הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Arabidopsis thaliana הוא אורגניזם מודל המשמש בדרך כלל להבנה ומניפולציה של תהליכים תאיים שונים בצמחים, והוא נמצא בשימוש נרחב בחקר היווצרות דופן תא משנית. שקיעת דופן תא משנית מתרחשת לאחר הנחת דופן התא הראשונית, תהליך המתבצע אך ורק על ידי תאים מיוחדים כגון אלה היוצרים רקמות כלי וסיבים. רוב דפנות התאים המשניות מורכבות מתאית (40-50%), המיצלולוז (25-30%) וליגנין (20-30%). בודדו מספר מוטציות המשפיעות על ביוסינתזה משנית של דופן התא, והמוטציות המתאימות עשויות להפגין או לא להפגין שינויים ברורים בהרכב הביוכימי או פנוטיפים חזותיים מכיוון שניתן להסוות מוטציות אלה על ידי תגובות מפצה. הליכי צביעה שימשו באופן היסטורי כדי להראות הבדלים על בסיס תאי. שיטות אלה הן אך ורק אמצעי ניתוח חזותיים; עם זאת, יש חשיבות רבה לתפקידם בניתוח מהיר וביקורתי. אדום קונגו ולבן קלקופלואור הם כתמים המשמשים לזיהוי פוליסכרידים, בעוד ש-Mäule ו-phloroglucinol משמשים בדרך כלל לקביעת הבדלים בליגנין, וכחול טולואידין O משמש לצביעה דיפרנציאלית של פוליסכרידים וליגנין. הטכניקות הפשוטות לכאורה של חתך, צביעה והדמיה יכולות להוות אתגר למתחילים. החל מהכנת דגימה באמצעות מודל A. thaliana, מחקר זה מפרט את הפרוטוקולים של מגוון מתודולוגיות צביעה שניתן ליישם בקלות לתצפית על ארגון תאים ורקמות בדפנות תאים משניות של צמחים.
מבוא
דופן תא הצמח מחזיקה שפע של מידע בתוך מרכיביה השונים: ליגנין, תאית, hemicelluloses (xylan, glucuronoxylan,, arabinoxylan, גלוקן מעורב הצמדה, או glucomannan xyloglucan), ופקטין. טכניקות היסטולוגית לספק רמזים חזותיים חשובים בחקר הבדלים בתוך קירות תא המשניים ברמות ארגוניות וסלולריות. טכניקות היסטולוגית שונות פותחו וניתן למצוא בספרות, אבל בטכניקות אלה יכולים להיות מאתגרות ולמתחילים זמן רב משום שפרוטוקולים מפורטים מאוד עם הוראות חזותיות פשוטות הם לעתים רחוקות, אם בכלל זמין. מטרתו של מחקר זה היא לספק קווים מנחים פשוטים לטכניקות צביעה היסטולוגית כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה.
חתך רקמת הגזע הוא הצעד הראשון בהדמיה של קירות תא וצורות תא. למרות סעיפי יד לחתוך הם זולים וייקחו פחות זמן להתכונן, שימוש בvibratome מציע עקביות ומניב תמונות באיכות גבוהה. באמצעות vibratome מאפשר ייצור באיכות נתונים טוב יותר על ידי יצירה גם קטעים עם אותו העובי, אשר מסייע להפיק תמונות חדות ומפחית באופן משמעותי את הסיכון לייצור הבדלים מדויקים בין דגימות שיהיו פשוט נגרמים על ידי הכנת מדגם רעה. שימוש רפים לתקן דגימות טריות יכול להיות אתגר למתחילים ועדיין עשויה להיות זמן רב אפילו למומחים כאשר ניתוח צריך להיעשות במהירות. בנוסף, הוא הופך להיות בלתי אפשרי למדוד כל פעילות ביולוגית עם המדגם כאשר הוא כבר מוטבע בשרף. טכניקה פשוטה אחת שמעסיקה agarose ועובש תוצרת בית היא מועילה להטבעת רקמות גזע, וזה גם יכול להיות מנוצל ביישומים אחרים הדורשים נתיחה של רקמות רכות. בהשוואה להטבעת דגימות בשרף, בשיטה זו יש יתרון של שמירה על רקמות חיים והפחתת מניפולציה מדגם. חתך רקמות באמצעות vibratome הוא מאוד מדויק ומייצר homogenחלקי היחידות הארגוניות, אשר, בהתאם למטרת המחקר, לאחר מכן ניתן להשתמש בכמה טכניקות צביעה שונות.
שיטות הפשוטות כדי להמחיש ליגנין וארומטיים אחרים להעסיק אור אולטרה סגול (UV). עירור של מולקולות המבוססים על ארומטיים על ידי אור UV הוא טכניקה ישנה, אבל הוא עדיין אחד מהגישות המהירות ביותר להדמיה של ליגנין. עם זאת, להדמיה UV היא למעשה לא אידיאלית לגילוי ליגנין, כי אור UV ילהיב ארומטיים אחרים. ליגנין מורכב בעיקר משלושה אבני בניין, monolignols (כהלים hydroxycinnamyl: אלכוהול coniferyl, אלכוהול sinapyl, ואלכוהול p-coumaryl) 1-3. כתם Phloroglucinol יכול לספק רמזים להיקף cinnamaldehydes הווה בעצה, סיבים, ורקמות קנה הנשימה 4. Phloroglucinol הוא אינדיקטור טוב של cinnamaldehydes הכללי ויכול להבדיל בין cinnamaldehydes וארומטיים אחרים. ניתן לאתרם מונומרים אלכוהול sinapylומובחן על ידי השימוש בכתם מאולה. O הכחול Toluidine הוא צבע צבעוני, ולכן יש לו את היכולת להכתים אלמנטים שונים של תא הקיר בצבעים שונים 5,6. השימוש העיקרי של O הכחול toluidine הוא לזהות פקטין וליגנין 5,6. היתרון של שימוש בO הכחול toluidine הוא שאלמנטים רבים של דופן התא ניתן דמיינו בצעד אחד. שני calcofluor הלבן ואדום קונגו הם קלים לעבוד איתו והוא יכול לשמש כדי לחזות תאית. תאית כתמים הלבנים Calcofluor, callose, וβ-glucans אינו להחליף או להחליף בחולשה האחר 6-9, ואילו כתמים אדומים קונגו ישירות לβ-(1 → 4)-glucans ובמיוחד לתאית 10,11. מטרתו של מחקר זה היא לספק קווים מנחים פשוטים לשימוש בטכניקות הצביעה כאמור לקבלת תמונות באיכות גבוהה מא thaliana גבעולים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. גזע הטבעה
- בצע פתרון 7% agarose במים (7 גרם של agarose כיתה אלקטרופורזה ב100 מיליליטר מים מזוקקים). ממיסים את agarose ידי מעוקר עבור 20 דקות או ידי במיקרוגל עבור 20 דקות בעצימות הנמוכה ביותר (למשל, עוצמת 10% ממיקרוגל 1,250 ואט).
- הכן עובש תוצרת בית להטבעה נובעת באמצעות בקבוקוני פלסטיק.
- באמצעות סכין גילוח, לחתוך את תחתית חרוטי של צינור microcentrifuge בורג יתר 2 מיליליטר (חלק א '). עם מחט מזרק, לנקב חור בכובע הצינור מעט גדול יותר בקוטר של הגזע כדי להיות מוטבעים. בשלב בא, לחתוך 0.5 סנטימטר מהחלק התחתון של צינור microcentrifuge 0.6 מיליליטר (חלק ב ').
- מוסיף את חלק 0.5 סנטימטר החתך של צינור microcentrifuge 0.6 מיליליטר לתוך צינור microcentrifuge מיליליטר החתוך 2. לאטום את שני חלקים באמצעות Parafilm (איור 1). הערה: החלק התחתון של הצינור הוא לחתוך כדי להקל על ההסרה של המדגם המשובץ לאחר agarose יש הקרושה. Tהוא החור בכובע יסייע במחזיק את הגזע יציב כאשר הגזע מוטבע בagarose. העובש ישמש כדי להחזיק את agarose ולהחזיק ישר הגזע כאשר הטבעה. Parafilm יקיים שני חלקים, A ו-B, עד agarose מוגדר והגזע הוא משובץ.
- באמצעות סכין גילוח, לחתוך קטע גזע מהשטח של עניין, (למשל אמצע Internode הגזע הראשון). הערה: באופן אידיאלי, הגזע יש לחתוך ממש לפני ההטבעה, כדי למנוע הרס על ידי התייבשות. לחלופין, הגזע יכול להיות מאוחסן באופן זמני בצלחת המכילה נייר סינון רטוב עם מים. צלחת זה יכול להיות ממוקם על קרח עד מוכן להיות מוטבע על מנת למנוע התייבשות ועיוות רקמה. אחסון הגזע לתקופות ארוכות יותר מ30 דקות ללא לחות גבוהה יגרום לגזע להתייבש.
- ממסים את agarose במיקרוגל בעוצמה נמוכה. זהירות: הבקבוק המכיל agarose עלול להיות חם. השתמש בכפפה כדי להרים את הבקבוק. בואו של agarose נמסtand בטמפרטורת חדר (בין 20 מעלות צלזיוס ו25 מעלות צלזיוס) עד שהוא מתקרר לכ -50 ° C.
- לאט פיפטה 5 מיליליטר של agarose לתוך תבנית פלסטיק התערובת של עוגיות כדי למלא את הבקבוקון. הערה: ודא שאין בועות אוויר בתבניות. בועות אוויר תגרום לפערים בעובש agarose ולא תכסה את מדגם הגזע, אשר יוביל בסופו לחיתוך אחיד של חלקי המדגם לחלוטין.
- בואו agarose להתקרר למשך 30-60 שניות להפוך למוצק למחצה. לבדוק עם קיסם קטן, כדי לוודא שהוא יכול לחדור ולקום, אך לא יצוף, בagarose. הערה: אם הגזע מושם כאשר agarose עדיין חם זה יפגע המדגם על ידי צמוק הגזע, להרוס את המורפולוגיה של התאים.
- הנח את הגזע בבקבוקון מלא agarose זה. לוודא כי הגזע נשאר ישר. מניחים את הכובע המחורר בצורה כזאת שקצה הגבעול מוחזק על ידי הכובע. אל תכבה את כובע הבורג על. מתישהו יותר מגזע אחד (מסוג אחד) יכול להיות לפdded בבקבוקון אחד; אבל במקרה מסוים הזה, אין להשתמש בכובע. שים לב: אם כובע הבורג במופעל, הגזע יקבל מעוות.
- השאר את הבקבוקון בטמפרטורת חדר או על 4 מעלות צלזיוס למשך 10-30 דקות, עד שמתמצק.
- להסיר את התבנית בעדינות על ידי הזזה מחוץ לצינור זה. פתח את Parafilm. דחוף את החלק התחתון של החלק ב 'של העובש בעדינות עם אצבע כדי לשחרר את agarose הקרושה מחלק לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
- חותכים את הגבעול המשובץ agarose לשלושה חלקים שווים של 1.2 סנטימטר באורך. חותכים את חלק מהגזע שלא היה בagarose וזורקים אותו.
- אחסן את החתיכות של agarose אלה עם מוטבעים נובע באטום 2 microcentrifuge צינורות מיליליטר בקופסא חשוכה על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן סעיף. לחלופין, לאחסן את הצינורות על 4 מעלות צלזיוס לתקופה מקסימלית של שבוע אחד. הערה: חפצים אפשרי, אבל הנסיין צריך להיות מודע לכך נובע משובצים עדיין בחיים וכן, בהתאם לניסוי, יכולים להיות הציגו ממצאים שעלולים להיות.
2. גזע חתך
- זהירות: קרא את מדריך vibratome בזהירות ולעקוב אחר כל הוראות הבטיחות.
- ודא שדיסק הדגימה הוא נקי ויבש לחלוטין (ללא כל מוצק או נוזלי). נקה את תקליטור הדגימה עם סכין גילוח כדי להסיר כל דבק שיורית מניסויים קודמים ולשטוף עם מים. לאחר מכן לייבש עם מגבת נייר. הערה: הפעולה זו תבטיח כי הדבק עובד היטב ונקשר לדגימת agarose. אם צעד זה לא נעשה כראוי, זה אפשרי, כי הדגימה לא יכולה לדבוק בדיסק ולאחר מכן לגרום לדגימה ליפול הדיסק במהלך חתך.
- השתמש בנייר רך מגבונים כדי להסיר כל לחות מבלוק agarose המכיל את הדגימות.
- מקום טיפה קטנה של דבק רקמות על דיסק הדגימה. Streak את הדבק כדי לכסות את האזור באמצע הצלחת באמצעות הקצה של בקבוק הדבק. מקום במהירותבלוק agarose כך הדגימות הם או בניצב או במקביל עם הצלחת לשוכלת או חתכי אורך, בהתאמה. לאפשר את הדבק כדי לתקן את הדגימה לדיסק הדגימה בטמפרטורת חדר או על 4 מעלות צלזיוס למשך 10-30 דקות. הערה: זה הוא צעד רגיש לזמן.
- תקן את דיסק הדגימה במקום על מגש החיץ או שוקת. הבלוק / s של agarose עם הקטעים צריכה להיות במקביל עם סכין הגילוח. מלא את מגש החיץ עם מים מזוקקים בטמפרטורת חדר עד לדגימות שקועות לחלוטין.
- לחתוך בסכין גילוח במחצית ולאחר מכן לקצץ את הקצוות עם מספריים יציב, כך שהלהב נשאר שטוח לחלוטין. צרף אחד וחצי של סכין הגילוח שנחתך מראש פוזר על גבי מחזיק הסכין.
- הגדר את הזווית על בעל סכין ל84 °, המהירות ל0.90 מ"מ / שנייה (עמדה 8 בvibratome) ותדירות ל50 הרץ (עמדה 5 בvibratome). לחתוך קטעים של 100 עובי מיקרומטר. השתמש במצב מתמשך. איןTE: עובי זו נבחר כדי להבטיח שהרקמה יכולה לעמוד בטיפולי החומצה ובסיס השונים המשמשים בחלק מהפרוטוקולים מכתים. הגדר את החלון עבור חתך ולאפשר 15-20 דקות על מצב מתמשך לvibratome סעיף בלוק agarose של כ 1.2 סנטימטר.
- לאסוף את החלקים באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמית במהלך חתך במגש החיץ. לחלופין, ניתן להעביר חלקים ממגש החיץ לתוך כוס זכוכית ולאחר מכן לצלחת פטרי ברורה. העבר כמה סעיפים ל2.0 מיליליטר microcentrifuge הצינורות. שים לב: הדגימות שנאספו מצלחת פטרי, כי זה קל יותר לראות את הסעיפים על רקע ברור, וכי מגש החיץ יכול להיות דרוך לדגימה הבאה.
- ניתן לאחסן את החלקים בצינור 50 מיליליטר או שנאספו ואוחסנו ב1.5-2 microcentrifuge צינורות מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות. הערה: אחסון החלקים לתקופות ארוכות יותר יביא לאיכות תמונה ירודה.
3. מיקרוסקופ והמצלמה הגדרת הדמיה
- התאם את תאורת קוהלר במיקרוסקופ. בחר אובייקטיבי. תתמקד בדגימה ראשונה. להביא את עוצמת האור למחצית או נמוכה יותר. סגור את סרעפת השדה (FD) וצמצם (AP) או להביא אותו להגדרה הנמוכה ביותר האפשרית על מטרה מסוימת.
- ההגדלה גבוהה יותר, הגדול יותר תהיה הטבעת. השתמש בכפתור מיקוד הקבל להתמקד איריס השדה כמו בחדות ככל האפשר.
- לאט לאט מביא את דמותה של איריס השדה (טבעת קטנה בצורת משושה) למרכז באמצעות ידיות הקבל-מרכוז (ברגים בצורת סיכה המקיפים את הקבל). לאט להגדיל את הסרעפת (FD), כך שאיריס השדה מגיעה לקצה. תפסיק הגדלת FD רק לאחר איריס השדה עברה את הקצה.
- לאט לאט להגביר את הצמצם (AP) כדי לכוונן את החדות. התאם את עוצמת האור בהתאם לצורך. הערה: תאורת קוהלר צריכה להיות מותאמת לכל objective, כל יום ניסוי. שים לב למספרים המתקבלים לאחר התאמה ליום. מספרים אלה יהיו לעשות שימוש חוזרים בכל פעם שמטרותיהם עברו הלוך ושוב ליום מסוים.
- התאם את הצמצם, עוצמה, זמן חשיפה, רווח, ומסננים כפי שמתואר בטבלה 1. יש להשתמש במידע זה רק כמדריך.
- שימוש במצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה עם שבב CCD לבטן בפורמט גדול ללא תריס מכאני כדי ללכוד תמונות הקרינה; ורזולוציה גבוהה, מצלמה במהירות גבוהה לתמונות שדה בהיר.
- לעבד את השקופיות באמצעות תוכנה סטנדרטית. טען את התוכנה. לחץ "לרכוש" ואת "הגדר את המצלמה / לוח," לאחר מכן בחר את המצלמה כדי לשמש. לחץ על "אישור". לחץ על "רכישה" ואחריו "כרטיסיית צבע." תחת "כרטיסיית צבע," לבחור "שיטה באייר" ואחריו "ארבע ממוצע." הוסף הרווח הציע (אדום, ירוק, כחול) לכאן ולכאןטבלת 1 מ '. בחר בכרטיסייה "הגדרה לחסוך" ולחץ על הספרייה שבה תמונות הן להיות מאוחסנות. הגדרה "זמן חשיפה" מההצעות בטבלה 1. הגדרה "Binning" ב "1" ו "binning בשידור חי" בפוקוס "1." באזור של עניין ולאחר מכן לחץ על "שמור חי."
- פלט תמונות בתוכנת המצלמה הן בפורמט "הטיף". לנתח את התמונות להיסטוכימיה של סוגי התאים. השתמש בתוכנת מחשב סטנדרטית לשימושים במורד הזרם של הצגה ופרסום.
הדמיה 4. אולטרה סגול ובהיר שדה
- השתמש פיפטה 1 מיליליטר עם קיצוץ קצה פיפטה, כך ניתן pipetted את החלקים בקלות. בעדינות סעיפי פיפטה לתוך הקצה ועל שקופיות מיקרוסקופ. לכסות את החלקים עם להחליק את מכסה. שים לב לסעיפים תחת אור UV או תאורה בהיר שדה.
5. Phloroglucinol-HCl (ויזנר) מכתים 12
- ממיסים 0.3 גרם של phloroglucinol ב10 מיליליטר אתנול מוחלט להכין פתרון phloroglucinol 3%. מערבבים כרך אחד של HCl המרוכז (37 N) לשני כרכים של phloroglucinol 3% באתנול; פתרון זה הוא phloroglucinol-HCl (pH-HCl) או כתם ויזנר. הערה: פתרון זה הוא להיעשות טרי ביום של הצביעה ולא ניתן לאחסן, כי הפתרון יהיה לבזות לאורך זמן ומכתים יהפכו לא יעיל. זהירות: HCl הוא מאכל מאוד, כל כך להשתמש בזהירות רבה בעת הטיפול בכתם Ph-HCl.
- העבר את חלקי גזע לצינור 2.0 מיליליטר microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר של פתרון Ph-HCl לצינור המכיל את החלקים וכובעו מייד בגלל HCl בכתם Ph-HCl הוא מאכל מאוד. בעדינות להזיז את הצינור כדי להבטיח כי כל הסעיפים מוכתמים. חלופה לצעד זה היא לשמור על כובע הצינור פתוח, כך שפתרון Ph-HCl ניתן pipetted למעלה ולמטה, רצוי מבלי להפריע שניותtions. הערה: היזהר שלא פיפטה הסעיפים לתוך קצה פיפטה, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק למקטעים אלה.
- השתמש פיפטה 1 מיליליטר עם קיצוץ קצה פיפטה באופן כזה שניתן pipetted את החלקים בקלות וללא נזק. בעדינות פיפטה סעיפים לתוך הקצה ולשקופית מיקרוסקופ. לכסות את החלקים עם כיסוי להחליק. שים לב לסעיפים תחת תאורה בהירה שדה. הערה: פתרון Ph-HCl מתייבש ב5-10 דקות, וגרם להידרדרות של הדגימות. לכן, ההדמיה צריכה להסתיים בתוך פרק זמן זה.
6. Maule מכתים 13,14
- ממיסים 0.2 גרם permanganate אשלגן ב40 מיליליטר מים מזוקקים כדי להכין פתרון permanganate אשלגן 0.5%. לאחסן בבקבוק כהה בטמפרטורת חדר לתקופה מקסימלית של 7 ימים.
- הכן .3.7% פתרון HCl על ידי הוספת 1 מיליליטר HCl מרוכז (37 N) עד 9 מיליליטר מים מזוקקים (1:10). הכן .3.7% פתרון HCl טרי עליום של הניסוי. ודא כי פתרון מניות 37 N HCl בשימוש הוא לא זקן מדי. פתרון מרוכז אמוניום הידרוקסיד (14.8 M) צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע molarity של התמיסה רוויה מירידה.
- העבר את חלקי גזע לצינור 2.0 מיליליטר microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר של 0.5% פתרון permanganate אשלגן לצינור המכיל את החלקים.
- פיפטה פתרון permanganate אשלגן 0.5% למעלה ולמטה בעדינות, רצוי בלי להפריע לחלקים. דגירה למשך 2 דקות ולחזור על pipetting. בואו צינור microcentrifuge לעמוד עד שכל החלקים להתיישב. הערה: היזהר שלא פיפטה הסעיפים לקצה פיפטה כחלקים עשויים להיפגע. זה יכול להיות קשה לראות את קטעי הגזע כפתרון הוא כהה, כדי לשמור על הצינור עם הקטעים על מדף מבחנה ולאפשר להם להתיישב למשך 2 דקות.
- בעזרת פיפטה 1 מיליליטר, להוציא 700 μl של .0.5% פתרון permanganate אשלגן.הוסף 700 μl של מים מזוקקים כדי לשטוף את פתרון permanganate אשלגן. חזור על פעולה 3-4x או עד פתרון המים נשאר צלול.
- מחק את המים. מהירות להוסיף 1 מיליליטר של 3% HCl עד לצבע חום העמוק ריקה מהסעיפים. זה יכול לקרות בתוך 3-5 דקות או עשוי לדרוש 2 שוטף של 5 דקות כל אחד. פיפטה את כל 3% פתרון HCl ומייד להמשיך לשלב הבא.
- הוסף 1 מיליליטר של תמיסת אמוניום הידרוקסיד מרוכזת. השתמש פיפטה 1 מיליליטר עם קיצוץ הקצה באופן כזה שניתן pipetted את החלקים בקלות וללא נזק. בעדינות פיפטה סעיפים לתוך הקצה ולשקופית מיקרוסקופ. לכסות את החלקים עם coverslip. שים לב לסעיפים תחת תאורה בהירה שדה. זהירות: בגלל אמוניום הידרוקסיד הוא מאכל מאוד, זה דורש טיפול ותשומת לב נוספים כדי למנוע גרימת קורוזיה לבמה של מיקרוסקופ או עדשות. הערה: אדי אמוניום הידרוקסיד יכולים ערפל coverslip, מה שהופך את זה קשה לראות את המדגם. לכן להיות זהיר לפני שמוסיף את coverslip. הפתרון מתייבש ב5-10 דק ', ולכן ההדמיה צריכה להסתיים בתוך פרק זמן זה.
7. קונגו אדום מכתים 11,15
- ממיסים 0.5 גרם קונגו אדום במים מזוקקים 100 מיליליטר להכין פתרון אדום קונגו 0.5%.
- העבר את חלקי גזע לצינור 2.0 מיליליטר microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר של 0.5% הפתרון האדום קונגו לצינור. בעדינות פיפטה הפתרון האדום קונגו 0.5% למעלה ולמטה בלי להפריע לחלקים. הערה: היזהר שלא פיפטה הסעיפים לקצה פיפטה כמו זו עלולה לגרום נזק לחלקים.
- דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ולחזור על pipetting. פעל עם עוד 3 דקות של דגירה בטמפרטורת חדר.
- השתמש פיפטה 1 מיליליטר כדי להוציא 700 μl של .0.5% פתרון אדום קונגו. הוסף 700 μl של מים מזוקקים כדי לשטוף את הפתרון האדום קונגו. חזור על לשטוף 3-4x עד פתרון הכביסההוא ברור.
- השתמש פיפטה 1 מיליליטר עם קיצוץ קצהו באופן כזה שניתן pipetted את החלקים בקלות וללא נזק. בעדינות פיפטה סעיפים לתוך הקצה ולשקופית מיקרוסקופ, ולכסות אותם עם coverslip. שים לב לדוגמות בשקופית מיקרוסקופ תחת עירור אור הכחול באמצעות מסנן עם bandpass של 560/40. הערה: אין לאחסן את החלקים במים במשך זמן רב לפני הניתוח המיקרוסקופי, כמו המים לשטוף את אדום קונגו ב10-30 דקות.
8. Calcofluor לבן מכתים 9
- ממיסים 0.02 גרם של מלביני ניאון 28 (calcofluor M2R הלבן) ב10 מיליליטר מים מזוקקים להכין פתרון מניות 0.2%. פתרון 0.2% יכול להיות מאוחסן במשך שישה חודשים בבקבוק כהה ב 4 ° C. הכן פתרון עבודה של 0.02% על ידי דילול 0.2% 10x פתרון מניות עם מים מזוקקים.
- העבר את חלקי גזע לצינור 2.0 מיליליטר microcentrifuge. הוסף למיליליטר 1 שפופרת של calcof 0.02%luor פתרון לבן. בעדינות פיפטה הפתרון הלבן calcofluor 0.02% למעלה ולמטה. הערה: היזהר שלא פיפטה הסעיפים לקצה פיפטה כמו זו עלולה לגרום נזק לחלקים.
- דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולחזור על pipetting. דגירה הסעיף לעוד 3 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: אפשר הסעיפים להתיישב על החלק התחתון של הצינור כדי להפוך אותו קל יותר לפיפטה את הפתרון מבלי לפגוע בחלקים.
- השתמש פיפטה 1 מיליליטר כדי להוציא 700 μl של פתרון לבן calcofluor 0.02% ולהוסיף 700 μl של מים מזוקקים; לחכות 5 דקות כדי לשטוף את הפתרון הלבן calcofluor. חזור על לשטוף 3-4x. השתמש פיפטה 1 מיליליטר עם קיצוץ קצה פיפטה בכגון אופן שבו ניתן pipetted את החלקים בקלות וללא נזק.
- בעדינות פיפטה סעיפים לתוך הקצה ולשקופית מיקרוסקופ ולכסות אותם עם coverslip. שים לב לסעיפים תחת אור UV.
9. Toluidine Bluדואר O מכתים 16,17
- ממיסים O הכחול toluidine 0.02 גרם ב100 מיליליטר מים מזוקקים כדי להכין פתרון 0.02%. הערה: פתרון O הכחול toluidine יכול להיות מאוחסן במשך שבועיים בבקבוק כהה בטמפרטורת חדר.
- העבר את חלקי גזע לצינור 2.0 מיליליטר microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר של פתרון O הכחול toluidine 0.02% לצינור. בעדינות פיפטה פתרון O הכחול toluidine 0.02% למעלה ולמטה. ואז דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולחזור על pipetting פעם אחת. הערה: היזהר שלא פיפטה הסעיפים לקצה פיפטה כמו זו עלולה לגרום נזק לחלקים. בואו צינור microcentrifuge לעמוד דום עד לחלקים להתיישב. זה עשוי להיות קשה לראות, כפתרון הוא כהה, כדי לשמור על הצינור המכיל את הסעיפים על מדף מבחנה ולאפשר להם להתיישב למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר.
- השתמש פיפטה 1 מיליליטר כדי להוציא 700 μl של פתרון O הכחול toluidine 0.02%. הוסף 700 μl של מים מזוקקים כדי לשטוף את סול O הכחול toluidineution. חזור על פעולה 3-4x או עד הפתרון לשטוף הוא ברור. השתמש פיפטה 1 מיליליטר עם קיצוץ קצה פיפטה באופן כזה שניתן pipetted את החלקים בקלות מבלי לפגוע בהם.
- בעדינות פיפטה סעיפים לתוך הקצה ולשקופית מיקרוסקופ ולכסות אותם עם coverslip. שים לב לסעיפים תחת תאורה בהירה שדה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
גזע הטבעה וחתך:
השימוש בתבנית פלסטיק תוצרת בית כדי להטביע את הגבעולים ב -7% הוכיחו agarose להיות מהיר וקל (איור 1). שני חלקים (A ו-B; איור 1) של מערכת הבקבוקון המוטבע לעשות את זה פשוט כדי לשחרר בקלות את הגבעול המשובץ בagarose כagarose אינו מקל על חלקי הבקבוקון שהם אינרטי, שמירה על המערכת נקייה. ניתן לעשות שימוש חוזר הבקבוקונים מספר פעמים במשך שנים. הנוחות של אחסון הגזע המוטבע גם עושה את השלבים הבאים קלים יותר. על מנת לחסוך בזמן כלשהו, בדו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
סעיפי גזע thaliana א נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את הארגון של התאים בדופן התא משני ולבחון באופן איכותי את ההבדלים בין סוג בר וצמחים מהונדסים. הטכניקות הנפוצות עבור חתך הדגימות הן יד חיתוך ישיר; או כאשר דגימות מוטבעות בagarose או מקבע, חתך יכול להיעשות עם vibratome או microtome. בניגוד לחיתוך יד, שני האחרונים אפשר לצמצם את הסיכון של ייצור הבדלים מדויקים בין דגימות שיהיו פשוט נגרמים על ידי הכנת מדגם רעה שנגרמה על ידי הבדלי עובי בין דגימות ומשטחים לא ישרים. כל השיטות האלה י...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין סכסוכים כספיים לחשוף.
תודות
אנו אסירי תודה לסבין ראסל לסיוע בעריכה. עבודה זו הייתה חלק מDOE Bioenergy וינט המכון (http://www.jbei.org) נתמכת על ידי משרד אנרגיה האמריקאי, משרד מדע, המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי, באמצעות חוזה DE-AC02-05CH11231 בין לורנס ברקלי מעבדה לאומית ומשרד אנרגיה האמריקאי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agarose | EMD | MERC2125 | : 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [מספר CAS: 108-73-6] |
| חומצה הידרוכלורית | EMD | HX0603-75 | מספר CAS: 7647-01-0 |
| אמוניום הידרוקסיד | EMD | AX1303-6 | מספר CAS: 1336-21-6 |
| טולדין כחול O | Sigma | T3260 | בלוטן כלוריד, טולוניום כלוריד [מספר CAS 92-31-9] |
| אשלגן פרמנגנט | סיגמא | 223468 | מספר CAS 7722-64-7 |
| אתנול 190 הוכחה | KOPTEC | V1401 | מספר CAS: 64-17-5 |
| קונגו אדום | סיגמא | C6277 | דיסודיום 3,3'-[[1,1'-ביפניל]-4,4'-דילביס(אזו)]ביס(4-אמינונפתלין 1-סולפונאט) [מספר CAS 573-58-0] |
| מבהיר פלואורסצנטי 28 / Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS מספר 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica מיקרוטום להב רוטט VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ | |
| חברת סכיני גילוח אמריקאית לבטיחות | פריט # 60-0139-0000 | להב קצה כפול מפלדת אל-חלד (Personna Super) | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה בורג (2 מ"ל) | VWR | 16466-044 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה (0.6 מ"ל) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 3800000000 | SCIENCEWARE מגן ידיים חם כפפה |
| דבק רקמות | טד פלה בע" | 10033 | חנות ב 4 מעלות; C או 20 מעלות; C לאחסון של 3 חודשים או יותר |
| מיקרוגל | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 דבק רקמות מיידי |
| מצלמה עם שבב CCD ללא תריס מכני | Hamamatsu | C4742-95 | |
| מצלמה צבעונית במהירות גבוהה | תוכנת מצלמת QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| מכשירים מולקולריים | MetaMorph גרסה 7.7.0.0 | ||
| דמיון אנליזה | אדובי | משקפי Photoshop CS4 | |
| Micro Cover, מרובעים, מס' 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 מ"מ (7/8 x 7/8 אינץ') משקפי כיסוי עמידים בפני קורוזיה ועבים ושטוחים באופן אחיד. עובי מס '1 הוא 0.13 עד 0.17 מ"מ. |
| מיקרו שקופיות חלביות, 1 מ"מ | VWR | 48312-003 | 75 x 25 מ"מ - 1 מ"מ |
| Parafilm M | Alcan אריזה | BRNDPM998 | |
| קוביית מסנן TX2 Leica | 11513851/11513885 | מסנן המשמש לניתוח אדום קונגו עם מעבר פס של 560/40. |
מקורות
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
