אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן אנו פירוט עיצוב, ייצור, ושימוש במכשיר microfluidic להעריך deformability של מספר רב של תאים בודדים באופן יעיל. בדרך כלל, נתונים ל~ 10 2 תאים ניתן לרכוש בתוך ניסוי שעה 1. תכנית ניתוח תמונה אוטומטית מאפשרת ניתוח שלאחר ניסוי יעיל של נתוני תמונה, המאפשר עיבוד להיות שלם בתוך כמה שעות. הגיאומטריה המכשיר שלנו היא ייחודית בכך שתאים חייבים לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה, ובכך לאפשר את העיוות הראשונית והרפיה של תאים בודדים תלוי זמן להיות assayed. תחולתה של שיטה זו לוקמיה פרומיילוציטית (HL-60) התאים באה לידי ביטוי. נהיגה תאים לעוות דרך אילוצי מיקרון בקנה מידה באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ, אנו צופים כי פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים לרגע לחסום את ההתכווצות הראשונה לזמן החציוני של 9.3 אלפיות שניים לפני passaging במהירות רב יותר דרך להצר הבאיונים עם זמן מעבר החציוני של 4.0 אלפיות שניים להתכווצות. בניגוד לכך, (נויטרופילים סוג) שטופל בחומצה רטינואית כל טרנס HL-60 תאים לחסום את ההתכווצות הראשונה רק 4.3 אלפית שניים לפני passaging דרך האילוצים שלאחר מכן עם זמן מעבר החציוני של 3.3 אלפיות שניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טבע viscoelastic של תאים, וסופו של דבר לחשוף את המקורות המולקולריים של התנהגות זו.
מבוא
שינויים בצורת תא הם קריטיים בהקשרים ביולוגיים רבים. לדוגמא, אריתרוציטים ולויקוציטים לעוות דרך נימים שהם קטנים יותר מאשר הקוטר שלהם 1. בגרורות, תאים סרטניים חייבים לעוות דרך פערים צרים ביניים, כמו גם כלי דם מפותלים ורשתות הלימפה זרע באתרים משניים 2. כדי לחקור את ההתנהגות הפיסית של תאים בודדים, מכשירי microfluidic להציג פלטפורמה אידיאלית שיכול להיות מותאם אישית כדי ללמוד מגוון רחב של התנהגויות תאים הכוללים את היכולת שלהם להעביר דרך צרים פערים 3 ולעוות באופן פסיבי באמצעות אילוצי מיקרון בקנה מידה 3 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירי microfluidic הם שקופים אופטי, המאפשרים לעיוותי תא להי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1 עיצוב מכשיר microfluidic
הערה: יש עיצוב המכשיר ארבעה אזורים בסיסיים פונקציונליים: נמל כניסה, מסנן תא, מערך התכווצות, ונמל יציאה (איור 1). העיצוב הכללי ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים, עם התאמות קלות לממדים. סיפקו הנה כמה המלצות עיצוב בסיסיות יחד עם פרמטרים נוספים במכשיר, כי הם יעילים לבחירה של שני תאים הראשוניים והנציחו.
- בחר את רוחב ערוצי מערך התכווצות (איור 1) להיות כ 30-50% מקוטר התא הממוצע; תוצאות זה התכווצות אל תא גודל יחס לעיוו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לחקור את deformability סוגי תאים שונים, תאים אנושיים מיאלואידית לוקמיה (HL-60), תאי נויטרופילים מובחנים, תאי הלימפוציטים עכבר, ושורות תאי סרטן השחלות אנושיות (OVCAR8, HEYA8) שלהם הוערכו באמצעות טכניקת microfluidic 'תא deformer'. תוצאות עבור נציג את זמן המעבר של HL-60 תאי HL-60 ונויטרופילים הסוג להראות הזמנים לתא בודד למעבר דרך סדרה של התכווצויות, כפי שמוצגים באיור 6. זמן מעבר נמדד לאוכלוסייה של תאים בודדים ב כל התכווצות 7 מיקרומטר בסדרה של 7 אילוצים בל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מספקים הליך ניסיוני מקיף לניתוח העיוות של תאים העוברים דרך ערוצי microfluidic מכווצים באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ. תסריט MATLAB מאפשר עיבוד נתונים אוטומטי (משלימה חומר); גרסה מעודכנת של הקוד נשמר (www.ibp.ucla.edu/research/rowat). באופן רחב יותר, ניתן להתאים את הטכניקות שהוצגו כאן במבחני microfluidic מבוססי תאים רבים, כוללים השפעת cytoskeletal וסוכני התקשות גרעיני 24,23 כמו גם מנסה לאמוד defo.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אי לנו ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות לויד Ung עבור קלט קונסטרוקטיבי בגרסאות המוקדמות של טכניקה זו, ד"ר ג'רמי Agresti לטיפים לעיצוב כובע לחץ, וד"ר Dongping צ'י על עזרתו בבודת כובע הלחץ. אנו מודים למעבדות של מ 'Teitell ופ Gunaratne למתן מגוון רחב של דגימות תאים לבדיקה. אנו מודים לקרן הלאומית למדע (קריירת פרס DBI-1,254,185), המרכז לסרטן באוניברסיטת UCLA Jonsson, וUCLA הקליני וTranslational Science Institute לתמיכה בעבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פלורוניק F-127 בלוק קופולימר פעילי שטח | פישר סיינטיפיק | 8409400 | מיוצר על ידי BASF, זמין גם באמצעות בסיס Sigma |
| PDMS ו-crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | מוצר בשם נפוץ Sylgard 184 Elastomer |
| חמצן יחידת פריקת פלזמה | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 מ"מ)Ted | Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32 אינץ' | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK), קוטר חיצוני = 1/32 אינץ' או 0.79 מ"מ | Valco | TPK.515-25M | |
| צינורות פוליאתילן (PE-20), 0.043 אינץ' או 1.09 מ"מ | Becton Dickinson | 427406 | |
| ווסת לחץ | צינורות Airgas או Praxair | ||
| פוליאוריתן, 15/32 אינץ' OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| אביזרי דחיפה לחיבור | McMaster Carr | 5111K91 | |
| ממיר מתח ללחץ (E/P) ממיר אלקטרו-פנאומטי | אומגה | IP413-020 | |
| 16 סיביות, 250 kS/S, 80 כניסות אנלוגיות רב תכליתי DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| מחבר אנלוגי מסוף בלוק-בורג | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView תוכנת עיצוב מערכת | מכשירים לאומיים תוכנת | ||
| MATLAB | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | דורש את ארגז הכלים לעיבוד תמונה |
| כבל מוגן | National Instruments | SHC68-68 |
מקורות
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
