מאמר שיטה

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ

DOI:

10.3791/51418

⸱

25 במרץ 2014

 , 
1Department of Biochemistry, Purdue University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות עוברי וזחל melanogaster דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית מאוד של סוגי תאים, אשר יכול לסבך את הניתוח של ביטוי גנים ברקמות אלה. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, ייתכן שיהיה צורך לבודד את סוגי תאים ספציפיים עם טוהר גבוה ובתשואות מספיק עבור יישומים במורד כגון פרופיל תעתיק וimmunoprecipitation הכרומטין. עם זאת, המורפולוגיה בלתי סדירה הסלולרית ברקמות כגון מערכת העצבים המרכזית, בשילוב עם האוכלוסייה נדירה של סוגי תאים ספציפיים ברקמות אלה, יכול להוות אתגר לשיטות מסורתיות של בידוד תא כגון microdissection לייזר ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) . כאן, גישה חלופית לאפיון פרופילי ביטוי גני תא ספציפי באמצעות בידוד המבוסס על זיקה של גרעינים מתויגים, ולא תאים שלמים, הוא תאר. גרעינים בג הספציפיסוג ell עניין מסומנים גנטי עם תג EGFP גרעיני מקומי מעטפה באמצעות מערכת הביטוי בינארי Gal4/UAS. יכולים להיות מבודדים גרעינים מתויג EGFP אלה באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP שהם מצמידים את חרוזים מגנטיים. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשר בידוד של גרעינים עולה בקנה אחד מסוגי תאים מסוימים במערכת העצבים המרכזית דרוזופילה הזחל בטוהר גבוה וברמות מספיקות לניתוח ביטוי, גם כאשר אלו סוגי תאים מהווים פחות מ -2% מכלל האוכלוסייה בתא רקמות. גישה זו יכולה לשמש כדי לבודד גרעינים ממגוון רחב של דרוזופילה עוברית וסוגי תאי זחל באמצעות Gal4 נהגים ספציפיים, ועשויה להיות שימושי עבור בידוד גרעינים מסוגי תאים שאינם מתאימים לFACS או microdissection לייזר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות דרוזופילה כגון מערכת העצבים המרכזית מכילות תערובת מורכבת של סוגי תאים. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, יש צורך קודם כל לבודד אוכלוסייה הומוגנית של תאים ספציפיים בכמויות מספיקות כדי לאפשר ליישומים במורד הזרם. שיטות לבודד תאים מרקמות שלמות כוללות microdissection לייזר, ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) של כל תאים. בעוד FACS נעשה שימוש כדי לבודד את התאים וגרעינים מעוברי דרוזופילה ומelegans Caenorhabditis לביטוי גנים והכרומטין פרופיל 1-3, FACS וmicrodissection הלייזר יכולים להיות קשים לביצוע בהצלחה ברקמות המכילות סוגים מעורבבים מאוד תא או תאים מכילים שעם מורפולוגיה לא סדירה, כגון תאי עצב. כדי להתגבר על הקושי הזה, יכול להיות מבודדים מסוגי תאים ספציפיים גרעינים ולא תאים ומשמשים לדור הבאביטוי פרופיל דואר. חשוב לציין, ניתוח ביטוי mRNA microarray המבוסס באמצעות דגימות RNA גרעיניות מראה תוצאות בדרך כלל דומות לזו שבוצעה באמצעות RNA הכולל 4, 5. יתר על כן, ניתוח ביטוי גנים באמצעות RNA הגרעיני שמש בהצלחה ללמוד ביטוי גנים באורגניזמים רבים, כולל ג elegans, thaliana ארבידופסיס, דרוזופילה, ובני אדם 4, 5 2, 3.

לאחרונה כמה גישות תוארו לבידוד של אוכלוסיות ספציפיות של גרעינים שכותרתו מרקמות דרוזופילה המתאימים לניתוח ביטוי גנים ו / או immunoprecipitation הכרומטין. הבידוד אצווה של הכרומטין רקמות ספציפיות לשיטת immunoprecipitation (סיביות שבב) מנצל FACS לבודד את גרעינים קבועים על הבסיס של ביטוי תאים מסוג מסוים של ה-GFP-לוקליזציה הגרעינית 2. גישה זו כבר successfully משמש כדי לנתח את התפלגות שינויי היסטון וגורמי שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין של גרעינים מבודדים מהמזודרם בעוברי דרוזופילה 2. עם זאת, גישות מבוססות FACS עשויות להיות פחות מתאימות לבידוד גרעינים שכותרתו, המהווים רק חלק קטן מאוכלוסייה מעורבת בשל זמן מין המוגבר הדרוש כדי להשיג מספרים מתאימים ליישומים במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה קבוצות יש שימוש בטכניקות בידוד מבוסס זיקה לטהר גרעינים שמסומנים עם epitope ספציפי בסוג תא מסוים. לאחרונה הבידוד של גרעינים מתויגים בסוגי תאים מסוימים בשיטה (שלמה) שפותחו לשימוש בthaliana ארבידופסיס 6, 7 הותאם לשימוש בדרוזופילה 8. בשיטה זו, חלבון היתוך מעטפת גרעין שהוא מצע לin vivo biotinylation הוא coexpresSED עם האנזים ביוטין החיידקים Escherichia בירה בסוגי תאים ספציפיים. גרעינים שכותרתו ביוטין יכולים להיות מטוהרים לאחר מכן מאוכלוסיות מעורבות באמצעות בידוד זיקה מבוסס streptavidin. שימוש בגישה זו, גרעינים תויגו בהצלחה ומבודדת מהמזודרם בעוברי דרוזופילה בי חלבון היתוך מעטפת הגרעין באו לידי ביטוי בשליטה של משפר המזודרם ספציפי 8. המחברים גם נוצרו חלבוני איחוי מעטפת גרעין שיכול לבוא לידי ביטוי בכל סוג תא שבשליטתו של רצף הרגולציה Gal4, 9 כטב"מ. גישה זו היא מסוגלת במהירות בידוד תת קבוצות של גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות מעורבות, אבל דורשת שלושה מבנים מהונדסים נפרדים ולכן עשוי להיות מתאים ליישומים גנטיים מסוימים. לאחרונה, גישה שתוארה שביום ראשון (S AD1 והאו"ם C-84) המכיל חלבונים תחום זה בתרגום להממברנה הפנימית של מעטפת הגרעין תויגו עםחלבוני ניאון והביע תחת שליטה של מערכת Gal4/UAS 10. גרעינים היו מבודדים בנוכחות של חומר ניקוי nonionic להסיר את הקרום החיצוני של מעטפת הגרעין, וזיקה מטוהרת באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים אנטי-GFP. גישה זו משמשת בהצלחה לבודד אוכלוסיות קטנות של גרעינים שכותרתו מתת עצביים ספציפיים במוח הבוגר בדרוזופילה 10.

כאן, פרוטוקול לבידוד של גרעינים שכותרתו מאוכלוסייה מעורבת של תאים מרקמות זחל דרוזופילה מתואר. שיטה זו פותחה באופן עצמאי, אך דומה לגישה שתוארה על ידי הנרי ואח'. 10 ראשית, גרעינים תויגו עם תג הניאון שבא לידי ביטוי רק בסוגי תאים מסוימים בדרוזופילה melanogaster כדי להקל על הבידוד הבא של גרעינים מתויגים מאוכלוסיות מעורבות באמצעות גישה המבוססת על זיקה. כדי לתייג את הגרעינים,תחום KASH (larsicht K / omology שעות yne NC-1 / S) נוצל. תחום KASH הוא תחום הטרנסממברני שמתאים להממברנה החיצונית של מעטפת הגרעין, בחלקו דרך אינטראקציות עם חלבונים המכיל תחום SUN בתוך המרחב perinuclear 11. תחום KASH טרמינל C-של חלבונים כגון דרוזופילה MSP-300 וKlarsicht מעגן את החלבונים האלה קרום הגרעין החיצוני, בעוד תחומים N-מסוף שלהם אינטראקציה עם חלבוני שלד תא, כגון אקטין או microtubules ב12-14 ציטופלסמה. בונה נוצרה בי תחום KASH של דרוזופילה MSP-300 היה התמזגו לC-הסופית של EGFP, תחת שליטה של רצף Gal4 רגולציה, כטב"מ בוקטור pUAST-attB 15, 16. באמצעות אינטגרציה באתר ספציפי phiC31, זבובים מהונדסים נוצרו בי כטב"מ-EGFP :: transgene MSP-300 KASH הוכנס בלוקוסי attP2 על כרומוזום3L 17. כטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH זבובים ניתן חצו עם זבובים המבטאים את נהג Gal4 בסוג תא מסוים, וכתוצאה מכך הביטוי הממוקד של EGFP בקרום הגרעין החיצוני בסוג התא של עניין. אז יכולים להיות מטוהרים גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות תאים מעורבים באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP מצמידים את החרוזים מגנטיים. בגישה זו, השימוש בחומרי ניקוי nonionic לא נדרש כי תג EGFP הוא מקומי לצד cytoplasmic של קרום הגרעין החיצוני, ולכן נגיש לנוגדנים.

הפרוטוקול המתואר להלן יכול לשמש כדי לבודד / להעשיר את הגרעינים שכותרתו EGFP מסוגי תאים ספציפיים ברקמות זחל דרוזופילה, לכמת את טוהר ואת התשואה של גרעינים מבודדים, וכדי לחלץ RNA הגרעיני מתאים לתגובת שרשרת כמותיים הפוך שעתוק פולימרז (qRT -PCR) ניתוח ביטוי גנים. הבידוד וזיקה לטיהור של גרעינים (לא כולל Tissuנתיחת דואר) יכולה להתבצע בפחות משעה. תוצאות מוצגות מראים כי גרעיני גליה ניתן לבודד בהצלחה מהאונה אופטי זחל ודיסק דמותי בעיניים, ומשמשים לניתוח ביטוי גנים שלאחר מכן. זה צפוי כי גישה זו תהיה שימושית עבור הבידוד / ההעשרה של גרעינים שכותרתו מרקמות עוברי וזחל שבו תאי היעד מהווים פחות מ -5% מכלל האוכלוסייה. כל מניות דרוזופילה ופלסמידים שנוצרו במחקר זה הם זמינים מהמחברים על פי דרישה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור ואפיון של EGFP :: KASH דרוזופילה

  1. נהג הצלב Gal4 טס לכטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH זבובים. לחלופין, זבובי רקומביננטי שנושאים גם את נהג Gal4 וtransgene כטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH יכולים להיות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות גנטיות סטנדרטיות. גישה שנייה זה יתרון אם מספרים גדולים של צאצאים נדרשים.
  2. לאפיין ביטוי של סמן EGFP :: KASH תוך שימוש בטכניקות במיקרוסקופ רגיל. הערה: ביטוי EGFP ניתן לצפות על ידי טכניקות מיקרוסקופ רגילות ברקמות דרוזופילה גזורים, קבועים, או בכל זחלים, ואינו דורש שימוש בנוגדן.
    1. לקבוע את דפוס הביטוי של EGFP :: סמן KASH בהאורגניזם כולו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח (ראה PDF חומרים). הערה: נהגי Gal4 רבים, כולל נהג repo-GAL4 מוצג באיור 1, n התערוכהדפוסי onspecific ביטוי ברקמות זחל אחרים כגון בלוטת הרוק (ראו תוצאות).
    2. נתח את דפוס ביטוי EGFP :: KASH ברקמה גזור של עניין באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
      1. לתקן את הרקמות של עניין באמצעות פורמלדהיד בריכוז סופי של 4%, וה-DNA כתם באמצעות DAPI בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר כדי להמחיש את הלוקליזציה של EGFP :: KASH תג ביחס ל-DNA.
      2. לרכוש תמונות או באמצעות אובייקטיבי 40X / 1.30 שמן טבילה או אובייקטיבי 20X / 0.75 טבילת שמן, תלוי בגודל של הרקמה של עניין. תנאי עירור / הפליטה הבאה יכולים לשמש לרכישת תמונה: 408 nm/425-475 ננומטר (DAPI); 488 ננומטר / 525-550 ננומטר (GFP).

2. לבודד את הגרעינים מרקמות הזחל דרוזופילה

  1. הכן את הציוד לנתיחת רקמות הזחל ובידוד גרעינים שלאחר מכן. שים לב כיעובר Dechorionated השלם יכול לשמש גם כחומר מוצא אם תרצה בכך. מומלץ להשתמש ברקמות זחל גזורים באופן חלקי ולא כל זחלים אם סוג התא של עניין נמצא ברקמות ספציפיות, כגון דיסק דמותי. הפעולה זו מפחיתה ספציפי מחייב, וגם מבטלת בעיות שיכולים להיגרם על ידי ביטוי של כמה נהגי Gal4 בתאי nontarget.
    1. הכן שני זוגות מלקחיים חדים (ראה חומרים PDF), צלחת זכוכית אחד siliconized 9 היטב (ראה חומרים PDF), וPBT (1x PBS, pH 7.4; 20-Tween 0.1%).
    2. Prebind נוגדן ה-GFP לחרוזים המגנטיים. יש להתחיל את הצעד הזה לפני תחילת הניתוח. הוסף 10 μl של חרוזים המגנטיים (Invitrogen, ראה חומרים PDF) ו -2 מיקרוגרם של נוגדן ה-GFP (רוש, ראה חומרים PDF) ל400 μl של חיץ לשטוף (1x PBS, pH 7.4; 2.5 מ"מ MgCl 2) בצינור 1.5 מיליליטר . כמות חרוזים ונוגדנים המשמשים יכולה להיות מותאמת במידת צורך על בסיס הסכום של היעד בסאםple והזיקה המחייבת של הנוגדן לחרוזים.
    3. דגירה חרוזים ונוגדנים עם סיבוב לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    4. מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים ונוגדנים במעמד המגנטי (ראה חומרים PDF) ולאפשר חרוזים להיקשר המגנטי למשך כ 1-2 דקות. הסר את supernatant המכיל את הנוגדנים מאוגדים ולשטוף חיץ באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. חרוזים יישארו מחויבים לקיר של צינור 1.5 מיליליטר בצד הסמוך למגנט.
    5. יש לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מיליליטר של הצפה לשטוף בכל פעם כאמורה בסעיף 2.1.4. הסר את צינור 1.5 מיליליטר מהמדף המגנטי ולהפוך לרגע כדי לערבב את חרוזים ולשטוף חיץ במהלך כל שלב לשטוף.
    6. אחסן את חרוזים הנכנס נוגדנים בחיץ לשטוף עד מוכן להמשיך עם צעד 2.7. לא צריכים להיות מותר חרוזים להתייבש בכל שלב של הפרוטוקול.
  2. לנתח רקמות זחל בPBT ולהעביר את רקמות גזורים לגם של המנה 9 היטב אחד. בדרך כלל, דיסקציה של האונה אופטית ודיסק דמותי עין מ100 זחלי instar שלישיים מספקת מספיק חומר לניתוח ביטוי גנים במורד הזרם הבא בידוד גרעינים.
  3. יש לשטוף את הרקמות המבודדות במיצוי מאגר גרעיני (10 HEPES מ"מ-KOH, pH 7.5; 2.5 מ"מ MgCl 2; 10 מ"מ KCl) בצינור 1.5 מיליליטר. העבר את רקמות זחל בודדות למיליליטר Dounce Homogenizer 1 (ראה חומרים PDF) על קרח המכיל 1 מיליליטר של מיצוי מאגר גרעיני טרי. לדגור על קרח למשך 5 דקות. אין צורך להוסיף מעכבי פרוטאז אם RNA הוא להיעקר הבא בידוד גרעינים.
  4. לשבש את הרקמה על ידי 20 משיכות עם העלי הרופף ולאחר מכן דגירה מדגם על קרח דק 10 לאפשר לתאים להתנפח. חלץ את הגרעינים מהתאים באמצעות 15 משיכות עם העלי ההדוק. מספר משיכות עם העלי הרופף והדוק צריך להיות מותאם לרקמות שונות וסוגי תאים; המגון עודף יכול לגרוםטעון גרעינים, בעוד המגון מספיק לא לחלץ את כל הגרעינים מהרקמות.
  5. סנן את homogenate, אשר מכיל את הגרעינים ופסולת הסלולר, דרך מסננת נקבובית בגודל 40 מיקרומטר (ראה חומרים PDF) שכבר prerinsed עם חיץ המגון גרעיני. לאסוף את homogenate המסונן בצינור טרי.
  6. לאסוף דגימות טרום בידוד לניתוח שלאחר מכן כדי לקבוע תשואת גרעינים, שלמות גרעינים, וכדי לקבוע את רמות תעתיק של גנים המטרה לפני גרעיני בידוד.
    1. העברה 50 μl של homogenate המסונן לצינור 1.5 מיליליטר טרי באמצעות פיפטה. זה הוא המדגם טרום הבידוד. הוסף 500 μl של מגיב Trizol (ראה PDF חומרים, זהירות), להפוך לערבב, ולאחסן ב -20 ° C לבידוד לאחר RNA (שלב 3.1).
    2. העברה 20 μl של homogenate המסונן לצינור מיליליטר טרי 1.5.
      1. להוסיף DAPI לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, וincמדגם ubate על קרח דק 10.
      2. העבר את הגרעינים צבעוניים DAPI לcoverslip המצופה פולי-ליזין, ומניח בשקופית מיקרוסקופ. לאטום את coverslip באמצעות לק השקוף.
      3. בדוק את שלמות הגרעינים, ונוכחותם של גרעיני GFP-tagged של עניין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: אין צורך לתקן את הגרעינים, או כתם של ה-GFP אם שקופיות אלה מנותחות במהירות סבירה לאחר הכנה (בתוך 24 hr).
    3. העברה 10 μl של homogenate המסונן לצינור מיליליטר טרי 1.5 ולהוסיף 90 μl של חיץ לשטוף (1x PBS, pH 7.4; 2.5 מ"מ MgCl 2). להוסיף DAPI לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. לקבוע את תשואת הגרעינים במדגם טרום הבידוד באמצעות hemocytometer לספור את גרעיני DAPI החיובי באמצעות epifluorescence תחת מטרת מיזוג 10X.
  7. מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים בכריכת הנוגדנים (שהוכנו בסעיף 2.1.6) במעמד מגנטי,ולאפשר את חרוזים המגנטיים להיקשר לאבן שואבת עבור לפחות 2 דקות כפי שתוארו בסעיף 2.1.4. הסר את החיץ לשטוף מהחרוזים הנכנס נוגדנים באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, ולהוסיף את homogenate המסונן משלב 2.5 לצינור 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה 1 מיליליטר.
  8. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים על מנת לערבב, ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם תסיסה קצה על הקצה. למנוע בועות בצינור במידת האפשר שכן אלו יכולים לגרום להתקבצות של הגרעינים.
  9. מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים בכריכת הנוגדנים וhomogenate במעמד מגנטי, ולאפשר את חרוזים המגנטיים להיקשר לאבן שואבת עבור לפחות 2 דקות כפי שתוארו בסעיף 2.1.4. הסר את homogenate המכיל שבריר הגרעינים מאוגד באמצעות פיפטה 1 מיליליטר.
  10. לשטוף את המדגם 3x עם 1 מיליליטר של הצפה לשטוף בכל פעם. הסר את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים, גרעינים ולשטוף חיץ מהמדף ולהפוך לערבב כמה פעמים, ואז למקם את הצינור במעמד המגנטי כמתוארבשלב 2.9 ולהסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מיליליטר.
  11. הוסף 150 μl של חיץ לשטוף את החרוזים, אשר אמור להיות מחויב לגרעיני היעד. זה הוא המדגם שלאחר הבידוד. הכן את הדגימות לבדיקה מיקרוסקופית ומיצוי RNA שלאחר מכן.
    1. העברת 20 μl של מדגם הודעה הבידוד לצינור 1.5 מיליליטר טרי וכתם עם DAPI ולנתח כאמור בסעיף 2.6.2. לספור את ה-GFP / + + DAPI וGFP-/DAPI + גרעינים שנתפסו על ידי חרוזים מגנטיים כדי לקבוע את הטוהר של ה-GFP המועשר + גרעינים במדגם שלאחר הבידוד.
    2. הוסף 1 מיליליטר של מגיב Trizol לשאר מדגם הודעה הבידוד, להפוך לערבב, ולאחסן ב -20 ° C לבידוד לאחר RNA (שלב 3.1). הערה: דוגמאות בTrizol יכולות להיות מאוחסנות במשך כמה שבועות אם יש צורך ב -20 ° C. אין זה הכרחי כדי elute הגרעינים מהחרוזים המגנטיים לפני מיצוי RNA באמצעות מגיב Trizol, becausדואר חרוזים לא להפריע לבידוד RNA שלאחר מכן.

3. לקבוע רמות תמליל בגרעינים מבודדות מרקמות הזחל

  1. בודד RNA מהדגימות טרום בידוד ולאחר בידוד הכנה בסעיפים 2.6.1 ו2.11.2 באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי תאר להפקת RNA מבוססת Trizol (ראה חומרים PDF) בשינויים הבאים:
    1. בעקבות משקעים של גלולה RNA, להוסיף 19.2 μl מים RNase חינם ו0.8 μl של מגיב RNASecure (ראה חומרים PDF) לגלולה ולדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית RNases.
  2. קבע את ריכוז RNA עם פלורסנט לצבוע-RNA מחייב, דוגמת ערכת assay RNA קיוביט (ראה חומרים PDF) באמצעות fluorometer QubitR 2.0 הבאות הפרוטוקול של היצרן.
  3. לסנתז cDNA באמצעות טרנסקריפטאז הפוך הגברה כגון EpiScrIPT הפוך ערכת טרנסקריפטאז ופריימרים oligodT הבאה הוראות היצרן. הערה: בדרך כלל, 50-100 ng של RNA יוצר cDNA מספיק כדי לבצע ביטוי גנים מרובה מנתח. יש להשתמש בכמויות שווה ערך של טרום בידוד ו-RNA הודעה הבידוד לייצר cDNA.
  4. הוספת 180 μl מים nuclease ללא מדגם cDNA 20 μl לדלל את הניתוח הזה פי 10 לפני זמן אמת PCR כמוני (qPCR). דילול זה הוא צעד חשוב, כי דגימות cDNA חי יכולות לעכב את qPCR.
  5. הכן תערובת אב qPCR עם פולימראז וdNTPs, 4 pmoles כל אחד מקדימה לאחור תחל, מורכב עם מים סטריליים לסופית עוצמת התגובה של 20 μl.
    1. לתכנן פריימרים qPCR למקד גנים אשר צפוי לבוא לידי ביטוי בסוג התא של עניין, ובשלב ההתפתחותי שבו הרקמה שנאסף. פריימרים עיצוב תוחלת אינטרון אם אפשר, כך שגנומיניתן להבחין בין מוצרי cDNA-PCR. הערה: אם פרופיל ביטוי גנים מסוג תא היעד אינו ידוע, פריימרים נגד eGFP, שצריך לבוא לידי ביטוי באופן ספציפי באוכלוסיית הגרעינים מתויגת, ניתן להשתמש בם כדי לייעל את הפרוטוקול לסוג תא מסוים ורקמות (טבלה 1).
  6. לקבוע את רמות התמליל היחסית של כל גן של עניין בדגימות טרום בידוד והודעת בידוד בהשוואה לסדרת דילול של cDNA שהוכנה מכל הרקמה. רמות התעתיק של גנים המטרה צריכה להיות מנורמלות לגן התייחסות כגון Rpl32 (או רצוי כמה גנים התייחסות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהג repo-GAL4 (מספר המניות בלומינגטון 7415) בא לידי ביטוי במיוחד בתאי גליה במערכת העצבים דרוזופילה בשלבים שונים של פיתוח 18. זבובים שנוצרו ביציבות להביע כטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH תחת שליטה של נהג repo-GAL4 תוך שימוש בטכניקות גנטיות סטנדרטיות. כדי לאפיין את דפוס הביטוי של EGFP :: transgene KASH בזבובים אלה, הדפוס של ביטוי ה-GFP באונה אופטית גזור ודיסק דמותי עין מזחלי instar שלישיים נבדק באמצעות מיקרוסקופיה confocal. רק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד או מאוד להעשיר במיוחד גרעינים מתויגים מאוכלוסיות תאים מעורבות בעוברי דרוזופילה או רקמות זחל. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד מרקמות גזורים גרעינים בכ 1 שעות. טוהר והתשואה של הגרעינים המבודדים חייבים להיקבע באופן ניסיוני לכל סוג תא. זה יכול להיות קשה לכמת את הגרעינים מאוגדים חרוז בשלב שלאחר הבידוד של הפרוטוקול באמצעות hemocytometer בגלל חרוזים ההווה במדגם. לכן, אם מספרים של גרעינים מדויקים הנדרשים ליישום במורד הזרם, יהיה צורך להעריך תשואת גר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ניס פישר למתן פלסמיד כטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH. נוגדן mAB24B10 הושג ממחקרי Hybridoma הבנק התפתחותית שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה. מניית repo-GAL4 (BL7415) התקבלה ממרכז מלאי בלומינגטון באוניברסיטת אינדיאנה. תמיכה מהאגודה האמריקנית לסרטן המוסדי מענק המחקר (IRG # 58-006-53) למרכז אוניברסיטת פרדו לחקר הסרטן היא הודה בהכרת תודה. Jingqun מא נתמך על ידי מחקר חקלאי בבית הפרד assistantship במזון וחקלאות מאוניברסיטת פרדו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד כאופטין (עכבר, חד שבטי)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומהmAB24B10
נוגדן נגד GFP (עכבר, חד שבטי)Roche11814460001נוגדן ספציפי זה מומלץ לפרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להשתמש גם בנוגדנים חלופיים.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix עם ROXMidSciBEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, מלח דיהידרוכלוריד)Biotium40011
Dounce Homogenizer (1 מ"ל)VWR62400-595
Dumont #5 פינצטה, 11 ס"מWorld Precision Instruments14095
Dynabeads חלבון G למשקעיםחיסונייםInvitrogen10003Dמותג ספציפי זה של חרוזים מגנטיים מומלץ לפרוטוקול זה.
EpiScript Reverse TranscriptaseEpicentreERT12910Khttp://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell sfilters, 40 μ m גודל נקבוביותVWR21008-949ניתן להשתמש בגדלי נקבוביות חלופיים, בהתאם לגודל גרעיני תאי המטרה.
מעמד מגנטי (8 צינורות 1.5 מ"ל)MilliporeLSKMAGS08 
מיני מסובב צינורGenemateH-6700
ערכת התחלה של קיוביטLife TechnologiesQ32871ניתן להשתמש בשיטות דומות מבוססות פלואורסצנטיות לכימות תפוקת RNA. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)Life TechnologiesAM7010השימוש במגיב זה כדי להשבית RNAs הוא אופציונלי.
מכונת RT-PCR Thermal CyclerBioRadCFX Connect Thermal Cycler
סיליקון צלחת זכוכית 9 בארותHampton ResearchHR3-134
מתאם פלואורסצנטי סטריאומיקרוסקופ (כחול רויאל (440-460 ננומטר) עירור + מחסום צהובNightseaמתאם זה מאפשר לבחון פלואורסצנטיות GFP באמצעות מיקרוסקופ מנתח טיפוסי (למשל ניקון)
סט מיקרוסקופ StereoZoom 83604 עם עיניות שדה רחב פי 10 ומעמד בום אוניברסליNikonSMZ 745
Thermal CyclerBioRadT100
TrizolReagent Life Technologies15596018זהירות; ניתן להשתמש בשיטות מיצוי RNA חלופיות. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20Amresco0777-1L

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
  2. Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
  3. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
  4. Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
  5. Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
  6. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
  7. Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
  8. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
  9. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
  11. Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
  12. Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. Genetics. 168, 1385-1393 (2004).
  13. Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
  14. Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
  15. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
  16. Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
  18. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
  19. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gal4 UASEGFP

מאמרים קשורים