לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

סיכום

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

תקציר

מלבד היותו פיגום פיזי כדי לשמור על מורפולוגיה רקמות, המטריצה ​​תאית (ECM) מעורבת באופן פעיל בויסות תפקוד תא ורקמות במהלך התפתחות והומאוסטזיס איברים. היא עושה זאת על ידי מתנהג דרך מסלולי איתות ביוכימי, ביומכנית, וbiophysical, כגון באמצעות שחרורו של שברי חלבון ECM ביו, המסדיר את המתח ברקמות, ומספקים מסלולים לנדידת תאים. המטריצה ​​תאית של microenvironment הגידול עוברת שיפוץ משמעותי, המתאפיין בשפלה, בתצהיר וארגון של חלבוני מטריצה ​​סיבי ולא סיבי. התקשות סטרומה של הגידול microenvironment יכולה לקדם את צמיחת גידול ופלישה, ולגרום לשיפוץ של כלי דם והלימפה. ההדמיה חיה של חלבוני מטריצה, עם זאת, לנקודה זו מוגבלת לcollagens סיבי שיכול להיות מזוהה על ידי דור השני הרמוני באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון, ומשאירה את רוב רכיבי מטריצת largely בלתי נראה. כאן אנו מתארים נהלים לחיסון גידול בעור אוזן הגב הדק, immunolabeling של חלבוני מטריצת חוץ תאיים והדמיה intravital של הרקמה נחשפה בעכברים חיים באמצעות epifluorescence ושני פוטונים במיקרוסקופ. שיטת ההדמיה intravital שלנו מאפשרת זיהוי הישיר של שני סיבי וחלבונים מטריצה ​​שאינה סיבי בהקשר של גידול עורי הולך וגדל. אנחנו מראים דוגמאות לשיפוץ כלי שיט הנגרמים על ידי התכווצות מטריצה ​​מקומית. מצאנו גם כי מטריצה ​​סיבי של הגידול זוהה עם הדור ההרמוני השני היא מובחנת מרחבית מרכיבי מטריצה ​​שהופקדו זה עתה כגון ג tenascin אנחנו גם הראו הדמיה לטווח ארוך (12 שעות) של אינטראקציה תא T עם תאים סרטניים ותאים סרטניים הגירה לאורך קולגן IV של קרום במרתף. יחדיו, שיטה זו מאפשרת באופן ייחודי לזיהוי בו זמני של תאים סרטניים, microenvironment הפיזי שלהם ואת התגובה החיסונית רקמות אנדוגני לאורך זמן, מה שעשוי provתובנות חשובות IDE למנגנונים שבבסיס התקדמות גידול והצלחה או עמידות לטיפול אולטימטיבית.

מבוא

ההדמיה intravital של תהליכי שיפוץ דלקתי, גרורתי ומטריקס כבר שטח חשוב של מחקר והניעה את היצירה של מודלים רבים מהונדסים כתב עכבר שמבטאים חלבוני ניאון ^1,2. בשל אותות ניאון מחוץ לפוקוס, אשר להפחית את איכות תמונה ואת גבולות חדירת האור דרך הרקמה, רקמה עבה הדמיה אפשרית רק עם confocal או סריקה רב פוטון מיקרוסקופית ^3. השימוש מהיר יותר, מיקרוסקופיה epifluorescence פחות יקרה והמורכבת היא אפשרית רק עם רקמות כמעט דו ממדים כגון קרום עוף Chorio-allantoic ⁴ או הדרמיס אוזן עכבר ^5. רוב מערכות ההדמיה לנצל את עכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון שונים באופן ספציפי לסוג תא. למרות שהחלבונים אלה מציעים phototoxicity החלש, הם לגרום תגובה חיסונית ^6. יתר על כן, קשה לעבור בין תת תא הספציפי או לסמןבסיס ir או מדינות הופעלו כשינוי כזה דורש הכנת מודל גנטי חדש. בנוסף, כביטוי חלבון פלואורסצנטי בדרך כלל מוגבל לתא תאיים, זה בדרך כלל לא ניתן למבנים תאיים תמונה כמו חלבוני קרום במרתף או בפיקדונות chemokine רקמת ^7. במקום זאת, תיוג עקיף עם נוגדנים כנגד אנטיגנים תאיים מציע גמישות עבור כמעט כל מרכיב תאים מסוג מסוים או מטריצה ^​​8,9. עם זאת, החסרון העיקרי של גישת תיוג זה קשור לimmunotoxicity בתיווכו של מתחמים חיסוניים אנטיגן נוגדן שיכול לגרום לרעילות השלמה מערכת תלויה תא וphagocytosis של תאים ומבנים תאיים ^10.

המטריצה ​​תאית של microenvironment הגידול, אלא גם של רקמה נורמלית במהלך דלקת או ריפוי פצע, עוברת שיפוץ משמעותי. התקשות סטרומה של microenvironment הגידול יכולה פרומוצמיחת te גידול ופלישה בשל מנגנוני איתות שנגרם עקב מתח ושיפוץ סיבה של דם וכלי הלימפה ^11. עם זאת, הדמיה חיה של חלבוני מטריצה ​​מוגבלת לcollagens סיבי שיכול להיות מזוהה על ידי דור השני הרמוני באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון. לאחרונה יש לנו שפורסם בשיטת הדמיה intravital רומן שימזער את הסיכון לפגיעה בצילום וחיסוני רעילה לתאים צילמו ומבני רקמה ^5. בהשוואה לשיטות הדמיה שהוקמו בו בסיבוב של ההדמיה intravital רציפה אחת הוא בטווח של 30 דקות עד 2 שעות ^12-17, immunofluorescence intravital הטכניקה (IF) אפשר 12 שעות (לטווח ארוך ⁸⁾ הדמיה. חשוב לציין כי בפעם ההדמיה מוגבלת ל12 שעות בשל מגבלות שנקבעו בפרוטוקול של בעלי החיים שלנו, אבל אין נגד סימנים טכניים שלא יכול להיות ממושך זה אם פרמטרים קריטיים לבריאותו של בעל החיים, כמו לחץ דם ולבהשיעור נשלטים על ^8. בנוסף, על ידי השימוש בסטראו הקרינה אוטומטית היינו יכול לאסוף תמונות מתחומים רבים במהלך ניסוי אחד ונצפיתי תהליכים חיסוניים ושיפוץ נדירים שהתרחשו בהקשר הפיזיולוגי של העור נתמך על ידי דם תפקודי וכלי הלימפה. בגלל עדשת stereomicroscopic יש 2 סנטימטר, מרחק גדול יחסית, עבודה וזאת בניגוד לאופטיקה המיקרוסקופית שני הפוטונים אינו דורשת אידוי טבילה במים, הדמיה לטווח ארוך בוצעה רק בסטראו הקרינה. Intravital אם מותר התיוג וזיהוי חיסוניים של כל רכיב מטריצה ​​תאי של העור הרגיל. העיצוב של טכניקה זו מבוסס על הקונספט החדשני של שימוש immunostaining לתאי חיים ואלמנטי מטריצת רקמת הדרמיס על עכבר שנחשף בניתוח מבלי לגרום להשפעות מזיקות immunotoxic ^5. ההליך הכירורגי עצמו הוא בטוח לדרמיס כלי דם כפי שהוא מסתמך רק על ההפרדה בין שתי שכבות עור באוזן, כי הם באופן עצמאי מעוצבבים, האכיל באופן אוטונומי על ידי דם ורוקן על ידי תפוצה הלימפה נפרדת. ההתקנה הניסיונית שלנו מאפשרת הדמיה של מגוון רחב של אירועי פתיו פיסיולוגיות חשובים על פני 12 שעות לפחות, ובכלל זה סחר בויקוציטים בין כלי דם והלימפה ותהליכי ריפוי פצע. בפרסום המקורי, בהשוואה הטכניקה שלנו לתקני מדינה-of-the-art בתחומים שונים של ההדמיה intravital. כתוצאה מכך, אנו נצפו extravasation כלי דם ואירועי intravasation הלימפה על ידי סוגים שונים של לויקוציטים, כולל ההדמיה הייחודית של תאים חיסוניים נכנסים איסוף במקום צפוי כלי הלימפה ראשוני ^15. כמו כן, המשלימים את התצפיות שנעשו על ידי קבוצות אחרות ^9,18, מצאנו כי בCCL21 vivo הוא מסוגל ליצור פיקדונות חזקים, רציפים על איסוף אבל רק לעתים רחוקות על lymphatics הראשונית.

= "Jove_content" ילדה> כאן אנו מתארים intravital שונה אם טכניקה שיכולה להיות משולב עם שני פוטונים במיקרוסקופ כדי לזהות רשת של collagens סיבי באמצעות דור הרמוני שני (SHG). אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם לפלישת תאי סרטן ההדמיה בהקשר של microenvironment הגידול הדינמי, הכולל מולקולות מטריצה ​​כגון C tenascin, כי הם נחקרו במידה רבה על ידי טכניקות הדמיה הנוכחיות ^19. מצאנו כי המטריצה ​​סיבי של הגידול, מזוהה עם הדור השני ההרמוני, תופסת מיקומים שונים של הגידול microenvironment יותר המטריצה ​​שהופקדה זה עתה מורכב מtenascin C. יתר על כן, אנו מתארים דוגמאות לשיפוץ כלי שיט הנגרמים על ידי התכווצות מטריצה ​​מקומית, ארוכים הדמיה טווח (12 שעות) של אינטראקציות תא T עם תאים סרטניים ונדידת תאים סרטניים יחד קולגן IV של הקרום במרתף. יכולים להיות צילמו אירועים כאלה בזמן ההקלטה בו זמנית פרמטרים פיסיולוגיים מקומיים כגון PE כלי דםrmeability וניקוז לימפטי.

פרוטוקול

כל ההליכים שבוצעו על בעלי חיים היו בהתאם קפדן עם השוויצרית חוק ההגנה על בעלי החיים, לפקודה בהגנה על בעלי חיים והפקודה על ניסויים בבעלי חיים. אנו מאשרים כי הוועדה שלנו בבעלי חיים המוסדיים טיפול ושימוש (IACUC), בשם ועדת מעקב דה de l'Etat דה ואוד (מספר אישור: 2687), שאושרה על המחקר הזה באופן ספציפי.

1. הרכבת חיסון גידול של האוזן

1. תרבות B16-F10-GFP בתאים מלנומה בצלחת פטרי 10 סנטימטר באמצעות DMEM + 10% FBS בתקשורת.
2. כאשר התאים הם מחוברות 80-90%, לשטוף אותם עם PBS ולנתק אותם על ידי trypsinization. ספין למטה תאים ב 1,500 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend את הכדור בפתרון מיליליטר רינגר 1 ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר Eppendorf. ספין שוב ולהסיר את כל supernatant למעט שכבה דקה של מדיום שנשאר רק מעל גלולה. Resuspend התאים לגמור עם תרחיף תא עבה.
3. להרדים את העכבר עם תערובת של ketאמין / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg) ולוודא כי בעל החיים הוא מורדם במידה מספקת על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עדין. להגדיל את ריכוז isoflurane בצעדים של .0.1% במקרה תנועות הם נצפו (למשל נסיגה של הכפה). שמור על עכבר על משטח רקטלי תרמיסטור בשליטת חימום (37 מעלות צלזיוס) במשך כל ההליך ולהגן על העיניים שלה עם משחת עיניים מתאים.
4. הכן את מזרק המילטון (33 מחט G, 10 מיליליטר מזרק נפח). הסר את מכסה הקצה עם המחט ולטעון 20 μl של תרחיף תאים בחלק העליון של חדר הקצה. למשוך בחזרה את הבוכנה עד 5 מיליליטר תרחיף נטען בתוך המזרק. הסר את התרחיף העודף מתא הקצה ולסגור את מכסה הקצה.
5. באמצעות סרט דביק, לתקן את הקצה הפרוקסימלי של האוזן על קצה אצבע. בזווית של ° 45, הכנס באיטיות את מחט מזרק המילטון בין הדרמיס הגבי והסחוס. ברגע שנכנס, לחדור הפרוקסימלי האוזן לדיסטלי בערך 2-3 מ"מ.
   הערה: ההליך של הזרקת תאים צריך להיעשות על ידי טכנאי מיומן ומוסמך. בנוסף תהליך זה חייב להיות לבצע לאט וברצף: ראשון המחט צריכה להיות ממוקם בצורה אופקית לעור אוזן ונוסף לאט לתוך הדרמיס האוזן. פעם אחת ורק אז בסוף המחט בעור, יש ללחוץ על המתג. לחיצה של הבוכנה תיזום חיסון תאים בעור. במקרה הלא הסביר של המחט עוברת שתי שכבות של הדרמיס האוזן, שכבת הסחוס ומזין את עורו של האדם שבצע את הניסוי, את הכאב שנגרם לאצבע experimentator צריך להיחשב כסימן מדאיג ולגרום לנסיגה מיידית של המחט מעור experimentator. במקרה שבוכנה לא צריך להיות לחוץ ועור צריך להיות מעוקר עם אלכוהול. לחלופין, חפץ דומם במקום אצבע יכול לשמש כדי לייצב את האוזן.
6. להזריק תרחיף תא 3 μl ולחזור בו את המחט מהאוזן באיטיות.בואו תאים סרטניים מהווים גידול מוצק ב7-9 ימים ובצעו את צמיחת הגידול באמצעות סטראו הקרינה.
7. לחלופין, לבצע את השלבים המוקדמים של אינטראקציה של תאים סרטניים עם מטריצת רקמה, להחיל 50 μl של 100,000 תאים סרטניים תלויים בפתרון של רינגר בדרמיס החשוף ומוכתם האוזן (לאחר שלב 3.3).

2. ניתוח אוזניים

1. שלושה ימים לפני הניסוי, לגלח את ראש העכבר, להשיר שער השערות סביב הראש והאוזן (10-15 שניות) ולשטוף עם מים.
2. להרדים את העכבר עם תערובת של חמצן וisoflurane (אינדוקציה 3-4% אחזקת 1-2%) humidified ולוודא כי בעל החיים הוא מורדם במידה מספקת על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עדין. להגדיל את ריכוז isoflurane בצעדים של .0.1% במקרה תנועות הם נצפו (למשל נסיגה של הכפה). שמור על עכבר על משטח רקטלי תרמיסטור בשליטת חימום (37 מעלות צלזיוס) במשך כל ההליך ולהגן על העיניים שלה עםמשחת עיניים מתאים.
3. לבנות פלטפורמה נעשתה מתוך 8 מגלשות היסטולוגיה הזכוכית מודבקות. הפך את העכבר על גבה ומניח בעדינות את אוזן גידול נושאות על הערימה של שקופיות זכוכית. השתמש בפסים קטנים של נייר דבק כדי לקבע את הקצוות הקדמי והאחוריים של האוזן לערימה.
4. חותכים את עור הגחון של האוזן לאורך antihelix של אפרכסת העכבר באמצעות אזמל. בעזרת פינצטה המעוגלת, בעדינות לקלף את הדרמיס הגחון וסחוס מהדרמיס הגב שבו הגידול היה מחוסן. משוך את עור הגחון וסחוס עם מלקחיים מעוקלים, וחושף את הדרמיס הגבי. הערה: אם כלי העיקריים של האוזן נחתכים או זרימת הדם לא לחזור לזרימה תקינה בתוך 15 דקות, האוזן לא ניתן להשתמש בהדמיה. תמיד לשמור על עור האוזן פתח רטובים באמצעות החיץ של רינגר ולהגן על הלחות באמצעות coverslip.
5. במקרה שיש כלי גידול צורת דימום מתמשך, לעצור את הדימום על ידי הוספת 100 μlתרומבין (5 U / ml) במאגר של רינגר (102 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl _2, לקטט נתרן 28 מ"מ) בחלק העליון של האוזן למשך 5 דקות.
6. שטוף את האוזן פעמיים עם כ 5 מיליליטר של החיץ של רינגר ולהסיר נוזלים מיותרים עם מגבונים סטריליים. מייד להמשיך לשלב הבא (אל תתנו לאוזן הפתוחה יבשה בכל נקודה!).

3. Immunofluorescence מכתים

החיץ של השימוש רינגר בתוספת סרום אדם (1:10), נוגדן polyclonal העכבר המשני לנוגדנים אנושיים (01:50), ו125 IU / מיליליטר (2.5 מ"ג / מיליליטר) aprotinin (חסימת חיץ) לכל הצעדים מכתים. Aprotinin מעכב קרישת plasmin קידום להגביל דימום ראשוני שעלולות להתרחש לאחר ניתוח.

1. מקפלים את החלק של האוזן עם הדרמיס הפתוח לconchae eminentia ולייבש את עור אוזן החיצוני שלא נפתח עם מגבונים סטריליים. לשתק את האוזן על הערימה של שקופיות זכוכית על ידי יישום 0.5 μl של דבק כירורגים לdorsa הקדמי והאחוריקצות ליטר. ואז, בעדינות לשטח את הדרמיס אוזן גב על משטח הזכוכית.
2. החל נוגדנים ראשוניים מיקוד מולקולות מטריצה ​​תאית בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח כולל של 100 μl חסימת חיץ לאוזן החשוף. מכסה את האוזן עם פיסת כיסוי כדי למנוע הפתרון מכתים לייבוש על קצות אוזניים. דגירה במשך 15 דקות. שטוף את האוזן פעמיים עם כ 5 מיליליטר של חיץ רינגר.
3. החל נוגדנים משני מתאימים או conjugates streptavidin (fluorophores עם גל עירור גבוה כגון 594 ננומטר או 647 ננומטר הם נוחים להדמית intravital) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח כולל של 100 μl חסימת חיץ לאוזן החשוף. מכסה את האוזן עם פיסת כיסוי והדגירה במשך 15 דקות. שטוף את האוזן פעמיים עם כ 5 מיליליטר של חיץ רינגר.

4. אינטראקציה של Splenocytes הופעל נישא בדם עם תאים סרטניים באתר

1. 7 ימים לאחר inoculation של מלנומה ה-GFP-B16-F10 על העור האחורי של עכבר congenic, להרדימו ולאסוף טחול. לבודד splenocytes עם הפרעה מכאנית של הטחול דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
2. splenocytes תווית במשך 8 דקות על 37 מעלות צלזיוס עם כתם האדום CMTPX הציטופלסמה תא (1 מיקרומטר PBS), לשטוף 4 פעמים ב15 מיליליטר על 4 מעלות צלזיוס ומייד להזריק עם מדיום חופשי 200 סרום μl לוריד הזנב של עכבר שאוזניה היו מחוסן עם B16-F10-GFP 7 ימים קודם לכן.

5. ההדמיה Intravital על ידי שימוש בסטראו

1. הדמיה לטווח קצר (עד 2 שעות), להוסיף למאגר של ascorbate-Ringer סטרילי מוכן טרי המכיל 140 ascorbate מ"מ נתרן, 10 HEPES מ"מ, 4 מ"מ KCl ו5 מ"מ CaCl _2, ב-pH של 7.5 (סופי החיץ של ascorbate-Ringer mOsM osmolarity 320) על גבי האוזן המשותקת. מכסה את האוזן עם coverslip ולהתחיל הדמיה באמצעות סטראו הקרינה עם עדשת 2X.
2. הדמיה לטווח ארוך(יותר משעה 2), הצב את היציאה של מחט (מחוברת למאגר המכיל המאגר של ascorbate-רינגר) תחת coverslip, על 0.5 סנטימטר מהאוזן. השתמש במשאבת peristaltic במהירות של μl / 1 דקות כל הזמן לספק החיץ של ascorbate-רינגר לתא תחת coverslip.
3. לשנות את עדשת 1X (מרחק עבודה 6 ס"מ) לעדשה 2X (מרחק עבודה 2 סנטימטר). פתח את תוכנת הרכישה ולהגדיר את ההגדרות של סטראו הניאון. במצלמה הגדרות לבחור 12 קצת כמו עומק צבע התמונה ולהתאים את טווח המצלמה של ערכים אפור בקנה מידה בין 0% (מינימום) ל.5.1% (מקסימום) ולהגדיר תיקון גמא ל2.
   1. רווח רכישה נקבע ל -1 (מינימום), עוצמת הקרינה ל1,000 (מקסימום), הגדלה מוגדרת 280X-320X ולהתאים את זמן חשיפת הימנעות יתר או תת חשיפה (זמן חשיפה צריך להיות שניות פחות מ 1). תלוי במספר תחומים הדמיה (בדרך כלל 10-20), מרווח זמן למחזור רכישה צריך להיות מוגדר להיותtween 1 עד 2 דקות. פעמים לקצר עלולות לגרום להלבנה וphototoxicity.
4. בחר כמה שדות המכילים תאים סרטניים, כמו גם חלבונים מוכתמים ECM (כמו באיור 3). שימוש בבמה הממונעת, לרכוש תמונות של הערוצים המתאימים ניאון (כמו ה-GFP וfluorophore 647 באיור 3) לאורך זמן (למשל כל 2 דקות).
5. לאחר הניסוי, להרדים את העכבר על פי הנחיות בעלי חיים מוסדיות. במקרה זה, בסופו של הניסוי, להרדים את העכבר הרדים ידי נקע בצוואר הרחם ואחריו exsanguination (זלוף intracardiac).

6. ההדמיה Intravital על ידי שימוש במיקרוסקופ multiphoton

1. שימוש בגריז סיליקון, לבנות חומה מעגלית של כ -2 ס"מ קוטר וגובה 2-3 מ"מ סביב האוזן, מתחיל בבסיס של האוזן. ודא שאין נקודות דולפים. מלא את המעגל עם החיץ של ascorbate-רינגר.
2. מקום עכברעל הבמה ולחבר את כרית החימום (37 מעלות צלזיוס).
3. תוכנה פתוחה רכישה ולהגדיר את ההגדרות של המיקרוסקופ multiphoton.
4. בחר עד ארבעה תחומים שונים המכילים תאים סרטניים וחלבונים מוכתמים ECM (כמו באיור 3). בדוגמא, את המנגינה הזאת לייזר Ti-Saphire 850 ננומטר של ה-GFP לאותת פוטון יחיד שלאחר מכן 647 לfluorophore 647 מכתים ולדמיין collagens סיבי עם SHG. לרכוש תמונות של הערוצים המתאימים ניאון (כמו ה-GFP וfluorophore 647 באיור 3) ודור שני הרמוני לאורך זמן, למשל כל 2 דקות, עם טבילה במים HCX APO 20X עם 1.00 עדשת NA ו -2 מרחק עבודה מ"מ.
5. לאחר הניסוי, להרדים עכבר הרדים עם נקע בצוואר הרחם ואחריו exsanguination (זלוף intracardiac).

תוצאות

עד כה, immunostaining ברקמת חיה אינו משמש בדרך כלל עקב היווצרות של קומפלקסים חיסוניים שמוביל לרקע גבוה מכתים וimmunotoxicity ^20. זה היה להתגבר על ידי מראש חסימה קולטני Fcγ על מקרופאגים רקמות, ובכך "מסנוור" את התאים האלה לimmunostaining החזק העקיף שלאחר מכן. כתיוג היה תאי, הלבנת phototoxicity וfluorophore יכולה להיות נשלטה על ידי טבילה של הרקמה בנוגדי חמצון טבעי שנאגרו, חומצה אסקורבית מליחות (איור 1). מאז התיאור הראשוני שלנו של שיטה זו ^5, שיפרנו את הטכניקה נגד הלבנת ואנטי phototoxic שלנו כך שphotobleaching יכול כעת לא רק להיות מעוכב אך לחלוטין מנע (איור 1). הדבר נעשה על ידי הטבעת האוזן בנפח גדול של נוגדי חמצון (100 μl) בתוך התא שבו האוזן היא משותק. שים לב שזמן הדמיה מתמדת 300 שניות מתאימה ל10 שעות של הדמיה, כאשר תמונות הןאסף עבור 500 אלפיות שניים בכל דקה אחת (הגדרות הדמיה ממוצע).

איור 1. Photobleaching וphototoxicity נעצר על ידי החלפת כלוריד עם ascorbate במאגר של רינגר והטבעת האוזן נחשפה ב100 μl נפח של פתרון זה. () רקמות היו מוכתמות ראשון עם נוגדן biotinylated נגד IV קולגן, המרכיב של הקרום במרתף. הצביעה מאוחר יותר זוהתה עם streptavidin-647 (אדום), ולאחר מכן כל הזמן צילמה ל300 שניות בשני חיץ רינגר הרגיל (פנל עליון) או ascorbate-רינגר (פנל התחתון) של. שים לב שזמן הדמיה מתמיד 300 שניות מתאימה ל10 שעות של הדמיה, כאשר תמונות נאספות ל500 אלפית שניים בכל דקה אחת (הגדרות הדמיה הרגילות). 25% המבריקים של piערכי עוצמת XEL הם בצבע ירוק. כימות (B) של ריקבון immunofluorescence (50% בלעומת רינגר 0% בascorbate-רינגר). ערכים היו מנורמלים לקרינה הראשונית. תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. סרגל קנה מידה ב, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חוקר את יחסי הגומלין בין תאים גרורתי של גידול וstroma גידול הוא חיוני כדי להבין את התהליך של נדידת תאי גידול וחסין גידול. סיבה לכך הוא stroma הגידולים הקשורים מלחין עד 90% ממסת הגידול ופעיל מווסת את צמיחת גידול והתפשטות גרורה ^21. עם זאת, תובנה מכניסטית לתוך כיצד נדידת התאים סרטניים כונני מטריצה ​​לכיוון או הלימפה או כלי דם חסר ^22. זה נובע בחלקו מהעובדה שim intravitalהזדקנות של חלבוני מטריצה ​​מוגבלת להדמיה של סיבים התבגרו של collagens סיבי באמצעות דור שני הרמוני במיקרוסקופ שני פוטונים ^23. לכן, התאמנו את השיטה שלנו להדמיה של רקמות microenvironment כולל כלי דם והלימפה, pericytes, עצבים, שרירים ותאי שומן לכלול הדמיה הישירה של רכיבי מטריקס. ניתן להבחין בין מבנים רבים המבוססים על המורפולוגיה שלהם לאחר immunostaining עבור רכיבי קרום במרתף כגון קולגן IV או perlecan (איור 2 א), לעומת זאת, מכתים ישיר לסמנים פני תא מסוימים, למשל Lyve1 (איור 2B ו-C) וpodoplanin (איור . 2C), בהמשך מאפשר הבחנה lymphatics הראשונית, נימים (Lyve1 ⁺⁾ מאספני הלימפה (Lyve1 ^-). מכתים את CCL21 הנכנס מטריצה ​​בעור גילה פיקדונות הכמוקין על קרום המרתף של IDE אספני הלימפהntified עם הצביעה לperlecan, proteoglycan סולפט heparan (איור 2 ד).

איור 2. דוגמאות לצביעה חיות באוזני עכבר רגילות. (א) מכתים לperlecan, מרכיב קרום במרתף, מתאר את כל כלי הדם והלימפה, עצבים, סיבי השריר ותאי שומן. (ב) מכתים Lyve1 מסמן את רשת נימי הלימפה הראשונית. (C) Co-מכתים עבור Lyve1 וpodoplanin, סמן הפאן הלימפה, מתאר רשתות של lymphatics הראשונית ואיסוף. ניתן הדמיה הדרמיס האוזן הגבי באמצעות מיקרוסקופ קלאסי epifluorescence (ללא חתך אופטי) כהדרמיס האוזן יש מספר נמוך של תאי שומן שאחרת היה לכסות תחום ההדמיה. נירוסטת CCL21 (ד ') נינג (ירוק) על קרום במרתף הלימפה מוכתם עבור perlecan (אדום). תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. סולם ברים בA ו-B, 1 מ"מ; ב-C, 100 מיקרומטר ו50 מיקרומטר בD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

והכי חשוב, חלבונים מבניים, כי בדרך כלל לא יכול להיות מזוהה על ידי SHG, שיטת זיהוי מטריצה ​​הקלאסית ^23, ניתן דמיינו. לדוגמא, מצאנו כי C tenascin (איור 3), חלבון מטריצה ​​שבא לידי ביטוי במהלך היווצרות גידול, ריפוי ודלקת ¹⁹ פצע מופקד במקומות שונים של stroma גידול מ collagens סיבי (איור 3 ב). ההטרוגניות מטריצה ​​זו עשויה להשפיע על חלוקת תאים סרטניים וגרור (איור 3 ג).

t "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 3. הדרמיס האוזן הגבי ניתן הדמיה בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון. שדה יחיד של B16-F10 גידול. stroma גידול היה שכותרתו עם נוגדן C tenascin ומכתים זוהה עם אנטי עזים-594 נוגדנים חמורים. Immunofluorescence של C tenascin (אדום) רשת מוצגת ובcollagens סיבי מזוהה עם דור השני הרמוני (SGH) בB. שתי רשתות אלה גבי עם תאים סרטניים (ציאן) ב-C (ממוזג). מטריקס גידול החדשה בסימן C tenascin אינה חופף עם collagens סיבי מזוהה עם SHG (ירוק). התמונה עם 44, ארבע פעמים בממוצע Z-חלקים עם Z-צעד 1.0 מיקרומטר נרכשה במצב עומק צבע 16 קצת. תמונות שנאספו עם מיקרוסקופ שני פוטונים. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעקבות immunolabeling של רכיבי מטריצת גידול שונים (לדוגמא C tenascin וקולגן IV) של מטריצת גידול שיכולנו זיהה מוגבל ואירועים פתאומיים של שיפוץ כיוונית מטריצת גידול (וידאו 1). כוחות המתפתחים בתוך microenvironment גידול עלולים לגרום להתרחבות או התכווצות של מטריצת גידול ובשיפוץ תוצאה והתארכות של כלי הדם של הגידול בהיקף דומה כפי שהראינו בעבר במקרה של ריפוי פצעים ^11,24.

וידאו 1. הרחבת מטריצת גידול שכותרתו עם קולגן IV (אדום) ו-C tenascin (ציאן) להאריך כלי דם (חץ) ופסיבי translocate שלושה תאים סרטניים (ירוק). התכווצות מקומית של כלי teascin C עשיר בגידול מטריצת translocate דם (structur האדום בכיוון אופקיה) על ידי כ 100 מיקרומטר במהלך 12 שעות של הדמיה. תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. לחצו כאן לצפייה בוידאו.

באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון עם תיוג fluorophore הוא בעייתי כמו שטף פוטונים המשמש בניסויים אלה להלבין במהירות צבעי ניאון שאינם מוגנים מפני התחמצנות ^25. כאן אנו מראים כי אנו יכולים לבצע מיקרוסקופיה זמן לשגות שני פוטונים תוך הדמיה בו זמנית מטריצת C tenascin immunolabeled עם photobleaching המינימלי של fluorophores אפילו במיקרוסקופ שני פוטונים צפיפות פוטון גבוהה (וידאו 2).

וידאו 2. Photobleaching רמה נמוכה של immunofluorescence tenascin C (אדום) במהלך שני פוטונים במיקרוסקופ. תאי B16-F10-GFP גידול (ציאן) היו צילמו באוזן הגב הפתוח 9 ימים לאחר החיסון. אות הניאון הייתה מוגנת על ידי יישום של ascorbate-החיץ של רינגר על רקמת הדמיה. דור שני הרמוני (ירוק) אינו חופף עם מטריצה ​​חדשה מיוצגת על ידי tenascin תמונת עומק צבע 16 קצת ג עם 11, ארבע פעמים בממוצע Z-חלקים עם Z-צעד 1.9 מיקרומטר נרכש במשך 15 דקות. תמונות נאספו כל דקה 1 5 שניות ב6 Z-מטוסים שנאספו. לחץ כאן לצפייה בוידאו.

אנחנו גם צילמו אינטראקציות חיסוניים תאים עם תאים סרטניים גרורתי. splenocytes כותרת CMTPX מעכבר גידול נושאות extravasated מכלי הדם הקשורים לגידול 8 שעות לאחר עירוי IV, פלש מטריצת הגידול ופעיל תיקשר עם תאים סרטניים על ידי יצירת קשר סלולרי לטווח ארוך (וידאו 2). מבני IV קולגן שכותרת Fluorophore-647 היו עמידים לphotobleaching במהלך 12 שעות של הדמיה.

וידאו 3. אינטראקציה של splenocytes כותרת CMTPX מגידול (B16-F10)-bחריש עכבר עם תאים בודדים של גידול (GFP-B16-F10). Splenocytes היה iv עירוי לאחר צביעת רקמות לIV קולגן. קולגן IV-ירוק (647), splenocytes אדום (CMTPX), ציאן B16-F10 (GFP). תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. שעות משך וידאו 12. לחץ כאן לצפייה בוידאו.

תאי גידול מבודדים טרי היו מעולף על הדרמיס האוזן החשוף מראש מוכתם עבור IV קולגן. אנחנו יכולים לצפות כי לאחר הקפדה על הרקמות כמה קבוצות של תאים החלו הגירה קולקטיבית לאורך קרום במרתף של כלי דם ותאי שומן.

וידאו 4. תאים סרטניים נודדים לאורך קרומי מרתף. עור אוזן רגיל מוכתם עבור קולגן IV (647, אדום) היה מצופה בתאי B16-F10-GFP טרי passaged וצלמה במשך 5 שעות. תאים סרטניים מסוימים שדבקו רקמות החלו הגירה קולקטיבית יחדקרום במרתף של כלי דם ותאי שומן. תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. משך וידאו:. 5 שעות לחץ כאן לצפייה בוידאו.

כמו כן, בגלל הדרמיס האוזן הוא כמעט דו ממדים, היינו יכול בקלות לאסוף כמויות גדולות של נתונים באמצעות stereomicroscopy הקרינה מהירה, במקום איטי יותר ויקר יותר confocal או מיקרוסקופיה multiphoton. עם זאת, אפשר גם להשתמש בכל אחת מהשיטות מיקרוסקופיה הסריקה ציינו עם intravital שלנו, אם הכנות (3 איור, 1 וידאו).

דיון

משמעות

כאן אנו מציגים גישת מיקרוסקופיה intravital רומן המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ודינמית של רכיבי המיקרו רקמות שונים, כוללים סיבי כמו גם חלבוני מטריקס כמו רשת. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה intravital הנוכחיות: (i) דימות פלואורסצנטי Intravital נעשתה שימוש במחקרים בזרימת דם, למשל, לעקוב אחר דליפה מומסת מהדם או לlymphatics, אבל לא כבר בשילוב עם immunostaining. (Ii) השימוש בעכברים מהונדסים גנטי כתב מאפשר לסוגי תאים מסוימים להיות צילמו, אבל דורש הזמינות שלהם (או מאמץ משמעותי כדי ליצור חדש) ומגביל את מספר האינטראקציה סוגי תאים שניתן ללמוד. (Iii) מטריצה ​​תאית ניתן הדמיה in vivo באמצעות דור שני הרמוני, אך טכניקה זו יכולה רק לזהות collagens הסיבי, והשאירה מספר רב של מרכיבים תאיים חשוביםכגון קרומי מרתף, fibronectins, tenascins, גורמי גדילה, כמוקינים וglycosaminoglycans רקמות מחוץ להישג יד למחקר הנוכחי. השיטה שלנו מתגברת על מגבלות אלה, ומאפשרת טכניקות הדמיה סטנדרטיות להיות משולבות ועוד יותר בשילוב עם immunostainings לסוגי תאים אחרים, מבני רקמות, פיקדונות של סולפט הפרין מחייבים גורמי גדילה (למשל VEGF ²⁶⁾ וכמוקינים (CCL21 ^5,18 ואיור. 2D ), או חלבוני מטריצת חוץ תאיים תוך מעקב דם ו / או תזרים הלימפה בו זמנית.

מגבלות

ההדמיה epifluorescence של IF intravital מוגבלת לדשי עור דקים, נשללו בהיפודרמיס העבה (רקמת שומן). למרות שאנו מצאנו כי הדרמיס אוזן הגבי הוא אופטימלי לחשיפה כירורגית מזיקה יחסית של עור האוזן, epifluorescence עם intravital אם טכניקה אינה מוגבלת לדרמיס אוזן ועלול להיות מיושם לדוגמההעור החשוף של אצבעות הרגליים או העור האחורי של עכבר שזה עתה נולד. צביעה מהירה נוגדן (15 דקות) בimmunofluorescence אם אינה תלויה בדיפוזיה פסיבית אך דורשת ניקוז לימפטי פונקציונלי וזרימת נוזל ביניים, ולכן אין כתמים ניתן להבחין אם כלי הלימפה הוא occluded ^27. בקנה אחד עם זה, כלי הלימפה כתם דם בכלי דם דולף ואז חזק יותר (כלי נפצעו, arterioles) ^5. ההפרדה הגבי ודשי עור אוזן הגחון היא הליך כירורגי קל אבל זה גורם לפגיעה בכמה נימים ומוות של תאים לתאי רקמות שונים. זו עלולה להיות בעיה כאשר אחד צריכה לחקור רקמות שלמות לחלוטין, למשל מסתכל על ההשפעה המתונה של תרופות על הישרדות תא. גם היישום של חומר נוגד חמצון, המשמש להגנה על העור מפני phototoxicity וphotobleaching אינו כולל את השימוש בטכניקת immunofluorescence intravital ללמוד למשל סטרס חמצוני רקמה או Biolog תחמוצת חנקןy.

לבסוף, מסנוור של מקרופאגים תושב רקמות עם מתחמים חיסוניים יכול להפעיל את התאים וההשפעה למשל המחקר של תגובה חיסונית רקמות והפעלת תאים דנדריטים אלה.

שינויים ופתרון בעיות

על מנת ללמוד סטרס חמצוני רקמה או ביולוגיה תחמוצת חנקן, ascorbate יש להחליף עם תקשורת רקמות אחרת תואמת שאינו מפריעה לתפוקה הניסיונית. כמו כן, יש להימנע מקולטני Fc חסימה על תאים חיסוניים עורי אם המטרה של המחקר היא הפונקציה וההפעלה של התגובה החיסונית הרקמות והפעלת תאים דנדריטים והגירה. ניתן לעשות זאת עם השימוש בנוגדנים משני עם בר Fc ביקע (F (ab) 2 שברי נוגדנים) או השימוש בנוגדן biotinylated וstreptavidin ניאון כמו ריאגנטים זיהוי.

יישומים עתידיים

אנו מציגים פנים חדשים וייחודייםחיוני אם טכניקה לרכיבים שאינם סיבי דימוי של מטריצה ​​תאית בגידולי עור להשתלה בשילוב עם סיבי זוהה-SHG וcollagens התבגר באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. אחד היתרונות של שימוש רב פוטון (או confocal) מיקרוסקופית על פני ההדמיה epifluorescence הוא אפשרות לערום-z ותוצאה המרחבית שיתוף לוקליזציה של אירועים המתרחשים בתוך מטריצה ​​תאית, למשל intravasation גידול לתוך הלימפה או כלי דם, אשר במקרה של מיקרוסקופיה epifluorescence סטנדרטית ניתן להסיק רק משינויים מורפולוגיים של התאים הפולשים. טכניקה זו יש פוטנציאל הרבה יותר רחב. לדוגמא, יש לנו להשתמש intravital IF כדי לחקור את המנגנון של חסימת הלימפה על ידי טיפול פוטודינמי הלימפה ספציפית ^27. יישומים אפשריים נוספים של שיטה זו כוללים, אך אינם מוגבלים לחקירה של חסינות עור בזמן דלקת, מנגנון של דחיית שתל או בשיטות של דם והלימפה צמיחת כלי ATIC במהלך tumorigenesis.

שלבים קריטיים בהליך

הצעד החשוב ביותר שיש לו השלכות קריטיות לקיום סביבת רקמה פיזיולוגית הוא הפרדה כירורגית של עור הגחון וסחוס מהדרמיס הגבי. חיתוך או הגורם לחסימת העורק או וריד הגדול תוביל לדימום יתר וחוסר חמצן ברקמות מקומי, אשר ישפיע על תגובה תאית לטיפולים ותא תנועה ^8. משתקות האוזן עם דבק כירורגים צריכים להיעשות בזהירות כשפיכת הדבק על לחשוף רקמה יגרום לפגיעה בלתי הפיכה לרקמה על ידי חסימה של כלי דם. הטמפרטורה של העכבר חייבת להיות מבוקרת ושמרה על 37 ° C. בנוסף, חמצן humidified צריך לשמש להרדמת isoflurane, כך שהעיניים וריאות להישאר humidified כראוי במהלך הניסוי. כמו כן, נתרן ascorbate חייב להיות מוכן טרי וה-pH שלה בדקה לפני השימוש.

ntent "> לסיכום, immunofluorescence intravital זה מגשר בזמן אמת, מדידות מקומיות של פונקציה פיזיולוגית עם הדמיה מולקולרית של אירועים תאיים מורכבים בעור העכבר. יתר על כן, בשיטה זו יש פוטנציאל גדול כפי שהוא יכול להיות מיושם בקלות לדוגמה: מחקר שלאחר התפתחותיים מנגנונים של דם והלימפה אנגיוגנזה או לדמיין את השלבים המוקדמים של זיהום בעור על ידי סוכני פתוגניים שונים. בזכות הגמישות שלה ואת פוטנציאל תפוקה גבוהה, טכניקת intravital זה יכול לתרום באופן משמעותי לתחומים רבים של ביולוגיה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברי זן
BALB/C עכברים (8-12 שבועות)	צ'ארלס ריבר		, אורלינס, צרפת
C57/Bl6 (8-12 שבועות)	Harlan		Carshalton
UK Cell Line
B16 F10 מלנומה המבטאת OVA-GFP
תחזוקת הרדמה
איזופלואורן	מנרד בע"מ	2222	Minrad Inc., באפלו, ניו יורק
מערכת אספקה לחה	Rothhacher GmBH		ברן, שוויץ
מערכת בקרת טמפרטורה DC	FHC Inc		Bowdoin, MA
סטריאומיקרוסקופ
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי עם במה ממונעת .	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, גרמניה
עדשת 1X (הגדלת מערכת ליניארית מ-7.5X ל-160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, גרמניה
עדשת 2X (הגדלת מערכת ליניארית מ-15.6X ל-320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, גרמניה
מצלמת DFC 350 FX נשלטת על ידי תוכנת LAS AF	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, גרמניה
מיקרוסקופיה מולטיפוטון
LEICA SP5, מכפיל שני פוטונים, שלב ממונע	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, גרמניה
HCX APO 20X/1.2 טבילת שמן
זיקית אולטרה לייזר
בופר רינגר (102 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl<תת>2, 28 מ"מ נתרן לקטט)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, גרמניה
אפרוטינין	אלסטין	AP92	אוונסוויל, מיזורי
ת'רומבין	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, גרמניה
נתרן אסקורבט	סיגמא-אולדריץ'	11140-50G	טאופקירכן, גרמניה
סרום עכבר מורם כנגד IgG  אנושי;	Abcam	ab34834	קיימברידג', בריטניה
קולגן IV	Abcam	AB6581	קיימברידג', בריטניה
Perlacan	RnD	ab79465	מיניאפוליס, מינסוטה
Tenascin C	RnD	AF3358	מיניאפוליס, מינסוטה
פודופלאנין	RnD	AF3244	מיניאפוליס, מינסוטה
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, גרמניה
CCL21	RnD	AF457	מיניאפוליס, מינסוטה
סטרפטווידין פסיפיק בלו	Invitrogen	S11222	גרנד איילנד, ניו יורק
Streptavidin Alexa 647	Invitrogen	S21374	גרנד איילנד, ניו יורק
Streptavidin Alexa 488	Invitrogen	S11223	גרנד איילנד, ניו יורק
חמור נגד עזים 594	Invitrogen	A21113	גרנד איילנד, ניו יורק
חמור נגד ארנב 594	Invitrogen	A21207	גרנד איילנד, ניו יורק
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	קרלסבד, קליפורניה
היסטוקריל (דבק כירורגי)	בראון אסקולאפ	1050060	טוטלינגן, גרמניה
ריאגנטים לתרבית תאים
דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
סרום בקר עוברי (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, ניו יורק