פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Summary

נגיף הפטיטיס C (HCV) הוא פתוגן אנושי עיקרי הגורם להפרעות בכבד, כולל שחמת וסרטן. מערכת תרבית תאים זיהומית HCV חיונית להבנת המנגנון המולקולרי של שכפול HCV ולפיתוח גישות טיפוליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחקירת שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

Abstract

וירוס הפטיטיס C (HCV) משפיע על 3% מאוכלוסיית העולם של וגורם למחלות חמורות בכבד כולל צהבת כרונית, שחמת הכבד, וקרצינומה hepatocellular. HCV הוא נגיף RNA אפף השייכת למשפחה Flaviviridae. טיפול הנוכחי אינו יעיל באופן מלא וגורם לתופעות לוואי שליליות. אין חיסון HCV זמין. לפיכך, מאמץ המשיך נדרש לפיתוח חיסון וטיפול טוב יותר. מערכת תרבית תאי HCV היא קריטית ללימוד שלבים שונים של צמיחת HCV כוללים כניסת ויראלי, שכפול הגנום, אריזה, ויציאה. בהליך הנוכחי שהוצג, השתמשנו וירוס 2a intragenotype פראי מסוג chimeric, FNX-HCV, ווירוס רקומביננטי FNX-Rluc נושא גן כתב לוציפראז Renilla ללמוד את שכפול הנגיף. שורת תאי hepatoma אדם (מבוסס הא-7) שימשה עבור transfection של במבחנה עיבד RNAs גנומית HCV. supernatants תא ללא תרבות, lysates חלבון ולאRNA סך נקצרו בזמן שונים מציין שלאחר transfection להעריך צמיחת HCV. מעמד שכפול הגנום HCV הוערך על ידי RT-PCR ופעמים תקועים RNA לדמיין את הנוכחות של HCV. ביטוי חלבון HCV אומת על ידי מבחני כתם וimmunofluorescence מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבוני HCV NS3 וNS5A. תאי transfected RNA HCV שוחררו חלקיקים זיהומיות לsupernatant התרבות וכייל הנגיף נמדדו. מבחני לוציפראז נוצלו כדי להעריך את רמת השכפול והדבקה של HCV כתב. לסיכום, אנו מציגים מבחני virological שונים לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

Introduction

וירוס הפטיטיס C (HCV) גורם לשחמת כבד וסרטן כבד. זה משפיע 170 מיליון אנשים ברחבי העולם עם 350,000 אנשים מתים מדי שנה ^1-3. HCV הוא נגיף RNA גדיל חיובי עם גודל הגנום של 9.6 kb. הגנום HCV מתורגם כמו polyprotein יחיד של ~ 3,000 שאריות חומצת אמינו שהוא ביקע proteolytically ידי פרוטאזות נגיפיות סלולריות שונות ל10 פוליפפטידים. HCV הוא נגיף אב הטיפוס בסוג Hepacivirus ושייך למשפחה של ⁴ Flaviviridae. עם החשיפה, HCV קובע זיהום כרוני ב80% מהאנשים. הזיהום הוא בעיקר ללא תסמינים בזמן אבחון יכול לאפשר התערבות טיפולית כדי למנוע הידרדרות בכבד. טיפול הנוכחי הוא הכי מוצלח ואין חיסון זמין ^5,6.

אטיולוגיה של הפטיטיס C תוארה לראשונה בשינה 1989 ^7. לימוד שכפול HCV חשוב לחיסון הצהבת מסוג C ומחקר טיפול, אבל זה היההקשו עוד על ידי חוסר של מערכת תרבות ויראלי יעילה. שיבוט מולקולרי של HCV הוצג להיות מידבק שבימפנזים על חיסון intrahepatic ^8. בהמשך לכך, replicons HCV תת גנומי תוארו, שאיפשר לנתח את שלב שכפול הגנום הנגיפי ^ב9,10 מערכת תרבית תאים. גילוי של HCV גנוטיפ 2 א לבודד JFH-1 (הפטיטיס-1 המוחלט של התפקודי היפני), מסוגל להדביק תא תרבות פתח אפיקים חדשים למחקר שכפול HCV ^11-13. מתח 2a גנוטיפ JFH-1 וירוסי chimeric בין ותוך genotypic וHCV גנוטיפ 1 מערכות מבוססות תרבות זיהומיות המבוססות זמינות גם כן ^14-18.

אנחנו השתמשנו בהצלחה זן JFH-1 ווירוס chimeric 2a intragenotype HCV לך את מפת האפיון פונקציונלי ברזולוציה הגבוהה של תחומים חלבון וcis-מתנהגים אלמנטים RNA ^19,20. לפי זה, כאן אנו מתארים מערכת תרבות יעילה בשימוש באופן שיגרתי המאפשרתלומד שלבים שונים של מחזור שכפול HCV והאינטראקציה המאכסן לפתוגן. אנו מציגים מבחני virological להעריך שכפול הגנום נגיפי וinfectivity נובו דה של HCV 2a intragenotype וHCV כתב מבוסס לוציפראז Renilla.

Protocol

מתווה כללית של הפרוטוקול מתואר באיור 1.

1. תאים

1. הכן תקשורת צמיחה מלאה שמכילה 10-15% בסרום שור העובר (FBS), 10 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 10 HEPES מ"מ, פניצילין (100 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (100 מ"ג / מיליליטר), ו2 מ"מ L-גלוטמין.
2. לשמור על הא-7.5.1 תאים ¹³ בתקשורת צמיחה מלאה המכילה תוספים מעל לניתוח במבחנה של מחזור שכפול נגיפי צהבת מסוג C.
3. זנים נגיפיים תרבות הא-7.5.1 תאים עם צוינה תקשורת צמיחה בתוספת ב-C ° 37 עם 5% CO _2.

2. וירוס והבונה פלסמיד

1. ליצור את הצורה המשלימה DNA (cDNA) של HCV RNA ולשכפל אותו לוקטור פלסמיד על מנת להקל על מניפולציה גנטית. הערה: גילוי הצהבת המוחלטת של התפקודי היפני 1, JFH-1 (HCV גנוטיפ 2 א), לבודד כבר קריטי למחקר HCV והואבעיקר שימוש ללמוד ^11-13 מחזור השכפול של HCV. וירוסי chimeric אינטר וintragenotypic מבוססים על HCV JFH-1 נמצאים בשימוש נפוץ במחקר ^14-18. בנייה של וירוס 2a intragenotype הסינתטי chimeric, FNX-HCV, ומתח כתב chimeric monocistronic תוארה בעבר ¹⁹ ובניית פרטים הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
2. השתמש בוירוס 2a intragenotype pFNX-HCV כפי שהוא מכיל 5'NTR, אזורים מבניים וP7, וחלק מהאזורים שאינם מבניים NS2 (נוקלאוטידים 1-2,878) של הזן ההורי J6CF (הצטרפות צמח השדה לא. AF177036), כפי גם הרכיבים שאינם מבניים של זן JFH-1 הנגיפי (הצטרפות צמח השדה לא. AB047639). הערה: FNX-HCV היה מסונתז המבוסס על הרצף של HCV chimeric 2a intragenotype JC1 שדווח בעבר ^15.
3. ליצור מבנה monocistronic chimeric כתב ויראלי, pFNX-Rluc, המבוסס על זן pFNX-HCV (לעיל בשלב 2.2) על ידי החדרת Rגן בלוציפראז enilla בין 5 'NTR וגן הליבה (בין NT 388 ו389). בהמשך לכך, חבר את הגן בלוציפראז וגן ליבה של מבנה זה באמצעות 2A הפה וטלפי וירוס מחלת רצף (F2A) פפטיד, שיפעל כאות מחשוף.
4. מהנדס הקונסטרוקציה נגיפית פולימראז-null RNA (Pol-) או באמצעות pFNX-HCV או על רקע ויראלי pFNX-Rluc. החלף את שאריות קטליטי פולימראז NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8,623), של אחד מעמודי תווך ויראליים עם שאריות חומצת אמינו AAG.

3. שעתוק במבחנה RNA HCV

1. השתמש בנגיף HCV-FNX chimeric 2a intragenotype וnull FNX-HCV Pol HCV (Pol-) להערכה של שכפול נגיפי (איור 2 א).
2. Linearize פלסמידים ויראלי עם אנזים הגבלת XbaI ולאחר מכן לטפל עם nuclease שעועית מונג כדי ליצור קצוות קהים. לטהר את פלסמידים מתעכלים על ידי כרומטוגרפיה אניון-Exchange. לוודא את התקינות of לינארית פלסמיד על ידי חשיפת הדנ"א לagarose ג'ל אלקטרופורזה (איור 2).
3. לתמלל פלסמידים נגיפיים לינארית באמצעות פולימראז T7-RNA.
4. לטהר את RNA שטופלה DNase מסונתז החדש באמצעות ערכת טיהור RNA.
5. ודא ייצור RNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 2 ג).
6. לכמת את הרנ"א על ​​ידי ספקטרופוטומטר.
7. אחסן את RNA שנוצר ב-80 מעלות צלזיוס ב10 מיקרוגרם aliquots עובדים. הערה: כדי למזער את הווריאציה של איכות RNA בתוך כל עיצוב ניסיוני על ידי תמלול כל RNA עבור כל דגימה ובקרה נגיפיות באותו הזמן.

4. HCV RNA Transfection ואוסף דוגמאות

1. לקצור את הא-7.5.1 התאים באמצעות טריפסין.
2. כדי לשטוף את התאים, צנטריפוגה ו resuspend ההשעיה פעמיים עם תקשורת בסרום נמוכה קרה. Resuspend התאים בתקשורת בסרום נמוך ב1 x 10 ⁷ תאים לכל מיליליטר.
3. מערבבים בסך הכל 10 & #956; גרם של רנ"א הנגיפי עיבד עם 400 μl של תאי resuspended (4 x 10 ⁶ תאים) בקובט electroporation 0.4-סנטימטר. Transfect התאים באמצעות electroporation ב270 V, 100 Ω, ו950 μF.
4. Resuspend תאי electroporated ב10 מיליליטר תקשורת צמיחה להשלים עם FBS 15%. הערה: הישרדות מוגברת של תאי electroporated נתפס כאשר הא-7.5.1 התאים בתרבית ב15% שור סרום עוברי.
5. פלייט התאים בשני T-25 צלוחיות (~ 1.2 x 10 ⁶ תאים לכל בקבוק) וצלחות 48 היטב (1 x 10 ⁴ תאים לכל היטב) לכל אחת מנקודות הזמן הבאות: 4, 48 ו96 שעה.
6. החלף את המדיה ב4-8 לאחר transfection שעה עם תקשורת צמיחה בתוספת טרי עם 10% FBS כדי להסיר שאריות תאים מתות מהצלוחיות וצלחות תרבית.
7. supernatants תרבית תאי קציר ב48, 96 נקודות זמן שעה ולהסיר פסולת הסלולר מדגימות שנאספו על ידי צנטריפוגה תאים ב1,500 סל"ד 10 דקות ב 4 º C.
8. אחסן את supernatants התא ללא ב -80 º C. Lyse התאים לחלבון וניתוח הרנ"א על ​​ידי כתם מערבי ולהפוך PCR שעתוק כמותית בנקודות הזמן שצוינו.

5. הפוך תמלול-PCR (RT-qPCR) להערכת עותקי HCV הגנום

1. בצע שני שלבים RT-qPCR כדי לקבוע את מספר עותק RNA הגנומי HCV.
2. לתעתק הפוך 1 מיקרוגרם של רנ"א הסלולרי הכולל באמצעות טרנסקריפטאז הפוך ופריימר ספציפי לגדיל תחושת HCV שנקשר ל5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ") או פריימר ספציפי לisomerase peptidylprolyl גן המשק G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 "). גם להפוך לתמלל FNX-HCV RNA (שנוצר בשלב 3) של עותקים ידועים הגנום ^{(1 אוקטובר} - ^{9 אוקטובר} סטנדרטי) באמצעות פריימר גדיל תחושת HCV.
3. לבצע qPCR באמצעות 50 ננוגרם של cDNA עיבד וכתוצאה מכך שימוש בפריימרים ספציפיים HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ") וה-DNA מחייב צבע ירוק המכיל תערובת סופר qPCR. בצע qPCR לPPIG גן המשק, כמו גם (פריימרים PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 ") הערה: לחישוב רמת RNA HCV תאיים מדויקת על פני דגימות, השתמש גן משק סלולארי, PPIG , רמת ביטוי (מחזור CT) לנורמליזציה. השתמש במספר העותק של הגנום FNX-HCV כתקן לקביעת מספר עותקים.
4. השתמש בתנאים הבאים בעת הרצת qPCR לקבוע עותק RNA HCV מספר: 95 º C ל15 שניות ו60   º C במשך 30 שניות (40 מחזורים) שימוש במערכת ה-PCR בזמן אמת.
5. ראה 3A דמויות ו3B לתוצאות שכפול הגנום.

6. מערבי ניתוח סופג לזיהוי ביטוי חלבון HCV (איור 3 ג)

1. השתמש fr lysates התארנ"א הנגיפי אום transfected ב96 ההודעה hr transfection לניתוח מערבי סופג חלבון.
2. לפתור את lysate התא באמצעות SDS-PAGE והעברה לdifluoride polyvinylidene קרום (PVDF).
3. חסום את הממברנה באמצעות פתרון חסימה המכיל חלב דל שומן 5%, 0.2% Tween 20 בופר פוספט (PBS).
4. דגירה הממברנה עם נוגדן חד שבטי עכבר העיקרי NS3 (1 ב1,000 דילול) ובטא אקטין (1 ב5,000 דילול).
5. הוספת IgG אנטי עכבר העז מצומדת לחזרה peroxidase (1 ב5,000 דילול) ולזהות על ידי chemiluminescence.

7. Immunofluorescence Assay (IFA)

1. תקן את התאים וtransfected נגוע HCV באמצעות מתנול למשך 30 דקות במעלות צלזיוס -20 עבור assay immunofluorescence.
2. שטוף את התא עם PBS שלוש פעמים ולחסום עם IFA חסימת מאגר.
3. השתמש polyclonal ארנב נגד NS5A נוגדנים בעיקר (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר Dasgupta, UCLA) או עכבר חד שבטי אנטי DSRJ2 NA נוגדנים בדילול של 1:200 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה במשך 5 שעות לשעת 4 בלילה º C.
4. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר שהנוגדן הראשוני.
5. הוסף נוגדן עז נגד ארנב IgG-488 polyclonal משנית או עז אנטי עכבר IgG-594 נוגדנים משני polyclonal בדילול 1:1,000 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
6. שטוף תאים עם PBS שלוש פעמים וגרעיני כתם באמצעות צבע Hoechst ולהציג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3D).

8. כייל נגיף מדידה

1. הא-7.5.1 תאים נאיביים פלייט תאים בכ 3 x 10 ³ / גם באמצעות צלחת 96 היטב. למחרת, לבצע דילולים סדרתי של פי 10 של supernatant תרבות תא ללא נקטף מן תאי transfected RNA HCV באמצעות תקשורת צמיחה ולחסן בשלושה עותקים על הא-7.5.1 תאים.
2. תקן את התאים ב72 לאחר זיהום שעות באמצעות מתנול (ל30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס) וimmunostain לחלבון NS5A HCV כאמור בסעיף 7.
3. השתמש בדילול הגבוה ביותר לספור למוקדים החיוביים NS5A ולחשב את המספר הממוצע של יחידה ויוצרת מוקד (FFU) למיליליטר. ראה איור 4 לכייל HCV.

9. Renilla בלוציפראז כתב Assay עבור ויראלי הגנום שכפול וInfectivity

1. להערכת שכפול נגיפי הגנום, הא-7.5.1-תאי electroporated RNA HCV הצלחת בשלושה עותקים בצלחות 48 היטב (1 x 10 ⁴ תאים / טוב).
2. Lyse התאים עם 75 μl של חיץ תמוגה הפסיבי בשעה 6, 48 שעות, ו96 לאחר transfection שעה.
3. רוק הצלחות בעדינות ל15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחסן ב -80 º C.
4. כדי למדוד את הפעילות האנזימטית לוציפראז Renilla, להפשיר lysate החלבון וריאגנטים assay לוציפראז Renilla לטמפרטורת חדר.
5. הוסף 20 μl של lysate חלבון לכל טוב של 96-wel צלחת הארה לבנה ליטר ולמקם את הצלחת בluminometer.
6. לוותר של מגיב assay לוציפראז Renilla (מצע coelenterazine + חיץ) לכל טוב ולאחר עיכוב מראש לקרוא 2 שניות 100 μl; לשלב את האור הנפלט ל10 שניות.
7. לחשב את הממוצע וסטיית התקן עבור כל דגימה מערכי לוציפראז של triplicates הביולוגי ולהכפיף את הנתונים לניתוח סטטיסטי (איור 5).
8. להערכת infectivity, לחסן 500 μl של supernatant תא ללא המתקבל מתאי transfected RNA HCV לנקודות שצוינו הזמן (48 שעות ו96 hr) בשלושה עותקים על הא-7.5.1 תאים נאיביים בצלחות 48 היטב.
9. החלף את הבידוד הנגיפי עם 500 μl של מדיום חדש לכל גם אחרי 6 שעות שלאחר זיהום.
10. Lyse התאים ב48 שעות שלאחר זיהום וכפוף לassay לוציפראז Renilla כמתואר בשלבי 8.2-8.7 (איור 5).

itle "> 10 ניתוח סטטיסטי.

1. הברים השגיאה בגרפים מצביעים על סטיות תקן (SD). ערכי P חושבו על ידי מבחן t מזווג.

Results

נגיף הפטיטיס C הוא וירוס RNA. כך למטרה מניפולציה גנטית, cDNA גנומי HCV כבר משובט לתוך וקטור פלסמיד חיידקים. רצף אמרגן RNA פולימראז T7 הוצג מייד לפני סוף '5 של הגנום HCV. מתווה כללית של עבודה ניתוח HCV מוצגת באיור 1. כדי לייצר RNA הגנומי HCV עם הסוף מדויק 3 ', הגנום HCV המכיל פלסמיד הוא חתך עם אנזים הגבלת Xba אני והסככה חד גדילים שנוצרה הייתה קהה עם עיכול nuclease שעועית מונג . איכות פלסמיד HCV ינארית הוערכה על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 2)....

Discussion

איור זה מתאר שיטה לניתוח מחזור השכפול של וירוס הצהבת מסוג C. HCV הוא הפתוגן אנושי ופרוטוקול הבטיחות הביולוגי שנקבע יהיה חייב להיות אחריו בקפדנות. מערכות תרבות זיהומיות HCV תא תוארו בעבר ^11-13,16,17. יש כמה נקודות קריטיות שאנחנו ליישם כאשר בעקבות הפרוטוקול המאויר. ראשית, זה הוא בעל חשיבות גבוהה שיש באיכות טובה של רנ"א הנגיפי שלם באורך מלא גנומי ללימודים במורד הזרם. פלסמיד שנשא הקלט cDNA הנגיפי צריך להיות לינארית והקהה בזהירות. Nuclease מונג השעועית מועסק כדי להקהות ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM)	פישר סיינטיפיק	10-017-CV
חומצת אמינו לא חיונית	פישר סיינטיפיק	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM סרום מופחת בינוני, ללא פנול Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1		המחקר סקריפס	קו התאים סופק באדיבות על ידי ד"ר פרנסיס צ'יסארי לד"ר ארומוגסוואמי תחת MTA שבוצע בין מכון המחקר סקריפס לבין הפלסמידים של המרכז הרפואי Cedars-Sinai
(pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc ו-pFNX-Rluc Pol null)		הרפואי Cedars-Sinai	הפלסמידים של HCV סונתזו על ידי ד"ר ארומוגסוואמי באמצעות אוליגו-נוקלאוטידים חופפים.
XbaI	ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ	R0145S
מונג שעועית נוקלאז	ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ	M0250S
T7 RiboMAX אקספרס מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדול	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 מ"מ)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
נוגדן חד שבטי נגד dsRNA J2	אנגלית & ייעוץ מדעי Kft.
עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF חבילת ממברנה	Bio-Rad	162-0263
חוסם כיתה ספיגה חלב יבש ללא שומן	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
נוגדן נגד נגיף הפטיטיס C NS3 [8 G-2]	Abcam	ab65407
נוגדן נגד נגיף הפטיטיס C NS3 [H23]	Abcam	ab13830
עז נגד עכבר IgG מצומד עם חזרת פרוקסידאז (HRP)	מעבדות ג'קסון אימונו-מחקר בע"מ	115-035-003
אמרשם ECL פריים ווסטרן ריאגנטים לזיהוי כתמים	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמת	Life Technologies	ערכת
Renilla Luciferase	Promega	E2810
DNase Promega		M6101
GloMax-Multi Detection System (לומינומטר)	פרומגה