שיטות להקלה על גידול חיידקים בזרמי פסולת של טחנות עיסת ואפיון פוטנציאל הפירוק הביולוגי של חיידקים מתורבתים

סיכום

ניתן לאסוף פסולת תעשייתית ולשנות אותה כדי לנתח צמיחה מיקרוביאלית. טכניקות מיצוי ליגנוצלולוז מספקות רכיבים לניתוח יכולת פירוק ביולוגית ספציפית. כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה מזהה תוצרי תסיסה של מיקרואורגניזמים הגדלים על פסולת עיסת. שיטות אלה קובעות את היכולת המטבולית של מיקרואורגניזמים לפרק פסולת עיסה.

תקציר

תהליך הקראפט מיושם על שבבי עץ להפרדת ליגנין מהפוליסכרידים בתוך ליגנוצלולוז לעיסה שתייצר נייר באיכות גבוהה. משקאות חריפים שחורים הם פסולת עיסת שנוצרת על ידי תהליך הקראפט שיש לה פוטנציאל להמרה ביולוגית במורד הזרם. עם זאת, האופי העיקש של משאבי הליגנוצלולוזה, נגזרותיו הכימיות המהוות את רוב הפחמן האורגני הזמין בתוך ליקר שחור, וה-pH הבסיסי שלו מציבים אתגרים לפירוק ביולוגי מיקרוביאלי של חומר פסולת זה. שיטות לאיסוף ושינוי של משקאות חריפים לגידול מיקרוביאלי מכוונות לניצול פסולת עיסת זו כדי להמיר את הליגנין, החומצות האורגניות ותוצרי הלוואי של פירוק פוליסכריד לכימיקלים יקרי ערך. טכניקות מיצוי הליגנוצלולוז המוצגות מספקות שיטה ניתנת לשחזור להכנת מצעי גידול ליגנוצלולוז להבנת היכולות המטבוליות של מיקרואורגניזמים מתורבתים. השימוש בכרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה מאפשר זיהוי וכימות של תוצרי התסיסה הנובעים מגידול מיקרואורגניזמים על פסולת עיסת. שיטות אלו בשימוש יחד יכולות להקל על קביעת הפעילות המטבולית של מיקרואורגניזמים בעלי פוטנציאל לייצר מוצרי תסיסה שיספקו ערך רב יותר למערכת העיסה ויפחיתו את פסולת הקולחין, ובכך להגדיל את רווחי טחינת הנייר הפוטנציאליים ולהציע שימושים נוספים למשקאות חריפים שחורים.

מבוא

עיסת העץ היא תהליך אינטנסיבי מבחינה כימית שעבר אופטימיזציה לאורך שנים רבות ליצירת מערכת עם מינימום פסולת. עם זאת, ניתן להשתמש בחלק מהתפוקות של תהליך זה כדי לייצר מוצרים בעלי ערך גבוה יותר. משקאות חריפים שחורים הם דוגמה אחת כזו. הוא נוצר מתהליך הקראפט, שהוא שיטת העיסה הכימית הדומיננטית, המייצגת 85% מייצור הליגנין העולמי¹. תהליך הקראפט (איור 1) משתמש בטמפרטורה (160-200 מעלות צלזיוס), בלחץ (120 psig) ובכימיקלים הכלולים במשקאות לבנים (נתרן הידרוקסיד ונתרן גופרתי) כדי להמיס את הליגנין מסיבי העץ^2,3. ליקר שחור מכיל ליגנין, חומצות אורגניות ותוצרי לוואי של פירוק פוליסכריד⁴. הוא נשרף כדי לייצר קיטור ולשחזר כימיקלים בדוד השחזור המספק אנרגיה תרמית לתהליכי ייצור נייר ועיסת נייר במורד הזרם. נפח המשקאות השחורים שנוצרים על ידי עיסת יכול לעלות על הכמות שדוד השחזור יכול לעבד ביעילות. סילוק המשקאות השחורים כשפכים משפיע לרעה על החי והצומח הימיים ולכן אינו אופציה. יישום של אורגניזמים מיקרוביאליים שיכולים להשתמש במשקאות חריפים לגידול יהיה מועיל במונחים של הגדלת התאוששות כימית וייצור מוצרים בעלי ערך מוסף שישפרו את ניתוח מחזור החיים הכולל של מערכת העיסה. המרה כימית וביולוגית של מונומרים שמקורם בליגנין ייצרה בהצלחה ונילין וחומצה קינמית לשימוש כממתיקי מזון ותוספי ריח, פנול המשמש לפלסטיק ושרפים, וציקלוהקסאן, שיכול לשמש לדלק⁵.

עבודה קודמת על פירוק ביולוגי של פסולת עיסת זו התמקדה בדה-פולימריזציה של ליגנין. המכון הבינלאומי לליגנין (ILI) מדווח כי בין 40-50 מיליון טון ליגנין מיוצרים מדי שנה (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). רק 1.5% מהליגנין הזה משמש לתהליכים תעשייתיים מסחריים⁶. דה-פולימריזציה של ליגנין על ידי אנזימי לקאז ופרוקסידאז המיוצרים על ידי פטריות ריקבון לבן מהסוגים Phanerochaete ו-Trametes נחקרה בהרחבה⁷. חיידקי קרקע הידועים כמפרקים תרכובות ארומטיות כגון Nocardia ו-Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ ו-Streptomyces viridosporus T7A¹⁰ הוכחו גם הם כמסוגלים לפירוק ליגנין. פירוק חיידקים של פסולת עיסת מבטיח מכיוון שחלק מהחיידקים יכולים לשגשג בתנאי המלח והאלקליין (pH 10-14) המאפיינים את שפכי פסולת העיסה¹¹. בעוד שליגנין הוא המרכיב העיקרי של משקאות חריפים שחורים, מיקרואורגניזמים עלולים גם לפגוע ברכיבים האחרים המרכיבים את המשקאות השחורים. טכניקות אלו אינן מזהות באופן בלעדי מיקרואורגניזמים משפילים ליגנין, אלא משמשות לזיהוי מיקרואורגניזמים שניתן ליישם ישירות על פסולת המשקאות השחורים במקום מרכיביו המעובדים הנוספים.

משקאות חריפים שחורים נאספו והותאמו לגידול חיידקים באמצעות נטרול ועיקור מסננים. דרישות גידול מיקרוביאליות זוהו עבור מבודד מיקרוביאלי סביבתי על ידי ניסויי גידול מדיה מינימליים על רכיבים ליגנוצלולוזיים המיוצרים על ידי פרוטוקול מיצוי ליגנוצלולוז חדשני. אמצעי הגידול נותחו על ידי כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסה (GC-MS) כדי לקבוע את התוצרים המטבוליים של הבידוד המיקרוביאלי הסביבתי כאשר גדלו על משקאות חריפים שחורים כמקור הפחמן היחיד. השילוב של טכניקות אלה מספק כלי הערכה לקביעת היכולת המטבולית של מיקרואורגניזם כאשר הוא גדל על פסולת טחנת עיסה כגון משקאות חריפים שחורים. השימוש בטכניקות כאלה מציע גם תובנה לגבי הערך של יישום מיקרואורגניזמים ספציפיים לפסולת טחנת עיסת לייצור תוצרי לוואי.

פרוטוקול

1. איסוף משקאות חריפים שחורים והכנת משקאות חריפים שחורים לתרבויות גידול

1. אסוף דגימת משקאות חריפים שחורה משסתום היציאה המחובר למעכל הקראפט בבקבוק זכוכית סטרילי והניח לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך בשלבים הבאים.
   נטרול
2. הוסף 100 מ"ל דגימת משקאות חריפים שחורים לכוס של 500 מ"ל המצוידת בסרגל ערבוב.
3. מניחים את הכוס על צלחת ערבוב ומכוונים את המהירות לבינונית.
4. מוסיפים לאט טיפות של חומצה זרחתית עד שהמשקאות השחורים הופכים לצמיגיים (צמיגות דומה לגליצרול).
5. יש לשפוך את כל תמיסת המשקאות השחורים על ידי מזיגה איטית לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-9,300 x גרם למשך 30 דקות.
6. הכניסו את הסופרנטנט לכוס ומדדו את ה-pH באמצעות סרטי בדיקת pH. ניתן להשליך את כדור הליגנין המשקע ולהתייחס אליו כפסולת מוצקה לא מסוכנת.
7. המשיכו להוסיף חומצה זרחתית וצנטריפוגה את התמיסה עד שרצועות ה-pH מצביעות על pH ניטרלי של הסופרנטנט.
   עיקור
8. העבירו את התמיסה דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חיידקים מזהמים והניחו את התמיסה המסוננת במיכל סטרילי לאחסון. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.

2. מיצוי ליגנוצלולוז

הפרדת פחמימות

1. מניחים 5 גרם של עשב מתג, אורן או עשב ברמודה (טחון לגודל חלקיקים של 1 מ"מ או קטן יותר) לתוך בקבוק ארלנמאייר של 500 מ"ל. לאחר מכן מוסיפים לבקבוק 200 מ"ל מים מזוקקים או נטולי יונים, 7.5 גרם NaClO₂, 2.5 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ומוט ערבוב
.
2. מניחים את הבקבוק באמבט שמן המונח על גבי צלחת ערבוב בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. מכוונים את מהירות צלחת הערבוב לבינונית.
3. הוסף לבקבוק 7.5 גרם NaClO₂ ו -2.5 מ"ל חומצה אצטית קרחונית נוספת. המשיכו לערבב בחום של 80 מעלות צלזיוס באמבט השמן למשך 30 דקות.
4. חזור על השלב הקודם פי 2 (הערה: בסך הכל 30 גרם NaClO₂ ו -10 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית מתווספים לבקבוק המכיל את הביומסה הליגנוצלולוזית). מצננים את התמיסה לטמפרטורת החדר.
5. הניחו דף נייר פילטר במשפך Büchner. הניחו את המשפך על גבי בקבוק זרוע צד והצמידו אותו לוואקום.
6. שופכים לאט את התמיסה למשפך.
7. שטפו את החומר המוצק פי 3 עם 100 מ"ל מים מזוקקים או דה-יונים. השלך את המסנן לאחר שטיפת החומר המוצק.
8. שומרים 1 גרם מהחומר המוצק ומניחים אותו על דף נייר פילטר נקי.
9. יבש את החומר המוצק למשך הלילה בתנור 50 מעלות צלזיוס. לאחר הוצאת הדגימה מהתנור, הכניסו לבקבוקון אחסון שכותרתו 'הולוצלולוז'.
10. הוסף את החומר המוצק הנותר ל-250 מ"ל של 10% NaOH (v/v) בבקבוק Erlenmeyer של 500 מ"ל. מכסים את הבקבוק עם פקק.
11. יש להניח את התמיסה באינקובטור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת של ניעור ב-250 סל"ד.
12. מצננים את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
13. הסר את החומר המוצק באמצעות נייר סינון ומשפך Büchner המחובר לבקבוק זרוע צדדי.
14. מעבירים את החומר המוצק על דף נייר סינון נקי לתנור של 50 מעלות צלזיוס ומניחים לו להתייבש למשך הלילה.
15. לאחר שהשאריות התייבשו, הניחו אותן בבקבוקון אחסון וסמנו אותן 'תאית'.
16. מעבירים את המסנן משלב 2.13 לבקבוק ארלנמאייר של 500 מ"ל ומוסיפים 30 מ"ל חומצה אצטית ו -250 מ"ל אלכוהול איזופרופיל. מכסים את הבקבוק ומניחים את התמיסה על הספסל למשך 8 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.
17. העבירו את כל התמיסה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה את התמיסה ב-9,300 x גרם למשך 30 דקות.
18. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מ"ל מים מזוקקים או נטולי יונים על ידי מערבולת.
19. חזור על שלבים 2.17-2.18 פי 15 כדי לשטוף היטב את הגלולה.
20. הסר את ה-supernatant ושמור את הכדור לייבוש בהקפאה. לאחר הייבוש בהקפאה, אספו את הדגימה והניחו אותה בבקבוקון שכותרתו 'המיצלולוז'.
    הפרדת ליגנין
    פרוטוקול הפרדת ליגנין המבוסס על Karaaslan et al. ¹²
21. הוסף 5 גרם של עשב מתג, אורן או עשב ברמודה (טחון לגודל חלקיקים של 1 מ"מ או קטן יותר) ל-500 מ"ל של תמיסה של 0.25 M NaOH ו-30% אתנול. מניחים את התרחיץ באינקובטור בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סל"ד למשך שעתיים.
22. מצננים את התמיסה לטמפרטורת החדר.
23. הניחו דף נייר סינון במשפך Büchner על גבי בקבוק זרוע צדדי. חבר לוואקום ושפך לאט את התמיסה למשפך.
24. השלך את החומר המוצק.
25. מוסיפים מוט ערבוב לבקבוק המכיל את הפילטר ומניחים את הבקבוק על גבי צלחת ערבוב המותאמת למהירות בינונית. הוסף לתמיסה חומצה הידרוכלורית מרוכזת עד לקבלת pH של 2.0 (כ -20 מ"ל).
26. הניחו לתמיסה המחומצת לשבת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
27. צנטריפוגה את התמיסה ב-9,300 x גרם למשך 30 דקות בצינורות חרוטיים. הוציאו בזהירות את התמיסה מהצינור החרוטי והשליכו.
28. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מ"ל מים מזוקקים או נטולי יונים על ידי מערבולת.
29. חזור על שלבים 2.27-2.28 פי 15 כדי לשטוף היטב את הגלולה.
30. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט ושמור את הכדור לייבוש בהקפאה. לאחר הייבוש בהקפאה, הניחו את הדגימה בבקבוקון שכותרתו 'ליגנין'.

3. הכנת תרביות גידול מיקרוביאליות

Agar Plates

1. הוסף 0.2% (w/v) מוצרי מיצוי ליגנוצלולוז סטריליים למדיה מינימלית M9¹³ אגר לפני מזיגת צלחות.
2. צלחות ממוצקות פסים עם כ-200 ul של תרבית חיידקים הגדלה במדיה מינימלית M9 עם OD של כ-2.0.
3. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועקבו אחר הצמיחה.< /> תרביות נוזליות
4. הוסף 50 מ"ל של חומר מינימלי סטרילי של Luria-Bertani (LB)¹³ או M9 מינימלי¹³ לבקבוק סטרילי של 125 מ"ל. הוסף משקאות חריפים שחורים ב-10% (v/v) או 0.2% (w/v) של מוצרי מיצוי ליגנוצלולוזה.
5. חסנו את המדיה ב-0.1% (v/v) של תרבית חיידקים ב-OD של כ-2.0.
6. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
7. העריכו את הצמיחה כל 6 שעות במהלך תקופת התרבות על ידי מדידת צפיפות אופטית (λ = 600 ננומטר). מניחים מנה של 1 מ"ל מהתרבית לקובטה. קבע את הצפיפות האופטית של תרבית שנמחקה כנגד מדיה לא מחוסנת.
8. העבר חיידקים לבקבוק סרום אנאירובי בשלב אמצע העץ.
   1. להכנת בקבוק הסרום האנאירובי: יש לאטום את בקבוק הסרום עם פקק גומי בוטיל ומשטח מלחץ אלומיניום בתנאים אירוביים ובחיטוי. אין לשנות את מרווח הראש בתוך בקבוק הסרום לאחר העיקור.
   2. העבירו את כל תרבית ה-50 מ"ל מבקבוק ה-125 מ"ל לבקבוק הסרום הסטרילי האטום באמצעות מזרק.
   3. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.

4. הכנה לדוגמא עבור GC-MS

הכן דגימות לפי ראג', רדי וצ'נדרה¹⁴. בקרה שלילית המשמשת להשוואה מורכבת ממדיה מינימלית M9 עם 10% משקאות חריפים שחורים ומכונה גם המדגם הלא מחוסן.

1. צנטריפוגה תרביות חיידקים לא מחוסנות ומחוסנות (50 מ"ל) בטמפרטורה של 9,300 x גרם למשך 30 דקות לאחר 450 שעות דגירה.
2. העבירו 10 מ"ל של הסופרנטנט למבחנה מזכוכית. (הערה: פלסטיק אינו תואם לכימיקלים בשלבים הבאים.)
3. להחמיץ את הסופרנטנט עם HCl מרוכז ל-pH 1-2.
4. מוסיפים 3 נפחים של אתיל אצטט (30 מ"ל), מכסים את הצינור ומערבבים על ידי היפוך פי 4-6.
5. יש להניח כמות קטנה של Na₂SO₄ נטול מים (1-2 גרם) במבחנה מזכוכית נקייה.
6. אוספים בזהירות את השכבה האורגנית (העליונה) מתמיסת אתיל אצטט על ידי פיפטה עם פיפטה חד פעמית מזכוכית פסטר.
7. מניחים את השכבה האורגנית במבחנה עם Na₂SO₄ נטול מים.
8. יש להשקות את השכבה האורגנית על Na₂SO₄ נטול מים על ידי הקשה עדינה על המבחנה כדי לערבב. מוסיפים בהדרגה כמויות קטנות של Na₂SO₄נטול מים ומערבבים עד שאין גושים גדולים.
9. הניחו דף נייר סינון במשפך Büchner על גבי בקבוק זרוע צדדי המחובר לשואב.
10. שופכים את התמיסה למשפך. השלך את החומר המוצק.
11. העבירו את התמיסה לבקבוק מתאדה והתאדו את המסנן באמצעות מאייד סיבובי.
12. יש להניח 3 מ"ג של שאריות מיצוי אתיל אצטט לתוך בקבוקון כרומטוגרפיה ענבר של 2 מ"ל.
13. ממיסים את השאריות בתוספת 100 מיקרוליטר של 1,4-דיאוקסאן ו-10 מיקרוליטר פירידין.
14. הוסף 50 מיקרוליטר של N,O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide עם trimethylcholorsilane 99:1% (BSTFA). לאחר מכן מניחים בחממה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 15 דקות.
15. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

5. GC-MS

צייד את כרומטוגרף הגז (GC) המתממשק עם ספקטרומטר מסה (MS) עם עמוד נימי לא קוטבי והליום כגז הנשא בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.

1. לאחר התייצבות טמפרטורת התנור על 50 מעלות צלזיוס, הזרקו 1 מיקרוליטר מהדגימה ביחס פיצול של 1/50.
2. החזק את העמודה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והגדל ל-280 מעלות צלזיוס ב-5 מעלות צלזיוס לדקה. שמור על הטמפרטורה הסופית של 280 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. שמור על קו ההעברה בין כרומטוגרף הגז לספקטרומטר המסה ב-300 מעלות צלזיוס.
4. בחר עיכוב ממס של 15 דקות.
5. הקלט ספקטרום מסה של יינון אלקטרונים בין הטווח של 10-500 (m/z) באנרגיית אלקטרונים של 70 eV.
6. נגזרת ותקן כרומטוגרף כאמור לעיל. זהה תרכובות על ידי השוואת זמני שמירה של תקנים או נתונים שנרכשו במסד הנתונים הספקטרלי של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST).

תוצאות

איסוף ושינוי של משקאות חריפים שחורים שנוצרו בתהליך עיסת הקראפט (איור 1) יאפשרו להשתמש בפסולת עיסת זו כדי לקבוע את יכולת הפירוק הביולוגי של חיידק בודד או תרבית מעורבת. איור 2 מציג צמיחה אירובית הנמדדת על ידי צפיפות אופטית של הבידוד הסביבתי המיקרוביאלי שתורבת במדיה LB בלבד ומדיה LB בתוספת 10% משקאות שחורים מנוטרלים. תוצאות אלה מצביעות על כך שחיידק זה גדל בנוכחות משקאות חריפים שחורים מנוטרלים. הגידול של הבידוד הסביבתי ללא משקה שחור גדל בתחילה מהר יותר (עם זמן דור של 20 שעות בשלב האקספוננציא...

דיון

פרוטוקול זה מתאר שילוב של טכניקות שמטרתן לזהות מיקרואורגניזמים שיכולים לפרק פסולת עיסת, מקורות הפחמן המשמשים במהלך הגידול על פסולת עיסת, והתוצרים המטבוליים המיקרוביאליים המיוצרים בגידול על פסולת עיסת. הראינו את ההצלחה של פרוטוקול זה עם הבידוד הסביבתי המיקרוביאלי: אנאירובי פקולטטיבי שיכול לגדל על 10% משקאות שחורים ולהשתמש ברכיבי מיצוי הליגנוצלולוז כמקורות פחמן יחידים לגדילה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את הפוטנציאל להשפיל פסולת עיסת על ידי מיקרואורגניזמים אחרים או קונסורציום מיקרוביאלי בעלי פוטנציאל ליגנוצלוליטי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1,4-דיאוקסאן (מוסמך ACS)	פישר	D111	כימיקל דליק, ניתן לחמצון
ליקר שחור	המחלקה לביו-חומרים ביער באוניברסיטת צפון קרוליינה סטייט	N/A	pH 12.72, 13.67% מוצקים
אתנול (דרגת מיקרוביולוגיה)	פישר	BP2818
אתיל אצטט (דרגת ריאגנט ACS)	EMD	EX0240-9	דליק
חומצה אצטית קרחונית (מוסמכת ACS)	EMD	AX0073	קורוזיבי
Guaiacol	Sigma Aldrich	PHR1136	מזיק בבליעה, קורוזיבי
HP-5 עמוד נימי	Agilent	19091J-577	60 מ' x 0.18 מ"מ קוטר פנימי, 0.18 μ עובי m
חומצה הידרוכלורית (מוסמכת ACS)	EMD	HX0603P
N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide עם trimethylcholorsilane 99:1% (BSTFA)	Fluka	15238	דליק, גורם לכוויות בעור ולנזק לעיניים במגע
Na2SO4 (דרגת FCC)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80%)	סיגמא אולדריץ'	244155	דליק, רעיל
NaOH (מוסמך ACS)	EMD	1.06498.1000	אלקוזיביים קורוזיביים
	פישר	A979
חומצה זרחתית (מוסמך ACS)	Fisher	A242
Polaris Q ספקטרומטר מסה	Thermo Electron Corporation
Pyridine (99%)	Alfa Aesar	A12005	דליק, רעיל במגע עם העור
חוות מחקר דובדבן Switchgrass Goldsboro, NC	N/A	נקצר באוגוסט 2011
כרומטוגרף גז עקבות Thermo Finnigan	Thermo Electron Corporation
Whatman מס' 1 נייר סינון Whatman		1001-150