה כל 30 ימים ל8-12 שבועות מבלי להפריע את מבנה calli.
    2. לאחר כשבועות 8-10, מגזרים צומחים במהירות לבנה יצמחו מתוך שאינו מתרבה וcalli אם נמקים באופן חלקי. בלו הרקמות בצמיחה המהירה הלבנות ותת להם בינוני טרי בחירה (N6S) 32 ותמשיך לדגור כאמור לעיל.
  5. התחדשות
    1. העבר calli העוברי הלבן וגדל במהירות על מדיום התחדשות 32 דגירה כאמור במשך שבוע 1. לעבור calli embryogenic ההתחדשות לתקופה של אור יום שעה 16 ו8 חשוכות שעות ב 25-27 ° C
    2. העבר את ההתחדשות יורה על ההשתרשות 32 בינוניים במבחנה זכוכית לאחר 3-4 שבועות, תמשיך לדגור כאמור לעיל. לאחר r משמעותיפיתוח oot מופיע, לשטוף את השורשים בזהירות מתחת לברז מים, ולאחר מכן השתלתי את שתילים ל4 "סירים באדמה. כסה את הסירים עם שקיות ניילון כדי לשמור על לחות. לאחר 2 ימים לעשות חורים קטנים בשקיות הפלסטיק. אחרי 5-6 ימים להסיר את שקיות הפלסטיק. תמשיך לדגור כאמור לעוד 5-6 ימים.
  6. חממה
    1. להעביר את השתילים לתוך סירי "18 באדמה ולשמור באור שמש קיץ מלא או חממת אור. הצמחים מחדש הראשוניים נקראים T 0 ואילו הזרעים הראשונים שייכים לדור T 1.

3. Assay היסטולוגית

    1. תקן אמצע הצלעות של עלה התירס ב 5 מיליליטר של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין.
    2. תהליך ואקום לחדור עם פרפין על מעבד רקמות באמצעות מעבד רקמות.
    3. להטביע את הרקמות בפרפין באמצעות תחנת הטבעת HistoCentre III.
    4. הסר את פרפין העודף מהקצוות פעם גושKS הם התקררו.
    5. מדגם סעיף במיקרומטר 4-5 עם microtome באמצעות microtome.
    6. הנח סעיפים בשקופיות מיקרוסקופ ויבשים בחממה 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 2-24. סעיפים בטוחים להפוך הם דבקו באופן מלא לשקופית.
    7. סעיפי Deparaffinize בשני שינויים של קסילן במשך 5 דקות ב23 ° C.
    8. מימה מחליקה באמצעות שני שינויים של אתנול 100% למשך 2 דקות ושני שינויים של אתנול 95% למשך 2 דקות ב23 ° C.
    9. יש לשטוף את החלקים במים זורמים ברז למשך 2 דקות.
    10. כתם עם 0.05% O הכחול toluidine ל1-2 דקות ולשטוף בקצרה עם DDH 2 O.
    11. מניחים coverslip על הדגימות עם שמן טבילה והדמיה עם מיקרוסקופ אור.
  2. סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM)
    1. תקן אמצע הצלעות של עלה תירס מחולק הצולב בglutaraldehyde 4% ו0.1 M חיץ פוספט נתרן (pH 7.4) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות.
    2. בקצרה לשטוף את הדגימות במאגר, המיובש בסדרת אתנול (25%, 50%, 75%, ו95%) ל10-15 דקות בכל הדרגתיות ו100% אתנול עבור 10 דקות, 3x.
    3. ייבש את אמצע צלעות מיובשת בחתך רוחב התירס עלה במייבש נקודה קריטי באמצעות נוזל פחמן דו חמצני כנוזל המעבר.
    4. הר הדגימות המיובשים של ספחי אלומיניום באמצעות כרטיסיות פחמן ואקום גבוה
    5. מעיל אמצע הצלעות של עלה התירס רכובים על ספחי אלומיניום עם זהב (כ 20 עובי ננומטר) בcoater גמגום מטוהר עם גז ארגון.
    6. לבחון את הדגימות מצופים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק JEOL שון-6400V (פולט אלקטרונים hexaboride ניתן).
    7. תמונות דיגיטליות היו בתמונה באמצעות תוכנת ניתוח Pro (גרסת 3.2).

4. Klason ליגנין מדידה

  1. מיל הדגימות באמצעות מסך 2 מ"מ.
  2. השתמש בדיקת לחות כדי לקבוע את תכולת הלחות של כל דגימה ולהקליט את הערך.
  3. לשקול את ~ 1.5 גרם של כל דגימה ולהקליט ההמוני. Extract הדגימות באמצעות מים להפקת הראשונה, ואחריו אתנול לחילוץ השני או באמצעות חולץ אוטומטי ממס (3 מחזורים לחילוץ, ~ 14 דקות בכל מחזור) או soxhlet מנגנון (8 שעות לחילוץ). (הערה: צעד זה מסיר extractives שיכול להתעבות במהלך הידרוליזה חומצה ולהפריע למדידה מדויקת ליגנין, להגדיל את התוכן ליגנין Klason הנראית לעין.)
  4. ייבשו את הדגימות שחולצו ב45 מעלות צלזיוס למשך לילה, ולאחר מכן לאפשר להם להתקרר בייבוש, ולשקול שוב.
  5. הגדרת חממה ל30 ° C. מדוד 0.3 גרם של כל דגימה יבשה, מופק לתוך צינורות בלחץ גבוה בורג העליון (triplicates לדגימה מומלץ) ולהקליט את המשקולות ל0.1 מ"ג הקרוב ביותר. הוסף 3 מיליליטר של 72% H 2 SO 4 לכל צינור לחץ.
  6. מערבבים את המדגם באמצעות זכוכית או מוט מערבבים טפלון. השאר את המוט ומערבבים בצינור עד שמים מתווספים הבא דגירה.
  7. מניחים צלוחיות בחממת seלא ל30 מעלות צלזיוס ו150 סל"ד 60 דקות. אחרי שעה 1 להוסיף 84 מיליליטר של מים deionized לדלל את ריכוז החומצה ל -4% ולערבב עם המוט ומערבבים. היזהר שלא להשאיר כמויות גדולות של מדגם בצדדים של הבקבוקון מעל קו המים.
  8. חוזקה לאטום את פקקים בכל הבקבוקונים ולהכניס אותם לתוך מתקן מתכת או כוסות גדולות. החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס באמצעות מחזור עיקור נוזלי במשך שעה 1. לאפשר להם להתקרר לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה.
  9. טרום אפר כורי היתוך הסינון בתנור ב575 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. אפשר לכורים היתוך כדי לקרר בתא ייבוש לשעה לפחות.
  10. אבק לסנן את הפתרון מצינור שדרך כור היתוך נפרד, תוך שימוש במתאם גומי כדי לאבטח את כור ההיתוך. השתמש במי deionized כדי לשטוף את כל חלקיקים שנותרו מהצינור.
  11. ייבש את השאריות ליגנין ב105 ° C למשך התקופה מינימאלית של 4 שעות. רשום את משקליו של כור ההיתוך והשאריות יבשים.
  12. אם אתם משתמשים במעלות צלזיוס 575, מראשאש הדגימות מעל מבער בונזן עד אין עשן או אפר ולאחר מכן למקם בכבשן ל24 שעות, או אם באמצעות תנור לתכנות, לא מראש אפר ולהשתמש בתכנית הבאה:
  13. רמפה מטמפרטורת חדר ל105 ° C ולהחזיק עבור 12 דקות.
  14. רמפה ל250 מעלות צלזיוס ב 10 ° C / min ולהחזיק למשך 30 דקות.
  15. רמפה ל575 מעלות צלזיוס ב 20 ° C / min ולהחזיק לפחות 180 דקות.
  16. הסר את כורי ההיתוך מהתנור ולקרר בתא ייבוש. לשקול את כור ההיתוך ואפר.
  17. לחשב את שאריות החומצה לא מסיסות באמצעות המשוואה הבאה:

figure-protocol-1

M PRE = מסה של ביומסה מופק מראש
M POST = מסה של ביומסה הודעה חולץ-
M = מסת הבקבוקון של ביומסה חילוץ נוספת לבקבוקון
M = מסת שאריות של resid כור ההיתוך וליגניןUE
M ASH = מסה של כור היתוך ואפר
MC = תכולת רטיבות של ביומסה מופק מראש, הכולל בסיס משקל

5. ניתוח פחמימות

  1. לבצע קיר פחמימות תא ניתוחים הבוסס על פוסטר ואח'.) 2010 (פרוטוקול 31 ב. בקיצור, היכונו שאריות בלתי מסיסות אלכוהול מחומר צמחי הקפאה מיובשת. אז hydrolyze החומר עם חומצת trifluoroacetic ולהתאים את נגזרי monosaccharide solubilized לאצטטים alditol המקביל שלהם. לנתח נגזרים נדיפים אלה על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) מחוברת לספקטרומטר מסה מרובע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנחנו הוכיחו הפחתה בתוכן יגנין בצמחי תירס באמצעות RNAi. שיטת שינוי הפצצת החלקיקים הניבה סביב 30% יעילות trnasformation. השתקת הגן של ZmCCR1 נצפתה באופן עקבי בדורות T0-T2. Transgenics ליגנין המופחת גדל באופן דומה לצמחי תירס wildtype פרט להצגת גוון חום באמצע עלה צלעות, הקליפה והגזע. Assay היסטולוגית הראה כי הקווים מוטנטים להציג ירידה משמעותית בעובי דופן תא של סיבי sclerenchyma בעלו תירס אמצע הצלעות 18. למרות הירידה של דופן תא עובי, המבנה של מערכות כלי דם גדולות א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הנגישות של cellulases חיידקים לשתול דופן תא סוכרים תלויה במידה רבה על המידה שבה הם קשורים עם פולימרים פנוליות 23. יחס ההמרה מביומסה lignocellulosic לתסיס סוכר מתואם שלילי עם תוכן ליגנין הופקד בקירות תא secondadry צמח. קשר זה מיוחס למאפיינים הפיזיים של ליגנין כגון הידרופוביות 24, ההטרוגניות כימית, והעדר intermonomeric Hydrolysable הרגיל קשרי 25.

במחקר זה, טכניקת dsRNAi מושרה רמות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

ההדמיה המיקרוסקופית נערכה באמצעות השירותים של מרכז אוניברסיטת מישיגן למתקדם מיקרוסקופית. יבלת תירס נרכשה ממרכז טרנספורמציה תירס של אוניברסיטת איווה סטייט. המחברים מבקשים להודות לר 'ג'פרי Weatherhead של מעבדת מחקר צמח MSU לקבלת הסיוע הטכני שלו על הניתוח של הפחמימות. מחקר זה מומן בנדיבות על ידי תכנית תירס השיווק של מישיגן (CMPM) וConsortium למחקר ביוטכנולוגיה צמח (CPBR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
N6OSM (מדיום אוסמוטי)תוצרת
בית N6E (אינדוקציה של יבלות)תוצרת
מדיה N6S (מדיה לבחירה)
מדיוםתוצרת
מדיוםבבית
10% פורמלין ניטרלי חוצץ (1 ליטר)תוצרת
Bio-Rad PSD-1000/He מכשיר אספקת חלקיקיםהרקולס, קליפורניה, ארצות הברית
Zeiss PASCAL מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליקארל זייס, יינה, גרמניהעבור מיקרוסקופ שדה בהיר, התמונות הוקלטו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי PASCAL של Zeiss (Jena, גרמניה) עם מראת עירור של 488 ננומטר, מסנן פליטה של 560 ננומטר ומסנן פליטה של 505-530 ננומטר. ניתוח התמונה בוצע באמצעות תוכנת מיקרוסקופ סריקת לייזר PASCAL LSM גרסה 3.0 SP3.
Excelsior ES TissueProcessor Thermo Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארצות הברית
HistoCentre III Embedding StationThermo Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארצות הברית
Microtome דגם Reichert 2030Reichert, Depew, NY, ארצות הברית
Emscope Sputter Coater דגם SC 500אשפורד, קנט, אנגליה
JEOL JSM-6400V מיקרוסקופ אלקטרונים סורקJEOL בע"מ, טוקיו, יפן
פיצפטריק JT-6 טחנת הומולואידContinental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 מנתח לחותSartorius
מייבש נקודה קריטית, Balzers CPDLeica Microsysstems Inc, באפלו גרוב, IL, ארצות הברית
צינורותלחץ גבוה עם הברגהאייס גלאס, ויינלנד, ניו ג'רזי#8648-27
תקעי צינור בלחץ גבוה עם הברגהאייס גלאס, ויינלנד, ניו ג'רזי#5845-47
הבית התחדשות הבית השתרשות מיוצר

מקורות

  1. Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
  2. Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
  3. Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , Michigan State University. (2011).
  4. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  5. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
  6. Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
  7. Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
  8. Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
  9. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
  10. Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
  11. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
  12. Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
  13. Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
  14. Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
  15. Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
  16. Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
  17. Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
  18. Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
  19. Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
  20. Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
  21. Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
  22. Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
  23. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
  24. Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
  25. Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
  26. Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
  27. Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
  28. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
  29. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
  30. Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
  31. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
  32. Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
  33. Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
  34. Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
  35. Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

RNAi של CCR1 בתירסהפצצת חלקיקיםהרכב דופן התאצמחי תירס טרנסגנייםעלייה בתאית גבישיתהמיצלולוז ללא שינויפנוטיפ של גוון חוםהידלדלות סיבי סקלרנכימה
ליגנין Down-תקנה של
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.