מאמר שיטה

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

DOI:

10.3791/51385

⸱

3 באפריל 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האסטרטגיה המסורתית להקדמה של פונקציות כימיות היא השימוש בסינתזה מוצק שלב על ידי צירוף מבשרי phosphoramidite הותאמו כראוי לרשת המתהווה. עם זאת, תנאי שימוש במהלך הסינתזה וההגבלה לרצפים קצרים ולא לעכב את תחולתה של מתודולוגיה זו. מצד השני, triphosphates נוקלאוזידים שונה מופעלים אבני בניין שכבר מועסק להקדמה קלה של קבוצות פונקציונליות רבות לחומצות גרעין, אסטרטגיה שסוללת את הדרך לשימוש בחומצות גרעין שונה בפלטה רחבה של יישומים מעשיים כגון תיוג ודור תפקודיים של ribozymes וDNAzymes. אחד האתגרים הגדולים מתגורר במורכבות של המתודולוגיה שמוביל לבידוד והאפיון של אנלוגים נוקלאוזידים אלה.

במאמר זה וידאו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינתזה של thesדואר שונה אנלוגים באמצעות זרחן ריאגנטים מבוסס (III). בנוסף, ההליך לאפיון ביוכימי שלהם הוא חשף, עם דגש מיוחד על תגובות הארכה תחל ופילמור עוקב TdT. פרוטוקול מפורט זה יהיה שימוש לצורפות של dNTPs שונה והשימוש נוסף שלהם בביולוגיה כימית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

triphosphates 5'-נוקלאוזידים ((ד) NTPs) מייצג סוג של ביומולקולות חיונית כי הם מעורבים בתהליכים אינספור פונקציות הנעים מלהיות המטבע האוניברסלי של אנרגיה לרגולטורים של חילוף חומרים בתא. בנוסף לתפקידם בשינויים הביולוגיים הבסיסיים אלה, עמיתים השונים קידמו כפלטפורמה תכליתית וקלה לכניסתה של קבוצות פונקציונליות לoligonucleotides, המתודולוגיה שיפה משלימה את הסינתזה מוצק שלב האוטומטי המיושמת בדרך כלל 1,2. ואכן, בתנאי NTPs (ד) יכול לפעול כמצעים לpolymerases RNA ו-DNA 3, עושר של קבוצות פונקציונליות כוללים חומצות אמינו 4-13, חומצות boronic 14,15, nornbornene 16, שאריות כמו diamondoid 17, תופעות שרשרות ל organocatalysis 18, חומצות מרה 19, ואפילו oligonucleotides 20 יכול להיות מוחדר oligonucleotides.

_content "> מעבר לייצוג וקטור נוח לfunctionalization של חומצות גרעין, יכול להיות מעורב dNTPs שונה בSelex ושיטות אחרות הקשורים קומבינטורית של בחירה במבחנה לייצור חומצות גרעין שונה קטליטי 21-30 וaptamers ליישומים מעשיים שונים 10, 31-36. צד רשתות נוספות שהוצגו על ידי פילמור של dNTPs שונה הם חשבו להגדיל את השטח הכימי שניתן לחקור בניסוי בחירה ולהשלים את הארסנל התפקודי עני למדי של חומצות גרעין 37. עם זאת, למרות אלה תכונות אטרקטיביות וההתקדמות האחרונה שנעשתה בפיתוחם של שני סינטטי ושיטות אנליטיות, לא ישימה באופן אוניברסלי והליך תשואה גבוהה קיימים לצורפות של triphosphates נוקלאוזידים הותאם 2,38.

מטרת הפרוטוקול נוכחי זה היא לשפוך אור לתוך (לפעמים) לא מובילים הליכים מורכביםo הסינתזה והאפיון ביוכימי של אבני הבניין הופעל אלה (איור 1). דגש מיוחד יינתן על כל הפרטים סינטטיים שלעתים קרובות קשים למצוא או נעדרים בסעיפי ניסיוני, אבל הם עדיין חיוניים להשלמה המוצלחת של המסלול הסינתטי שהובילה לבידודה של NTPs הטהור (ד) (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של triphosphates נוקלאוזידים השתנה

הגישה סינתטית נבחרה להלן השיטה שפותחה על ידי לודוויג ואקשטיין מאחר ושיטה זו היא בדרך כלל אמינה ומובילה למעט מאוד תופעות לוואי (איור 1 א) 39.

  1. Coevaporate נוקלאוזידים המוגן 3'-OAC כראוי (בדרך כלל 0.1 מילימול) פעמיים עם פירידין נטול מים (2 מיליליטר) ולאחר מכן יבש תחת ואקום הלילה. במקביל, pyrophosphate היבש tributylammonium (0.13 מילימול) תחת ואקום הלילה.
  2. ממיסים את נוקלאוזידים במינימום של פירידין היבש (0.2 מיליליטר) ולהוסיף dioxane היבש (0.4 מיליליטר) כcosolvent. לבסוף, להוסיף 2-כלורו-1-,3,2 benzodioxaphosphorin-4-אחד (0.11 מילימול) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות.
    הערה: ראוי לציין כי טיפול מסוים צריך לקחת עם המגיב ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-2-אחד כלורו-1. ואכן, גם אחסון של המגיב הזה, לפי atmosp גז אינרטיכאן הוא לא מספיק כדי למנוע הפירוק שלה. לפיכך, אפשר וצריך לגרד הלבן מוצקים שנוצר בפירוק זה לפני השימוש.
  3. הכן פתרון של pyrophosphate tributylammonium בDMF היבש (0.17 מיליליטר) וtributylamine טרי מזוקק (58 μl; לא להוסיף מסננות מולקולריות). מוסיף את הפתרון שהתקבל לתערובת התגובה (משקע לבן מופיע אבל מהר נעלם) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות.
  4. הכן פתרון של יוד (0.16 מילימול) בפירידין (0.98 מיליליטר) ו-H 2 O (20 μl) ולהוסיף לתערובת התגובה על מנת לחמצן Pα (שלישי) במרכז. אפשר הפתרון הכהה שנוצר כדי לעורר בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
  5. השתמש בתמיסה מימית 10% מNAS 2 O 3 כדי להרוות את עודפי 2. הסר את הממס תחת ואקום (הטמפרטורה של אמבט המים של המאייד הסיבובי חייבת להישמר מתחת 30 מעלות צלזיוס). הוספת H 2 O (5 מיליליטר) ולאפשר למילxture לעמוד בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות לhydrolyze מחצית אדנוזין המחזורי.
  6. בשלב זה, קבוצות הגנת מוסרים בדרך כלל (כלומר, 3'-OAC והקבוצות ברשתות בצד של Nucleobase). כתוצאה מכך, להוסיף 4 OH NH (30% H 2 O, 10 מיליליטר) לגולמי ומערבבים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר, ולהסיר את הממס תחת ואקום.
  7. הוסף 2 מיליליטר של H 2 O ופיצול ל 2 צינורות. הוספת 12 מיליליטר של פתרון 2% מ4 NaClO באצטון וצנטריפוגה (1,000 XG) במשך 30 דקות. הליך זה חוזר על עצמו עוד פעם אחת. משקעים זה מאפשר את ההפרדה של הממסים וחומרים כימיים המשמשים בסינתזה מאדנוזין (שיזרז), ובכך לפשט את טיהור RP-HPLC שהתפתח באופן משמעותי.
  8. אחרי אוויר ייבוש של השאריות שומניות, להקליט ספקטרום P-NMR יום 31 של גולמי (בעקבות הליכים סטנדרטיים, ראה גם רשימה של חומרים ואיור 3) ולפזר ב4 מיליליטר H 2 O.
    הערה: הליך סינטטי זה מתמקד בעיקר בדור של triphosphates deoxynucleoside שונה, אבל הליך דומה מאוד יכול להיות מיושם לעמיתי RNA שלהם (פשוט על ידי שימוש 2 ', 3'-BIS-acetylated O מבשרים).

2. טיהור HPLC של triphosphates נוקלאוזידים השתנה

  1. הכנת פתרון M מניית 1 של יקרבונט triethylammonium (TEAB): 40
    1. הכן פתרון של שומה 1 של triethylamine (139 מיליליטר) ב≈ 600 מיליליטר של H 2 O. מזוקק והמסונן
    2. בועת CO 2 (באמצעות קרח יבש וbubbler גז) לתוך התמיסה תחת ערבוב נמרץ, עד pH של 7.6 הוא הגיע (זה ייקח לפחות 10 hr). פתרון מניות זה ניתן לאחסן במקרר לתקופה של עד חודש אחד.
  2. טיהור:
    1. הכן שני פתרונות חיץ ממניות 1 M: 2 L של 50 מ"מ TEAB במי ultrapure (eluent)nd 1 ליטר של 50 מ"מ TEAB ב50% MeCN (eluent ב '). דגה גם eluents תחת ואקום וערבוב במשך 20 דקות (נדרש תשומת לב קפדנית על מנת שלא לשנות את רמת החומציות על ידי הסרת ה-CO 2 במהלך degassing).
    2. הכן מדגם אנליטית על ידי המסת 10 μl של אדנוזין הגולמי ב300 μl מזוקק H 2 O ולהזריק לתוך מערכת HPLC מצוידת בעמודה למחצה preparative RP (C18) ובאמצעות שיפוע החל 0-100% B ב40 דקות (איור 4). התאם את תכנית HPLC לפי t R של אדנוזין (שהיא בדרך כלל השיא העיקרי בהכרומתוגרמה) ודיפוספט (שבה יש לא R מעט נמוך יותר). לטהר את התערובת גולמי באמצעות תנאים אלה ועל ידי הסרת שברים מוקדמים שעשויים להכיל כמה דיפוספט.
    3. מערבבים את כל השברים המכילים את המוצר ולהקפיא יבשים (שהוא העדיף אידוי על המאייד הסיבובי על מנת למזער הידרוליזה לdiphosph לא רצויאכלתי). Coevaporate מספר פעמים עם המים ultrapure (כדי להסיר triethylamine שריד מeluents). להעריך את הטוהר של אדנוזין ידי תמ"ג (שני H 1 וNMR 31 בP) וMALDI-TOF על ידי יישום של פרוטוקולים סטנדרטיים (ראה איור 5). תשואות אופייניות מתקבלות על ידי יישום של פרוטוקול זה בדרך כלל לשקר בטווח של 30-70%, בהתאם למצע.

3. תגובות הארכת פריימר ופלמור TdT

  1. תיוג סוף 5'-של פריימר
    1. מערבבים 30 pmol של פריימר המתאים (למשל P1, רשימה של חומרים) עם 4 μl של 10x קינאז Polynucleotide חיץ (PNK), 3 μl של γ-[P 32]-ATP, μl 1 של PNK, וDDH 2 O (עבור בסך הכל תגובת נפח 40 μl). דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן חום לבטל את קינאז (10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס).
    2. במהלך תגובת התיוג להכיןעמודת G10 Sephadex ידי חיבור קצה פיפטה 1 מיליליטר עם צמר זכוכית silanized וממלא את הקצה עם פתרון G10 (10% בDDH 2 O, autoclaved). ספין למטה לשטוף שלוש פעמים עם 500 μl DDH 2 O ולשטוף סופיים אחד עם DDH μl 50 2 O. הפעל את תערובת התגובה דרך G10 (כדי להסיר את תווית רדיואקטיבית חינם).
    3. ג'ל לטהר (עמוד 20%) פריימר radiolabeled ולשחזר על ידי יישום של ההתאהבות ולספוג שיטה (elution כלומר עם 500 μl של תמיסה מימית המכילה 1% LiClO 4 ו 1 מ"מ נטה 3 (pH 8) בשעה 72 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות). משקע אתנול וG10 desalt oligonucleotide eluted.
  2. תגובת הארכת פריימר
    1. לחשל 1 pmol של P1 פריימר radiolabeled, 10 P1 פריימר pmol, ו10 pmol של T1 תבנית (רשימה של חומרים) בחיץ 10x תגובה (המסופק על ידי הספק של פולימראז לשמש) על ידי הצבת tאופה ב( 90-95 מעלות צלזיוס) מים חמים ועל ידי מתן אפשרות להתקרר בהדרגה לטמפרטורת חדר (מעל 45 דקות).
    2. שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (המכיל גם שונה וtriphosphates הטבעי, 100 מיקרומטר ריכוז סופי) ו1 U של DNA פולימרז (Vent (Exo -), Klenow, PWO או 9 ° N מ ') ולהשלים עם מים (על סך נפח תגובה של 20 μl). דגירה בטמפרטורה האופטימלית העבודה של האנזים (למשל 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כאשר Vent (Exo -) נמצא בשימוש).
    3. הוסף 20 μl של להפסיק פתרון (פוראמיד (70%), חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA; 50 מ"מ), bromophenol הכחול (0.1%), cyanol קסילן (0.1%)), לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), מגניב למטה (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. דמיין ידי Phosphorimager.
  3. פילמור TdT
    1. לדלל 7 pmol של אחד גדילים, P2 פריימר ללא תווית (רשימת החומרים), pmol 1 של פריימר radiolabeled במאגר TdT μl 1 10x.
    2. שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (בריכוז נאות המורכב בין 10 200 מיקרומטר) ופולימראז TdT (4 U). לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. הוסף 10 μl של להפסיק פתרון, לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), להתקרר (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד 15%). דמיין ידי Phosphorimager.

4. PCR עם triphosphates נוקלאוזידים השתנה

  1. מערבבים 8 pmol של שני קדימה לאחור פריימרים עם 0.5 pmol של התבנית להיות מוגבר. הוספת 10x חיץ תגובה וקוקטייל dNTP (לצורך ריכוז סופי 200 מיקרומטר) ולשים את הצינור על קרח. הוסף 1 U של פולימראז ה-DNA ולהשלים עם H 2 O להגיע נפח סופי של μl 20. מעביר את התערובת לתוך בקבוקון PCR ולבצע 30 מחזורי ה-PCR.
  2. לדלל 6 μl עם 6 μl של חיץ טעינת סוכרוז 2x ולפתור על ידי 2% agarose (מוכתם ברומיד ethidium) אלקטרופורזה. דמיין ידי Phosphorimager.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

triphosphates נוקלאוזידים שינוי הינו מפתים מטרות סינתטיות שכן הם מאפשרים להקדמה הקלילה של מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות לחומצות גרעין 41. עם זאת, הבידוד והאפיון של אבני הבניין הופעל אלה מתגלים לעתים קרובות להיות מפרכים. כתוצאה מכך, התוצאות הראו במסמך זה נחשבות לספק יד מסייעת לבצע את השלבים השונים בתהליכים ביוכימיים סינטטיים והאמורים (איור 1).

בפרט, איור 3 מציג ספקטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכללת שינויים בחומצות גרעין היא עניין של יישומים מעשיים רבים, כולל הפיתוח של סוכני antisense וantigene 42,43, תיוג ותיוג פונקציונלי של oligonucleotides 41, ובמאמצים להרחיב את האלפבית הגנטי 44-46. שינויים כימיים וקבוצות פונקציונליות בדרך כלל מוכנסים חומצות גרעין על ידי יישום של פרוטוקולי סינתזה מוצק שלב סטנדרטיים ואוטומטיים. עם זאת, אבני בניין phosphoramidite צריך להיות עמיד לתנאים הקשים למדי שהוטלו על ידי מתודולוגיה זו, אשר בתורו מטילה הגבלות חמורו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן השוויצרית הלאומית למדע (מענקי N ° PZ00P2_126430 / 1 וPZ00P2_144595). פרופ 'ג Leumann הוא הודה בהכרת תודה למתן חלל המעבדה וציוד, כמו גם לתמיכה המתמדת שלו. הגב 'סו Knecht הוא הודה לדיונים פוריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טריבוטילאמוניום פירופוספט Sigma AldrichP8533מוצק היגרוסקופי, שמור תחת Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one סיגמא אולדריץ'324124פירידין רגיש ללחות
סיגמא אולדריץ'82704מתחת למסננות מולקולריות
דיוקסאןסיגמא אולדריץ'296309מתחת למסננות מולקולריות
דימתילפורממיד (DMF)סיגמא אולדריץ'40248מתחת למסננות מולקולריות
אצטוניטריל פישר סיינטיפיקHPLC
טריאתילאמיןסיגמא אולדריץ'90342
טריבוטילמיןסיגמא אולדריץ'90781
ddH2O Milli-Qמים נטולי יונים ומטוהרים, אוטוקלאב בנוכחות דיאתילפירוקרבונט (DEPC
)דיאתילפירוקרבונט (DEPC)סיגמא אולדריץ'159220
D2Oמעבדות איזוטופ קיימברידג', בע"מDLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
טבעי dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA פולימראזNEBM0257S
DNA פולימראז I, שבר גדול (Klenow)NEBMO210S
9° Nm DNA פולימראזNEBMO260S
מסוף דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA פולימראזPeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Jupiter חצי הכנה RP-HPLC עמודה (5μ C18 300 Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
בקבוקוני PCRBioconcept3220-00
מערכת HPLCAmersham Pharmacia BiotechÄ kta בסיסי 10/100
כל האוליגונוקלאוטידים נרכשו ממיקרוסינת' וטוהרו על ידי PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
מידע נוסף על נהלים וציוד ניסיוני ניתן למצוא במאמרים הבאים:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPLCTdTNMRMALDI

מאמרים קשורים