שיטה בעלות נמוכה לניתוח כמו פעילות תפיסה ותנועה ב דרוזופילה

סיכום

שימוש במצלמת אינטרנט ושילוב של תוכנות חופשיות וזולות, ניתן לנתח דפוסי קטר בדרוזופילה melanogaster כדי לזהות הבדלים במהירות, מרחק, והזמן של פעילויות מוטוריות שונות.

תקציר

מערכות מעקב וידאו היו בשימוש נרחב לניתוח תנועת melanogaster דרוזופילה ולזהות חריגויות שונות בהתנהגות של קטר. בעוד שמערכות אלה יכולות לספק שפע של מידע התנהגותי, את העלות והמורכבות של מערכות אלו יכולים להיות מונעים למעבדות רבות. פיתחנו assay עלות נמוכה למדידת התנהגות של קטר ותנועת תפיסה בד melanogaster. המערכת עושה שימוש במצלמת אינטרנט כדי ללכוד תמונות שיכולים להיות מעובד באמצעות שילוב של תוכנה זולה וחופשית כדי לעקוב אחר את המרחק שעבר, מהירות תנועה ואת משך הזמן של תנועה הממוצעת במהלך פרק זמן שצוין. כדי להדגים את התועלת של מערכת זו, בדקנו קבוצה של ד melanogaster מוטציות, paralytics מפץ רגיש (BS), שהם 3-10 פעמים רגישים יותר כמו פעילות תפיסה (SLA) מאשר זבובי סוג בר. באמצעות מערכת הרומן הזה, שהיינו מסוגל לזהות שmutan BSחסר טעם לא מפץ (BSS) מציג רמות נמוכות יותר של תנועת גישוש בסביבת רומן מאשר זבובי סוג בר. בנוסף, המערכת משמשת לזיהוי שמטפורמין התרופה, אשר בדרך כלל משמש לטיפול בסוכרת מסוג II, מפחית את עוצמת צד"ל במוטנטים BS.

מבוא

בהתחשב בתוחלת חיים הקצר שלה וכלים הגנטיים חזקים הזמינים, melanogaster דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר האטיולוגיה של מחלות שונות והפיסיולוגיה הבסיסית של תהליכים ביולוגיים שונים. במקרים רבים, זה יתרון כדי למדוד את ההשפעות שיש להם מניפולציות התנהגותיות, גנטיות או תרופתית על תנועה באורגניזמים המודל הבאים ^1,2.

יש מגוון של שיטות המשמשים בדרך כלל למדידת תנועת זבוב בשני ממדים ^3-7. מערכות אלו יכולים לתמוך במעקב של זבובים מרובים בו זמנית ויכולות למדוד מהירות, אורכי נתיב להקליט ולתעד את אחוז זמן זבוב בילה נע. הם כבר השתמשו ללמוד תנועה במגוון רחב של הקשרים כוללים את ההשפעות של תרופות על תנועה והטבע דימורפית המיני של תנועת ^6-9 זבוב. החסרון העיקרי של מערכות אלו הוא עלות sys המעקבTEM או תוכנה והמצלמה המקבילה. במקרים מסוימים, זה יכול לרוץ באלפי דולרים. עלות היא דאגה מיוחדת למעבדה שהיית צריך רק שימוש מוגבל של מערכת כזו, למשל, כימות דפוסי קטר של מוטציה מבודדת חדש.

שיטה פשוטה אך חזקה פחות היא להשתמש במערכות שתנועת השיא מבוססת על כמה פעמים זבוב חוצה נתיב קרן אור אינפרא אדום שממוקם באמצע צינור סגור ^10,11. בעוד שמערכות כאלה יכולות לתת מידע רב ערך על מחזורי תנועה ושינה והערות, שהם מעל או מתחת לאומדן תנועה יכולים כי הם לא מצליחים ללכוד את הנתיב האמיתי של הזבוב. לדוגמא, זבובים שמפגינים תנועה ניכרת בקצוות של הצינור יירשמו תנועה נמוכה זבובים למרות ששיטות ברזולוציה גבוהה נוספות היו בשימוש כדי לנסות ולעקוף את המגבלות האלה ^12.

פשוט יותר וזול יותר עדיין מטפסים מכשירים המודדים geotaxiים, התנועה כלפי מעלה של זבובים, דרך צינור בודד או סדרה של צינורות ^2,13. בעוד מערכות כאלה הן זולות ובקלות יכולות לזהות פגמים geotaxis, הם מצליחים ללכוד היבטים רבים אחרים של תנועה שיהיו עניין לחוקרים.

למעבדות רבות, מערכת ניתוח חזק בעלות נמוכה כי הוא פשוט להתקנה ולתפעול תהיה כלי מועיל לאפיון הבדלים ההתנהגותיים בד melanogaster זנים. כאן אנו מתארים assay שיכול להיות ההגדרה בפחות ממאתיים דולרים, והוא מסוגל לתת מידע על הדרך, המהירות ומשך הזמן של תנועתו של הזבוב. כדי להדגים את היעילות של assay, אנו מציגים נתונים המראים כי ניתן להשתמש בו כדי לזהות; 1) פגם של תנועה במוטצית מפץ רגיש (BS), כי הוא רגיש להתקפים ו2) היכולת של מטפורמין התרופה, אשר משמש בדרך כלל לטיפול בסוכרת מסוג II, כדי להפחית את עוצמת פעילות כמו התקף-i (SLA)n שתי מוטציות BS.

פרוטוקול

1. הכנת פרט זבובים עבור assay נידות

1. העברת זבובים בעדינות על ידי הקשה לתוך צלוחיות ריקות פרט ומכסים את צלוחיות עם תקע כותנה. לאפשר זבובים לשבת דקות 20-30 באין מפריע לפני התצפית. חשוב לא להרדים זבובים בתוך שעות לפני תצפית התנהגותית כמחקרים קודמים מצאו חשיפת הרדמה יכולה לשנות את התנהגות בהשוואה לזבובי unanesthetized ^14.
2. לטפוח בעדינות את הזבוב מתוך הבקבוקון ולמקם את הזבובים בודדים תחת כיסוי צלחת בקוטר 5 סנטימטר פטרי (5 מ"מ גבוה) עם חריצים קטנים כדי לאפשר מעבר אוויר. להאיר מלמטה ולבחון את הזבובים באמצעות מצלמת רשת מותקנת מעל צלחת פטרי.

2. הכנת פרט זבובים עבור assay תפיסה

1. להאכיל את זבובי תפיסה ישנים יומיים רגישים או מדיה שמרים / קמח תירס / אגר סטנדרטית או מדיה סטנדרטית מעורבת ישירות עם תרופה. הנתונים שהוצגו כאן, זבובים הואכלו גם ללכת 1ו תקשורת סטנדרטית או 1 גרם של תקשורת סטנדרטית מעורבבת עם 25 מ"ג של מטפורמין.
2. אחרי הזבובים האכילו במשך יומיים בתקשורת או מדיה בתוספת תרופה, להעביר אותם על ידי הקשה עדינה לתוך צלוחיות ריקות פרט ומכסים את צלוחיות עם תקע כותנה. לאפשר זבובים לשבת באין מפריע במשך 20 דקות לפני התצפית. חשוב לא להרדים זבובים בתוך שעות לפני תצפית התנהגותית כמחקרים קודמים מצאו חשיפת הרדמה יכולה לשנות את התנהגות בהשוואה לזבובי unanesthetized ^14.
3. בקבוקונים בודדים ורטקס המכילים זבוב אחד על vortexer מעבדה שימוש בהגדרה הגבוהה ביותר עבור 10 שניות. הנח את הזבוב משותק על לבן גיליון נייר ריק ישירות מתחת מצלמות מותקנים מעל הנייר.

3. הקלטת וידאו

1. רשום את התנועה או צד"ל באמצעות תוכנת HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm. תכנית זו משתמשת במצלמת האינטרנט כדיללכוד תמונות המבוססות על הגדרות המשתמש.
2. בחר באפשרות הזמן לשגות תמונות תחת הלשונית לכידת, כאשר החלון נפתח, בחר את מצלמת האינטרנט כהתקן הלכידה. עבור רוב ניסויי גודל מסגרת וידאו של 640 480 הוא נאות.
3. בחר אינטל IYUV codec לדחיסה ולבחור 0.1 שניות / מסגרת עבור assay התפיסה או לבחור 0.1-0.5 שניות / מסגרת עבור assay התנועה. בכרטיסייה המתקדמת, בחר ליצור. קובץ תמונת bmp עבור כל לכידה ובחר תיקייה לתכנית כדי לאחסן את התמונות שזה לוקח (ערימת התמונה).
4. הנח זבוב מת על דף נייר. לחץ על תיבת הגדרות וידאו ולהתאים את ההגדרות תחת לשונית הגדרות התקן, כך שיש רקע לבן בוהק וניגוד ברור עם הזבוב הכהה יותר.
5. לחץ על הכפתור התחל כדי להתחיל את ההקלטה. לאחר תקופת ההקלטה סיימה, לחץ על כפתור העצירה. ערימת התמונה צריכה להיות עכשיו בתיקייה שנבחרה. הערה: לפני ההקלטה, להבטיח כי תחשיב היחסיםדר נבחר לערימת התמונה ריק.

4. ניתוח נתונים באמצעות ImageJ

1. ImageJ של NIH הפתוח תמונה בחינם תוכנה לעיבוד, שניתן להוריד בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html. שים לב: בנוסף להורדת התכנית, Multitracker plug-in יש להוריד ולהתקין כפי שצוין בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html.
2. ייבא את ערימת התמונה לתוך ImageJ על ידי לחיצה על הכרטיסייה הקובצת ולאחר מכן בחירת רצף תמונות היבוא →.
   1. בחר את התיקייה המכילה את ערימת התמונה, סמן את אחת מהתמונות ובחר פתוח. תיבת דיאלוג רצף אפשרויות תיפתח. לחץ על שמות מיון מבחינה מספרית ולאחר מכן בחר אישור וערימת התמונה תהיה טעונה לImageJ.
3. סף את כל התמונות, כך שכל מורכב מרקע לבן עם להיות הזבוביומר לנקודה שחורה. כדי להתחיל בתהליך זה, להמיר את התמונה לפורמט 8 ביט על ידי בחירת סוג → 8 סיביות תחת לשונית התמונה.
   1. לחץ על כרטיסיית התמונה שוב ובחר התאם → סף. הפעולה זו תפתח את תיבת דיאלוג הסף שבו הסף מנותק נקודה יכולה להיות מותאמת.
   2. סריקה באמצעות התמונות כדי לראות אם יש נקודות שחורות נוספות או אם פרוסה חסרת נקודה שחורה. אם זה המקרה, להתאים את הסף כדי להקל על הבעיה. בדרך כלל הסף לא צריך להיות מותאם כברירת מחדל התכנית לערך נאות.
      שים לב: בכל שקופית בערימה צריכה להיות רק אחד נקודה שחורה המייצגת את עמדתו של הזבוב.
   3. בחר להחיל בתיבת דיאלוג הסף והמר למסכת תיבת דיאלוג יפתח. אל תלחץ על כל אחת מהאפשרויות, אלא פשוט לחץ על אישור לסף ערימת התמונה.
4. לאחר thresholding ערימת התמונה, בחר Multitracker לחבר-תחת לשונית תוספים כדילמדוד את התנועה של הזבוב בפיקסלים. תיבת דיאלוג Tracker האובייקט תופיע.
   1. לחץ על כל אחת מארבע האפשרויות שניתנו בתיבת הדיאלוג ולאחר מכן בחר אישור. לאחר מכן התוספת Multitracker יצרף קואורדינטות לנקודה השחורה בכל פרוסה וצייני אותם בחלון התוצאות, כמו גם את אורך הדרך הכולל בפיקסלים. חלון הנתיבים נותן תצוגה גרפית של נתיב הזבוב לקח.
   2. להעתיק את רשימת ה-X וה-Y לתאם מחלון התוצאות ולהדביק את הנתונים לגיליון אלקטרוני Excel. אם שקופיות כל בערימה אין נקודה שחורה בזה, תכנית Multitracker תבלום שבשקופית. במקרה כזה, יש צורך לחזור לשלב 4.2 מחדש סף הערימה כדי לוודא שאוגרים לטוס כנקודה שחורה בשקופית בשאלה.
5. על מנת להמיר את נתיב אורכים מפיקסלים לסנטימטר, לקחת תמונה נפרדת של שתי נקודות שהם מרווחים מאחד סנטימטר על פיסה לבנה נייר ריקה.
   1. עקוב מעלצעדים (3.1-4.4.2), כדי לקבוע את x, y פיקסל קואורדינטות עבור שתי הנקודות ולהשתמש במידע זה כדי לקבוע את מספר הפיקסלים המקביל לסנטימטר. מקדם המרה זה משמש בשלב חמישה כדי להפיק נתונים תנועה בס"מ. הערה: ברגע שזה נעשה, זה חשוב כדי לשמור על המצלמה קבועה עבור כל ההקלטות העתידיות. בכל פעם שהמצלמה עברה או מותאמת, צריכה לחזור על שלב זה להמיר את הפיקסלים לסנטימטר.
   2. אורך הנתיב שנוצר על ידי התוספת Multitracker מגזים בהערכת תנועה בגלל תנודות קלות בתנוחת גוף ועוצמה / השתקפות אור תשפיע על הגודל והמרכז של הנקודה השחורה שנוצרת כאשר thresholding התמונות. רעש זה יש להסיר על מנת לקבל הערכה מדויקת של תנועת זבוב.

5. ניתוח נתונים באמצעות Excel

1. הסר את הרעש מהנתונים שנרשמו על ידי יבוא הסדרה של x, y קואורדינטות שנוצר על ידי יחסי ציבור Multitrackerogram לטוסו ניתוח, תכנית של Visual Basic Excel שנוצרה על ידי המחברים. (התכנית זמינה על ידי יצירת קשר עם החברים.)
2. לחץ על לחצן לחץ אותי ובחר ניתוק ערך סף. בחר ערך סף של 0.5 סנטימטר / שנייה לניתוח צד"ל או לבחור ערך בין .1-.3 סנטימטר / שנייה לניתוח תנועה. לחץ על אישור והתכנית לחשב את המהירות, הזמן ומרחק של תנועה. הערה: התכנית משתמשת בחלון הזזה ניתוח כדי להעריך את הנתונים בפחי שניות רציפים 0.5-1.0 ומחשבת את המהירות בחלון זה. כל דבר מעל הפסקת מוגדרת על ידי המשתמש הוא כאל תנועת זבוב.

תוצאות

הטכניקה המתוארת כאן כבר השתמשה בעבר כדי לנתח הבדלים בצד"ל במוטנטים BS דרוזופילה ^1. התוצאות שהוצגו כאן לערב את זני BS בהלם בקלות (EAS), מפץ חסר טעם (BSS), ונוקאאוט טכני (TKO). מוקד EAS מקודד קינאז ethanolamine המעורב בסינתזת ethanolamine phosphatidyl ¹⁵ ולוקוס TKO מקודד riboprotein המיטוכונדריה ^16. המוטציה BSS היא אלל של ערוץ השיתוק (para) המתח מגודרת נתרן ^17. אללים השתמשו במחקר זה היו...

דיון

כאשר בוחנים של תנועה או דפוסי תנועה בדרוזופילה, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לחלץ מידע לגבי המרחק שעבר, מהירות תנועה והדפוס של תנועה. על מנת לחלץ את המידע הזה, ציוד יקר באופן מסורתי מועסק שהוא לעתים קרובות מונע למעבדות קטנות יותר או מעבדות שרוצים להשתמש במבחנים כאלה במשורה ^4,8,9.

Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי לקבוע את המרחק שעבר (איורים 2 ו 6), מהירות התנועה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצלמת אינטרנט	Logitech	Pro900	כל מצלמת רשת איכותית תספיק.
תוכנת Time-lapse HandiAVI	תוכנת Azcendant ניתן		למצוא את הגרסה העדכנית ביותר בכתובת http://www.azcendant.com/
ImageJ	NIH		הגרסה העדכנית ביותר ניתן למצוא ב http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-In	NIH		הגרסה העדכנית ביותר ניתן למצוא ב http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
Vortexer	VWR	Vortex Genie 2	רוב המערבולות בגודל סטנדרטי כמו ה-Vortex Genie 2 יספיקו.
כיסוי צלחת פטרי 5 ס"מ	LabM Limited	D011	ניתן להשתמש בכיסויי צלחת פטרי קטנים או גדולים יותר לבדיקת זירה בתנועה.
קופסת אור	בהתאמה		בנויה מחומר גרוטאות. תאורה משמשת לבדיקת התנועה. בהתאם לתאורת החדר, ניתן לבצע את הבדיקה ללא תיבת האור.