פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן. המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר זיהוי מהיר של חיידקי colorimetric Escherichia coli, סלמונלה spp., ויסטריה מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות. כאן, מים מסוננים דרך הטושים השתנה סטרילי מור (MMS), שמורכבים ממסנן גזה פשוט סגור במחסנית פלסטיק, להתרכז חיידקים. לאחר סינון, מוספים להלא סלקטיבי או סלקטיבי לחיידקי היעד מבוצעים ב- MMS. לגילוי colorimetric של חיידקי היעד, ההעשרה מכן assayed באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) משובצים עם מצעי חיידקים אינדיקטיביים. כל מצע מגיב עם אנזימים חיידקיים היעד מעיד, שהניבו מוצרים צבעוניים שיכול להיות מזוהה מבחינה ויזואלית (זיהוי איכותי) בμPAD. לחלופין, תמונות דיגיטליות של μPADs הגיב יכולות להיות שנוצרו עם סריקה משותפת או מכשירי צילום ונותחו באמצעות תוכנת ImageJ, אלגעייה לפרשנות אובייקטיבית וסטנדרטית יותר של תוצאות. למרות נהלי ההקרנה ביוכימית נועדו לזהות את החיידקים פתוגנים האמור, במקרים מסוימים המיוצרים על ידי אנזימי חיידקי רקע או השפלה של מצעי colorimetric עשוי לייצר חיובי כוזב. לכן, יש צורך באישור שימוש מפלה יותר לאבחון. יחד עם זאת, פלטפורמת ריכוז וזיהוי חיידקים זה היא זול, רגיש (0.1 CFU / גבול גילוי מיליליטר), קלה לביצוע, ומהירה (ריכוז, העשרה, וזיהוי מבוצעים בתוך כ 24hr), מצדיקים את השימוש בו כשיטת סינון ראשונית לאיכות המיקרוביאלית של מים לחקלאות.
מבוא
חשוב שסוכני מחלה במזון מזוהים במהירות ורצוי בהגדרות המבוסס על שדה במטרה להפחית את הנטל של מחלה במזון. אסטרטגיות נפוצות כדי לזהות חיידקים פתוגנים במזון כוללות אפיון ביוכימי, culturing סלקטיבית והפרש, בידוד וזיהוי של מערכת חיסון, וזיהוי מולקולרי. עם זאת, שיטות אלה הקשו על ידי זיהום סדיר, גודל מדגם קטן נבדק, הריכוזים נמוכים לעתים קרובות של החיידקים פתוגניים במזון, דורשים זמני עיבוד ארוכים, ו / או אינם ישימים להגדרות שדה. יתר על כן, תרכובות במטריצות מזון רבות מוגבלים לזיהוי ואבחון יישומים. על מנת לשפר את הסיכוי לגילוי חיידקים, ארצות הברית מנהל המזון והתרופות אמריקניות הציעו כי בדיקות מים לחקלאות (כגון מים מים לשטוף והשקיה) אשר גם ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ריכוז חיידקים מכמויות גדולות של מים לחקלאות באמצעות MMS
- MMS הכנה
- לחתוך קטע מלבני של אריג 4 רובדי מדידת 40 x 12 סנטימטר.
- מקפלים את הגזה לאורך שני הצירים כדי להשיג מלבן 20 x 6 סנטימטר.
- מגלגל את הגזה בחוזקה לאורך הציר הארוך שלה כדי ליצור ספוגית גלילית של כ 6 סנטימטר ו -3 ס"מ קוטר.
- החיטוי ספוגית הגזה ברדי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כפי שתואר בפרוטוקול זה, ריכוז של חיידקים באמצעות MMS (איור 1) יכול להתבצע בתוך כ 15-20 דקות. MMS בנבנה מאקריל ניטריל אקרילוניטריל (ABS) בשני מרכיבים נפרדים; מיכסה ומחסנית הן עם הרכבה רז שולבה בי ספוגית גזה גלילית מוכנסת (איור 1 א). לאחר מכן שני הרכיבים דפוקים יחד ויוצרים MMS (איור 1). עיבוד מבוסס MMS הוא מונע על ידי משאבת peristaltic סוללות, המאפשר דגימות להיות מרוכזים בהגדרות שדה. על ידי צימוד ריכוז MMS, העשרה סלקטיבית (18-24 לשע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה משולבת לאיתור E. coli, סלמונלה spp., ול ' חיידקי במים לחקלאות. כאן, ריכוז MMS של חיידקים מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות, בשילוב עם העשרה בקטריאלי, וזיהוי colorimetric חיידקים-מעידים באמצעות μPADs. הליך MMS יכול להתמודד עם תוכן גבוה חלקיקים בדגימות המים תוך התמקדות החיידקים פי 10, הוא איתן ודי פשוט עבור יישומים בתחום על ידי אנשים שקבלו הכשרה מינימאלית, וניתן לבצע עם עלויות מינימליות. על ידי שילוב של צעד העשרת חיידקים, חיידקים חיים מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו אסירי תודה על המימון לפרויקט זה ממענקי המכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי לשנים 2009-01208 ו-2009-01984.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חקלאיים | מי השקיה, מי שטיפה לייצר, מי באר וכו'. | ||
| צינורות ויניל | Wilmar | BN-CVT1005 | קוטר פנימי של 1/4 אינץ', קוטר חיצוני של 3/8 אינץ', זמין ב: http://www.wilmar.com |
| מחסנית ספוגית מור שונה | Lumiere Diagnostics | 11 ½ ס"מ אורך ו-4 ½ ס"מ רוחב, זמין ב: http://www.lumierediagnostics.com. לחלופין, ניתן להשתמש בגרסה לא חד פעמית של המחסנית (עיין בטקסט) | |
| בד גבינה | מגב צ'ספיק & אספקה בע"מ | CC90 | כיתה #90, 44 x 36 אריגה, זמין ב: |
| www.raglady.com אקונומיקה ביתית | ריכוז נתרן היפוכלוריט שונים | ||
| נתרן תיוסולפט 5-הידראט | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| סעפת | מובנה בבית | אופציונלי, ניתן לבנות את המכשיר מצינורות PVC ואביזרים מתאימים | |
| משאבה פריסטלטית | מדי מיקרון | RPP1300 | זמין ב: http://www.micronmeters.com |
| פיפטה סרולוגית | חד | פעמית | |
| מרק העשרה אוניברסלי | Difco | 223510 | |
| מי פפטון חוצצים | Difco | 218105 | |
| תוסף סלמונלה | Biomé rieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) מרק | Biomé rieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | |
| http://www.sigmaaldrich.com Pipet-Aid | שונים | Drummond DP-110 בשימוש כאן | |
| חממת טלטול | שונים | Excella E25, ניו ברונסוויק סיינטיפיק בשימוש כאן | |
| Micropipette | שונות | 10 μ l, 1 מ"ל | |
| קצות מיקרופיפטה | שונים | , 10 μ l, 1 מ"ל | |
| 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה | שונים | RNase ו-DNase | |
| סוניקטור בדיקה | Q Sonica LLC | XL-2000 סדרה | |
| ומיקרו; PADs | Avant | עיגולים מודפסים בשעווה בקוטר 7 מ"מ, בעובי קו של 4 נקודות. צור קשר עם ד"ר צ'ארלס הנרי למידע נוסף | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′ -2-חומצה אתנסולפונית ] | סיגמא-אולדריץ' | H3375 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אולדריץ' | A8022 | |
| כלורופנול אדום-גלקטופירנוזיד (CPRG) | סיגמא-אולדריץ' | 59767 | |
| 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-ובטא;-D-גלוקורוניד (X-גלוק) | סיגמא-אולדריץ' | B8174 | |
| 5-ברומו-6-כלורו-3 אינדולילקפרילט (מג'נטה קפרילט) | סיגמא-אולדריץ' | 53451 | |
| 5-ברומו-4-כלורו-מיו-אינוזיטול פוספט (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| צלחות פטרי, פוליסטירן 100 מ"מ על 15 מ"מ | שטוחה סטרילי | שונים | |
| סורק | של Xerox | ||
| תוכנת ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
מקורות
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
