מאמר שיטה

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

DOI:

10.3791/51341

⸱

11 ביוני 2014

 ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Department of Oncology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכשיו זה ידוע היטב כי microenvironment הסלולרי ורקמות הם רגולטורים קריטיים המשפיעים על התחלה של גידול והתקדמות. יתר על כן, המטריצה ​​תאית (ECM) הוכח להיות רגולטור קריטי של התנהגות תא בתרבות ובהומאוסטזיס בגוף חי. הגישה הנוכחית של תאי culturing על דו ממדים (2D), תוצאות משטחי פלסטיק בהפרעה והאובדן של אינטראקציות מורכבות בין תאים וmicroenvironment שלהם. באמצעות השימוש במבחני תרבות תלת ממדי (3D), את התנאים לאינטראקציה התא microenvironment מבוססים דומה microenvironment in vivo. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדל תאי סרטן השד במטריצת חלבון קרום במרתף 3D, הממחיש את הפוטנציאל של תרבות 3D בהערכת פלישת תא לסביבה. בנוסף, אנו דנים כיצד יש מבחני 3D אלה הפוטנציאל לבדיקת ההפסד של איתות Molecules המווסתים את מורפולוגיה אפיתל ידי immunostaining הליכים. מחקרים אלה יסייעו לזהות פרטים מכניסטית חשובים לתהליכי ויסות פלישה, הנדרשים להתפשטות סרטן השד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגירה ופלישה של תאים בודדים או קולקטיביים הן שני סימני ההיכר של סרטן, ונדרשת להתפשטות הגרורה של תאי סרטן 1-4. היכולת של תאי סרטן ליזום גרורות תלויה ביכולתם להגר ולפלוש לרקמות השכנות באמצעות invadopodia כדי לבזות את הקרום במרתף של התאים. Invadopodia הם בליטות אקטין עשיר דינמיות השפלה מטריקס המאפשרות פירוק של המטריצה ​​תאית באמצעות השחרור של פרוטאזות משפילות מטריצת 5. פלישת תאי הסרטן כרוכה בהשפלה של המטריצה ​​ואחרי הנדידה של התאים הסרטניים וזה מלווה בארגון מחדש של סביבת המטריצה ​​תלת ממדי (3D) 2. לכן, כדי לחדור דרך המטריצה, תא חייב לשנות את צורתו ואינטראקציה עם מטריקס תאי (ECM) 2.

השמירה על שלמות רקמת שד תלויה בחוזקה controlleארכיטקטורת רקמת ד מאז צמתים הידבקות התא-ECM ותאי תאים משפיעים על ביטוי גנים ושיבוש של קוטביות אפיתל יכולה להוביל להופעת הסרטן 6-10. עם זאת, רוב המבחנה הגירה ופלישת מבחני בכגון transwell מבחני לשכה או מבחני פצע שריטה הם דו ממדי (2D) ולכן אלה להזניח את האינטראקציות המורכבות בין תאים וסביבתם הסמוכות 3,6,8,11-14. הבדלים מורפולוגיים ותפקודיים ניכרים, כולל שינויים במורפולוגיה תאית, התמיינות תאים, הידבקויות של תאי המטריצה ​​ודפוסי ביטוי גנים כבר זוהו על ידי תאי culturing בתרבויות 3D שחסרי בדרך כלל במבחני 2D 2,6,8,11. לכן, משתמש במבחני 3D הם מועילים באופן משמעותי במשחזר יותר פיסיולוגי במצב vivo, שמוביל לתרגום טוב יותר של ממצאי פורצי דרך במחקר בסיסי למרפאת 6-10. עם זאת, יש לצייןלמרות היתרונות רבים שנצברו בשימוש בתרבויות 3D, מודל זה לא יכול לתפוס את כל המורכבות של in vivo microenvironment הגידול הכולל סוגים שונים של תאים. עם זאת, ניתן לשלב את תאי סטרומה לתוך המודלים 3D (לדוגמא, fibroblasts, כדוריות דם לבנות, ומקרופאגים) כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות גידולים סטרומה בהידבקות תאים סרטניים ופלישה 15-17.

תאי אפיתל שד בתרבות לגדול בצורה היעילה ביותר כאשר חלבוני ECM כגון laminin וקולגן הם הווה. עם זה ידוע, תערובת מטריצה ​​זמינה מסחרי כבר נגזרה Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) גידול עכברי והוא ידוע בתור מטריצת קרום במרתף Matrigel 2,8. מספר טכניקות הוקמו כדי לגדל תאי האפיתל כמושבות 3D במטריצת קרום במרתף 2,8. מודל מטריצת 3D מרתף הקרום הוא יעיל להקמת תא שד הן ממאיר ושאינו ממאירצמיחה, שמזכיר את מה שמתרחש בסביבה vivo 18,19. תאי MCF10A הם תאי אפיתל החלב שאינו ממאירים. כאשר גדלו במטריצת קרום במרתף, תערוכת תאים אלה בתכונות vivo של תאי שד נורמלים ועוברים בשליטת התפשטות תאים, קיטוב תא, ואפופטוזיס להקים מרחב הלום 8,12,20. יתר על כן, הופעתו של גרעין תא של תאי MCF10A להרכיב acini בתרבויות 3D דומה יותר לאלו של תאי אפיתל החלב ברקמה מאלה בתרבית monolayer 21. מחקרים על ידי יסל ועמיתיו היו הראשונים לחשוף שיכולים להיות מובחנים תאי שד ממאירים מתאי שד אינו ממאירים כאשר גדלו בסביבת laminin עשיר, שכן התאים הממאירים להציג פנוטיפ לא מאורגן מאוד, גדל בהתפשטות, ירידה בתא אל הידבקות תא, ביטוי מוגבר של סמני mesenchymal וגידול במספר של מבנה פולשנית נוצרו 3,6,22.

חריגות של סביבת התא יכולות להשפיע על היווצרות גידול 20. שיטת תרבות 3D יכול לשמש כדי לחקור ביעילות את התקשורת המתרחשת בין התאים הסרטניים וסביבתם ולקבוע כיצד 14,20,21,23 תקשורת כגון השפעות ביטוי חלבון. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדול מד"א-MB-231 תאי סרטן השד בתרביות 3D לנתח הפולשנות, וללמוד את האובדן של מורפולוגיה האפיתל באמצעות laminin סמן אפיתל, מרכיב של הקרום במרתף תא 18,19,24, 25. הנהלים מפורטים לספק את היכולת במדויק וreproducibly לכמת stellate היווצרות מבנה (פולשנית) על ידי כל תא סרטן פולשני ולא מגבילה לשורות תאי סרטן שד השכיח (כגון מד"א-MB-231, Hs578T, MCF-7, או T47D ). לפיכך, assay זה יכול לשמש כפלטפורמה להערכה איך ביטוי חלבון בתאים או בטיפול בפרו או אנטיתרכובות פולשנית להסדיר השפלה מטריצה ​​תאית, על ידי תאים בודדים או מרובים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבות תלת ממדית של תאי סרטן השד בממברנה מטריקס מרתף (טכניקת Embedment)

  1. מטריצת קרום במרתף טיפול Matrigel: הפשירו על קרח לילה בשעה 4 ° C. מטריצת קרום במרתף היא נוזלית בטמפרטורה נמוכה, אבל מתמצקת בטמפרטורת חדר. שמור על מטריצת קרום במרתף על קרח (1A-B איורים).
  2. מכסה את צלחת Confocal מס '1 זכוכית תחתונה עם 50 μl של מטריצת קרום מרתף באמצעות הפצת המטריצה ​​באמצעות קצה Pipetman P-200 בתבנית ספירלה (איור 1 ג). היזהר בעת הפצת מטריצת הקרום במרתף, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. כמו כן, להימנע מלהפיץ את המטריצה ​​כדי לסגור את גבולותיה של צלחת הזכוכית תחתונה כדי למנוע היווצרות מניסקוס. אם מטריצת קרום במרתף טיפול חסר ניסיון, אז precooled הצלחת, P-200 Pipetman וטפטפות יכולה להיות על קרח (משמאל לחלופין הלילה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס). הצעות צעד זהזמן נוסף כדי להפיץ את מטריצת קרום במרתף לפני ההתמצקות. מניחים את הצלחת (ES) בתרבית תאי חממה (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) לפחות 30 דקות כדי לאפשר את מטריצת קרום במרתף כדי לחזק (1D איור).
  3. בעוד המטריצה ​​עוברת מיצוק, trypsinize 70-80% צלחת 100 מ"מ מחוברות של תאים. ברגע שהתאים החלו מרימים את הצלחת, resuspend אותם ב10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני המכיל 10% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), כדי להשבית טריפסין (איור 1E). לאחר מכן להעביר את תאי resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר (איור 1F).
  4. ספין התאים (הנמצאים בצינור חרוטי) בשעה 3 דקות 100 XG בצנטריפוגה בתרבית תאים ייעודית (איורים 1G-H).
  5. בעוד שהתאים נמצאים הסתחררו למטה, aliquot 50 μl של מטריקס לתוך צינור מיליליטר 1 microcentrifuge (הערה: כל מנה עם רצפת זכוכית מוקצה צינור microcentrifuge אחד, ולכן, אםהניסוי דורש 3 מנות, אז המסקנה הוא ש3 צינורות microcentrifuge נחוצים גם כן), ולאחר מכן למקם את הצינור על קרח (איור 1).
  6. לשאוב את המדיום מצינור חרוטי משלב 1.4, תוך השארת גלולה ללא הפרעה (איור 1I). תאי resuspend (כי כבר הסתחררו למטה) ב 1 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת-FBS (איור 1J).
  7. ברגע שהתאים נספרים באמצעות hemocytometer (איור 1K), או aliquot חלקיקי דלפק תא 2.5 x 10 4 תאים לתוך צינור microcentrifuge והדיפו אותה באמצעות תקשורת המתאימה כדי להשיג נפח כולל של 50 μl (איור 1 ליטר).
  8. מערבבים את התאים מצעד 1.7 (25,000 תאים ב50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה ​​מצעד 1.5 ביחס של 1:1; נפח סופי יהיה 100 μl (איור 1M).
  9. בעדינות צלחת של המטריצה ​​100 μl: תערובת תאים מצעד 1.8 על יםמנה olidified קרום במרתף מצופה מטריצה ​​מהשלב 1.2 (איור 1N). זה מאפשר לתאים להיות משובצים במטריצת קרום במרתף.
  10. מעביר את הצלחת (es) לתוך חממת תרבות תא (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) ולאפשר למטריקס: תערובת תא כדי לחזק לפחות 30 דקות.
  11. ברגע שהמטריצה: תערובת תא הקרושה, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת-FBS לצלחת (איור 1o) ולקחת את הצלחת בחזרה החממה שבה יאוחסן לשארית של הניסוי (איור 1P).
  12. שינוי בתקשורת בכל יום לתקופה של 5 ימים (או כמו לכל נדרש לassay; משך assay למד"א-MB-231 תאים הוא 5 ימים באורך).
  13. באמצעות מיקרוסקופ אור, לקחת התערבות ההפרש לעומת זאת תמונות (DIC) של מושבות מד"א-MB-231 התלויות במטריצת קרום במרתף (איור 3 א). 20 אזורי נציג התמונה ב10X אובייקטיבי פעם ביוםבמשך חמישה ימים כדי לקבוע המורפוגנזה מושבה (איור 3 ג).
  14. ניתוח תמונות בצורה עיוורת כדי לקבוע היווצרות stellate מושבה תא (איור 3 ב). מושבה נחשבת להיות stellate אם תחזיות אחד או יותר מאליפטית של תאים נתפסות. כדי לקבוע את אחוז מושבות stellate פולשנית, יש לחלק את מספר מושבות stellate במספר הכולל של תא מושבות לכל תמונה שנרכשה, ולאחר מכן בממוצע אחוזי מושבות stellate של 20 תמונות עבור כל יום.

figure-protocol-1
איור 1. תרבות תלת ממדית של מד"א-MB-231 תאי סרטן השד במטריצת קרום במרתף (טכניקת embedment). א.ב.) סכמטי של הגדרת הניסוי (שבוצעה במנדף). ג) גם של המנה עם תחתית הזכוכית המצופהעם 50 μl של מטריצת קרום במרתף נטוורק. ד) (ES) ממוקם בחממה תרבות תא (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) על מנת לאפשר את מטריקס לבסס לפחות 30 דקות תאים. ה) היו trypsinized. F ) תאים היו resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר תאים. GH) (כיום בצינור חרוטי) היו סובבים מטה ב100 XG במשך 3 דקות בצנטריפוגה בתרבית רקמה.) תא גלולה תאים. J) (כי כבר הסתחררו למטה) היו resuspended ב 1 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת-FBS. תאי K) נספרו באמצעות hemocytometer. L) 2.5 x 10 תאים 4 aliquoted לתוך צינור microcentrifuge ועקפו את השימוש במדיה מתאימים בכדי להשיג נפח כולל של 50 μl. M ) מערבבים תאים מצעד 1.7 (25,000 תאים ב50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה ​​מצעד 1.5 ביחס של 1:1; נפח סופי יהיה 100 μ.; L N) בעדינות צלחת של המטריצה ​​100 μl: תערובת תאים משלב 8 על הצלחת מצופה מטריצה ​​הקרושה משלב 1.2 O) ברגע שהמטריצה: תערובת תא הקרושה, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת-FBS ל. המנה. P) מניחים את הצלחת בחממה שבה תאוחסן לשארית של הניסוי.

2. בחינת תכונות morphogenic של תרבויות 3D עם Immunofluorescence

  1. הגדר את מגש קרח, פתרון שנאגרו פוספט הקר (PBS), אצטון 20%: מתנול 80% (פתרון מקבע), ו -3% אלבומין בסרום שור (BSA; חסימת פתרון) (איור 2 א) לפני שלקחת את המנה (ES) מן החממה.
  2. מניחים את הצלחת (ES) בתקשורת מגש הקרח ולשאוב, ולאחר מכן לשטוף 3x עם 2 מיליליטר של PBS הקר (איור 2).
  3. ברגע לשטוף PBS האחרון להישאף, להוסיף 2 מיליליטר של אצטון 20%: 80% פתרון מתנול לתוך הצלחת (es) (איור 2C (איור 2 ד).
  4. ברגע ש20 דקות קיבוע הוא הופסק, להביא את המנות בחזרה בטמפרטורת חדר, לשאוב מקבע, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS. ברגע לשטוף PBS הסופי להישאף, להוסיף 2 מיליליטר של BSA 3% למנה (es) לחסום לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר (2E איור).
  5. במהלך תקופת החסימה להכין דילולים של (V laminin 1:100) הראשוני ונוגדנים משני (בדילול מתאים) מומסים ב3% אלבומין בסרום שור (BSA) חסימת חיץ. אנא שים לב כי 400-500 μl הפתרון 'BSA + נוגדן ראשוני' יש להוסיף על גבי המטריצה ​​ישירות: תערובת תא.
  6. לאחר דקות 30 של חסימה שפגו תוקפיו, מוסיף את הנוגדנים הראשוניים ודגירה במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר (איור 2F). שים לב שאין שוטף PBS צריך להתבצע הבא blockin 30 דקותתקופה גרם.
  7. עם השלמת השלב 2.6, להסיר את הפתרון 'BSA + עיקרי נוגדנים', ולשטוף 3x עם PBS.
  8. מוסיף את הנוגדנים משני מומסים בBSA 3% (בדילול מתאים) ישירות על גבי המטריצה: תערובת תא, מכסה את הכלים ודגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר (איור 2G).
  9. הסר את פתרון 'BSA + נוגדנים משני', ולשטוף 3x עם PBS.
  10. הוסף 2 מיליליטר של Hoechst 33258 (1:10,000) מומס PBS עבור מכתים גרעינים, ודגירה של 5 דקות בנייר אלומיניום (או מכסים במכל אטום להגביל photobleaching) (איור 2H).
  11. לאחר 5 דקות של דגירה עם 33258t Hoechst פקעו, לשטוף את הצלחת (es) 5x עם PBS.
  12. הוסף בינוני הרכבה ישירות על גבי מטריצה: תערובת תאים בצלחת confocal ולכסות עם coverslip זכוכית בזהירות כדי למנוע גרימת כל שיבושים ביושרה של המושבות במתרי קרום במרתףx: תערובת תא (איור 2 ט).
  13. לאפשר את הצלחת (ES) לייבוש למשך לילה (או 24hr) בטמפרטורת חדר (איור 2 ט). לאחר יבש, הצלחת (es) יכולה להיות מאוחסנת ב -20 מעלות צלזיוס, אבל זה מאוד מומלץ כי הם צריכים להיות צילמו במהירות אפשרית.
  14. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אורכי גל לייזר מתאימים של נוגדנים המשמשים (איורים 3D-E).

figure-protocol-2
איור 2. בחינה של תרבויות 3D על ידי immunofluorescence. .) סכמטי של הגדרת ניסוי כלים ב) (ES) שהונח על מגש הקרח ותקשורת להישאף; לאחר מכן תאים נשטפו שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של PBS הקר C) 2 מיליליטר של אצטון 20%:. 80% פתרון מתנול הוסיף למנה () es ד ') לתקן את התאים ל.20 דקות ב 4 ° C (או על קרח, או במקרר). E) 2 מיליליטר של BSA 3% הוסיפו למנה () es לחסום לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. F) לאחר דקות 30 של חסימה פקעה, מוסיף את הנוגדנים הראשוניים ודגירה במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר G) נוגדנים משניים מומסים בBSA 3% (בדילול מתאים) נוספו על גבי מטריצת הקרום במרתף ישירות:. תערובת תא; . לאחר מכן מנות מכוסות וטופחו במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר H) 2 מיליליטר של Hoechst (1:10,000; מומס PBS) הוסיף לdishe (ES) והתאים טופח במשך 5 דקות בנייר אלומיניום הבינוני) הרכבה הוסיף באופן ישיר. על גבי המטריצה: תערובת תאים בצלחת confocal והצלחת מכוסה בזכוכית coverslip. מנה (es) עזבה לייבוש למשך לילה (או 24hr) בטמפרטורת חדר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמא של תאי מד"א-MB-231 הפולשים במטריקס 3D מתואר באיור 3 ג. התאים משובצים במטריצה ​​(יום 1), ולהתחיל להרכיב מבנים פולשנית (stellate) על ידי יום 3, ולפלוש לחלוטין לתוך המטריצה ​​ביום 5 (איור 3 ג). מספר מושבות stellate נוצרות נספרים, והביע כאחוז ממספר הכולל של מושבות בכל צלחת (חודרניות ולא פולשנית). בנוסף, מאז מדידות נעשות מדי יום במשך חמשת הימים, שיעור החדירה יכול גם להיות מוערך.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של טכניקות תרבית תאי 3D אפשר לחוקרים ללמוד את השינוי של תאי אפיתל שד, ומאפשר לנו לחזות את השינויים מורפולוגיים הדרמטיים. חוץ מניתוח פלישת תא, יכולים לשמש הספרואידים אפיתל החלב היחיד או רב תאיים כדי להעריך את השינויים בהידבקות הסלולר, התפשטות, גודל, וקוטביות הבזליים-apical. בניגוד לשיטות שדווחו בעבר שבו התאים הם כיסו עם ECM 8, השיטה שלנו מטביעה את התאים בECM 18,19,24, המאפשר לפלישת multidirectional לכימות. מודלים אלה התרבות החדשניים 3D לאפשר לחוקרים ללמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו בוצעה במימון M.B. ממענק MOP 107972 של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). M.B. הוא זוכה בפרס שכר חוקר חדש של CIHR. וושינגטון הוא זוכה מלגות מהיחידה לחקר סרטן השד התרגומי ותוכנית ההכשרה האסטרטגית של CIHR בחקר סרטן והעברת טכנולוגיה, תוכנית הסרטן האזורית של לונדון. C.G. הוא זוכה מלגות מהיחידה לחקר סרטן השד התרגומי, תוכנית הסרטן האזורית של לונדון ומתוכנית ההכשרה האסטרטגית של CIHR בחקר הסרטן והעברת טכנולוגיה. SGD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות 1.5 מ"לVWRCA10011-700צלחת תרבית סטרילית, חד פעמית
100 מ"מ BD353003VWRCABD353003סטרילית, חד פעמית
15 מ"ל שפופרת פלקוןVWRCA21008-918סטרילית, חד פעמית
1 מ"ל טיפים מסונניםVWR10011-350סטרילי, חד פעמי
200 & #956; l טיפים מסונניםVWR22234-016סטרילי, חד פעמי
20 & # 956; l טיפים מסונניםVWR22234-008סטריליים, חד פעמיים
עם תחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ MatTek CorporationP35G-1.0-14-Cמקורר מראש לפני השימוש
אלבומין בסרום בקר (BSA)BioShopALB003.100בשימוש ב-3% עבור
IF Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) נוגדן, ספיחה צולבת גבוההLife Technologies  A110291:250 עבור IF
Alexa Fluor 568 עזים נגד ארנב IgG (H+L) טכנולוגיות חיים של נוגדנים  A110111:1,200 עבור
IF אנטי-בטא-קטנין BD Transduction Laboratories610153עכבר-חד-שבטי; בשימוש ב-1:100 עבור
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaF1051בשימוש ב-10% (v/v) 
Hoechst 33258, פנטהידראט (ביס-בנזמיד) - 10 מ"ג&פרסל; תמיסת מ"ל ב-WaterLife TechnologiesH3569בשימוש ב-0.1% (דילול של 1:10,000)
InVivo Analyzer Suite קיברנטיקההמשמשת להדמיית תרבית תלת-ממדית (תמונות DIC ב-10X ו-40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)EZ BiolabsPT0512100601בשימוש ב-100 ננומטר 
אנטי למינין CedarlaneAB19012(CH)ארנב-רב-שבטי אנושי באורך מלא; משמש בשעה 1:100 עבור
מיקרוסקופ סריקת לייזר IF LSM-510 META Zeissבשימוש באובייקטיביות של 63X; עדשת טבילה בשמן
Matrigel פנול אדום חופשי (BD356237)VWRCACB356237  פריט מס' 2180819; 10.4 מ"ג/מ"ל
מיקרוסקופ אולימפוס IX-81 אולימפוסמשמש להדמיית תרבית תלת מימד (תמונות DIC ב-10X ו-40X)
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140-122אנטיביוטיקה (נוספה למדיה; בשימוש ב-0.01%)
10 מ"ל פיפטהVWRCA53300-523סטרילי, חד פעמי
RPMI 1640 מדיום עם GlutamineLife Technologies11875-119משמש לתרבית של תאי
MDA-MB-2310.25% טריפסין-EDTA (1x), Phenol RedLife Technologies25200-072משמש לטריפסיניזציה של תאי MDA-MB-231
MEGM (ערכת כדורים): MEBM (CC3151) + מרכאות בודדות (CC4136)LonzaCC-3150משמש לתרבית של תאי MCF10A
כלי תרבות קונפוקליים מס' 1 של מדיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  4. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
  5. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
  6. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  7. Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  9. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
  10. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
  11. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
  14. Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
  15. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  16. Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
  17. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
  18. Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
  19. Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
  20. Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
  21. Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
  22. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
  23. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
  24. Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
  25. Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3D Invasion AssayBreast Cancer CellsBasement Membrane MatrixLight MicroscopyImmunofluorescent MicroscopyStellate Colony FormationMDA MB 231 CellsECM Protein LocalizationCell Culture IncubatorFluorescent Antibody Staining

מאמרים קשורים