הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון
במאמר זה
סיכום
תקציר
האסטרטגיה המסורתית להקדמה של פונקציות כימיות היא השימוש בסינתזה מוצק שלב על ידי צירוף מבשרי phosphoramidite הותאמו כראוי לרשת המתהווה. עם זאת, תנאי שימוש במהלך הסינתזה וההגבלה לרצפים קצרים ולא לעכב את תחולתה של מתודולוגיה זו. מצד השני, triphosphates נוקלאוזידים שונה מופעלים אבני בניין שכבר מועסק להקדמה קלה של קבוצות פונקציונליות רבות לחומצות גרעין, אסטרטגיה שסוללת את הדרך לשימוש בחומצות גרעין שונה בפלטה רחבה של יישומים מעשיים כגון תיוג ודור תפקודיים של ribozymes וDNAzymes. אחד האתגרים הגדולים מתגורר במורכבות של המתודולוגיה שמוביל לבידוד והאפיון של אנלוגים נוקלאוזידים אלה.
במאמר זה וידאו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינתזה של thesדואר שונה אנלוגים באמצעות זרחן ריאגנטים מבוסס (III). בנוסף, ההליך לאפיון ביוכימי שלהם הוא חשף, עם דגש מיוחד על תגובות הארכה תחל ופילמור עוקב TdT. פרוטוקול מפורט זה יהיה שימוש לצורפות של dNTPs שונה והשימוש נוסף שלהם בביולוגיה כימית.
מבוא
triphosphates 5'-נוקלאוזידים ((ד) NTPs) מייצג סוג של ביומולקולות חיונית כי הם מעורבים בתהליכים אינספור פונקציות הנעים מלהיות המטבע האוניברסלי של אנרגיה לרגולטורים של חילוף חומרים בתא. בנוסף לתפקידם בשינויים הביולוגיים הבסיסיים אלה, עמיתים השונים קידמו כפלטפורמה תכליתית וקלה לכניסתה של קבוצות פונקציונליות לoligonucleotides, המתודולוגיה שיפה משלימה את הסינתזה מוצק שלב האוטומטי המיושמת בדרך כלל 1,2. ואכן, בתנאי NTPs (ד) יכול לפעול כמצעים לpolymerases RNA ו-DNA 3, עושר של קבוצות פונקציונליות כוללים חומצות אמינו 4-13, חומצות boronic 14,15, nornbornene 16, שאריות כמו di....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. סינתזה של triphosphates נוקלאוזידים השתנה
הגישה סינתטית נבחרה להלן השיטה שפותחה על ידי לודוויג ואקשטיין מאחר ושיטה זו היא בדרך כלל אמינה ומובילה למעט מאוד תופעות לוואי (איור 1 א) 39.
- Coevaporate נוקלאוזידים המוגן 3'-OAC כראוי (בדרך כלל 0.1 מילימול) פעמיים עם פירידין נטול מים (2 מיליליטר) ולאחר מכן יבש תחת ואקום הלילה. במקביל, pyrophosphate היבש tributylammonium (0.13 מילימול) תחת ואקום הלילה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
triphosphates נוקלאוזידים שינוי הינו מפתים מטרות סינתטיות שכן הם מאפשרים להקדמה הקלילה של מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות לחומצות גרעין 41. עם זאת, הבידוד והאפיון של אבני הבניין הופעל אלה מתגלים לעתים קרובות להיות מפרכים. כתוצאה מכך, התוצאות הראו במסמך זה נחשבות לספק יד מסייעת לבצע את השלבים השונים בתהליכים ביוכימיים סינטטיים והאמורים (איור 1).
בפרט, איור 3 מציג ספקטר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הכללת שינויים בחומצות גרעין היא עניין של יישומים מעשיים רבים, כולל הפיתוח של סוכני antisense וantigene 42,43, תיוג ותיוג פונקציונלי של oligonucleotides 41, ובמאמצים להרחיב את האלפבית הגנטי 44-46. שינויים כימיים וקבוצות פונקציונליות בדרך כלל מוכנסים חומצות גרעין על ידי יישום של פרוטוקולי סינתזה מוצק שלב סטנדרטיים ואוטומטיים. עם זאת, אבני בניין phosphoramidite צריך להיות עמיד לתנאים הקשים למדי שהוטלו על ידי מתודולוגיה זו, אשר בתורו מטילה הגבלות חמורו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן השוויצרית הלאומית למדע (מענקי N ° PZ00P2_126430 / 1 וPZ00P2_144595). פרופ 'ג Leumann הוא הודה בהכרת תודה למתן חלל המעבדה וציוד, כמו גם לתמיכה המתמדת שלו. הגב 'סו Knecht הוא הודה לדיונים פוריים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| טריבוטילאמוניום פירופוספט | Sigma Aldrich | P8533 | מוצק היגרוסקופי, שמור תחת Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | סיגמא אולדריץ' | 324124 | פירידין רגיש ללחות |
| סיגמא אולדריץ' | 82704 | מתחת למסננות מולקולריות | |
| דיוקסאן | סיגמא אולדריץ' | 296309 | מתחת למסננות מולקולריות |
| דימתילפורממיד (DMF) | סיגמא אולדריץ' | 40248 | מתחת למסננות מולקולריות |
| אצטוניטריל | פישר סיינטיפיק | HPLC | |
| טריאתילאמין | סיגמא אולדריץ' | 90342 | |
| טריבוטילמין | סיגמא אולדריץ' | 90781 | |
| ddH2 | O Milli-Q | מים נטולי יונים ומטוהרים, אוטוקלאב בנוכחות דיאתילפירוקרבונט (DEPC | |
| )דיאתילפירוקרבונט (DEPC) | סיגמא אולדריץ' | 159220 | |
| D2O | מעבדות איזוטופ קיימברידג', בע"מ | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| טבעי dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA פולימראז | NEB | M0257S | |
| DNA פולימראז I, שבר גדול (Klenow) | NEB | MO210S | |
| 9° Nm DNA פולימראז | NEB | MO260S | |
| מסוף דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA פולימראז | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter חצי הכנה RP-HPLC עמודה (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| בקבוקוני PCR | Bioconcept | 3220-00 | |
| מערכת HPLC | Amersham Pharmacia Biotech | Ä kta בסיסי 10/100 | |
| כל האוליגונוקלאוטידים נרכשו ממיקרוסינת' וטוהרו על ידי PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| מידע נוסף על נהלים וציוד ניסיוני ניתן למצוא במאמרים הבאים: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
מקורות
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
