פרופיל מולקולרי של תאי לייזר microdissected וstroma ממודלים סינטטיים, רקמות מהונדסות סרטן מעי גס מייצג רומן גישה למניפולציה כדי לאפיין ולנתח את הביולוגיה הייחודית בממשק שבין תאים סרטניים בחזית פולשנית ותאי סטרומה סרטן קשור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו
במאמר זה
סיכום
תקציר
פלישה לסרטן מעי גס תאים (CRC) רכשו את היכולת להשתחרר מתאי אחותם, לחדור stroma, ולשפץ את מטריצת החוץ תאית (ECM). אפיון הביולוגיה של קבוצת phenotypically מובחנת זו של תאים יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של אירועים המוקדמים שלנו במפל גרורתי.
פלישת גידול היא תהליך דינמי בהנחייתם של אינטראקציות דו כיוונית בין האפיתל הממאיר וstroma הסרטן קשור. על מנת לבחון את תגובות תא ספציפי בstroma ממשק גידול יש לנו שילוב organotypic תרבות משותפת וטכניקות מיקרו לנתיחה בלייזר.
מודלים Organotypic, שבו בוחרי סטרומה מפתח כגון fibroblasts הם 3-dimentioanally שיתוף תרבותי עם תאי האפיתל בסרטן, הם כלים ניסיוניים למניפולציה מאוד אשר יאפשר פלישה ואינטראקציות הסרטן stroma להיחקר בכמעט phתנאי ysiological.
microdissection הלייזר (LMD) הוא טכניקה שכרוכה נתיחה כירורגית וחילוץ של השכבות השונות בתוך רקמת גידול, עם דיוק ברמת מיקרון.
על ידי שילוב של טכניקות אלה עם פרופיל גנומי, transcriptomic ואפיגנטיים אנו שואפים לפתח הבנה עמוקה יותר של המאפיינים המולקולריים של פולשים לתאי גידול ורקמה מסביבו סטרומה, ותוך כדי כך שעלול לחשוף סמנים ביולוגיים והזדמנויות לפיתוח תרופה בCRC רומן.
מבוא
שיתוף תרבויות Organotypic דגמי רקמות מהונדסות אשר מסייע בשחזור in vivo microenvironment הגידול ב3 ממדים על ידי הפוצעים תאי האפיתל ממאירים ותאי סטרומה בג'ל קולגן המכיל רכיבי מטריצה תאית חיוניים 1-3. בעיקר נתפס כשיטת מדידת פלישת גידול, organotypics להפחית את התלות בin vivo מודלים של בעלי חיים, ולמנוע את החסרונות של טכניקות במבחנה אחרות כגון מבחני Transwell, שבו תאים פולשים נאלצים באופן מלאכותי למצב פיזור מונו 2-4. הכללתם של תאי סטרומה במודלים אלה, כגון fibroblasts, משקף את התפקיד החיוני של microenvironment הגידול בויסות פלישה גרורה 3-4 ממאירים, לעומת זאת ההטרוגניות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הקמת תרבויות עיקרי פיברובלסטים מExplants הגס
- להשיג דגימות של רקמת רירית מעי גס אנושי נורמלית ישירות מחדר הניתוח כירורגי, ולהשעות ב7-10 מיליליטר של PBS בתוספת 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו0.25 מיקרוגרם / Fungizone מיליליטר.
- במעבדה, הנח את הדגימה במרכז צלחת תרבית רקמת 10 ס"מ ולשטוף 3 פעמים עם PBS / עט סטרפטוקוקוס / Fungizone. אל לשאוב לאחר לשטוף הסופי.
- עם מלקחיים ואזמל סטרילי, לחתוך את הרקמה לחתיכות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יש לנו ליישם את השיטה הנ"ל לשילובים רבים של שורות תאי CRC ותאי סטרומה. דוגמא אחת שהוצגה כאן היא שורות תאי אפיתל SW480 CRC עם האקס fibroblasts אדם העיקרי vivo במעי הגס. שיתוף תרבויות 3 ממדים בנויים (איור 1), נתון למיקרוסקופיה וmicrodissection ללכוד לייזר (איור 2), ונותחו על ידי microRNA פרופיל (מירנה) (איור 3) להשוואה של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי בין תאים בחזית הגידול פולשני ואלה שבאזורי הגידול (שאינו פולש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מתארים שיטה לבודד באופן ספציפי ולאפיין תאים סרטניים אשר רכשו את היכולת לפלוש stroma הקשורים לסרטן בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות גרורתי במבנה תרבות משותפת 3 ממדים של תאי אפיתל וסטרומה.
מודלים שיתוף התרבות מורכבים מתאי אפיתל CRC זה לצד זה עם stroma סינטטי המכיל vivo לשעבר fibroblasts מעי הגס האנושי שימשו ללמוד פלישת CRC ב 3 ממדים. מערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית זה שמחק בתנאי vivo יכול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לחשוף שום פוטנציאל לניגודי עניינים.
תודות
MB נתמך על ידי מימון מענק ממלגת MRC. KP וAHM נתמכים על ידי מימון מענק ממחקר רפואי וסקס וחקר הסרטן בבריטניה / RCS (אנגליה) (C28503/A10013). אנו אסירי תודה על התמיכה של אוניברסיטת סאות'המפטון היסטוכימיה יחידת מחקר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קווי תאים של סרטן המעי הגס - דוגמה מוצגת SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| קולגן | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| קרום ניילון | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| רשת מתכת | The Mesh Company | WSS20-A4 | |
| לייזר themeshcompany.com פלטפורמת מיקרו-דיסקציה | Leica Microsystems Leica | AS LMD | |
| רכוב ממברנה שקופיות | מולקולריים | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
מקורות
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
