השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

סיכום

מאמר וידאו זה מתאר שיטה שונה במבחנה לבחינת תפקידם של הורמונים, ציטוקינים ו/או גורמי גדילה בהנעת פלישת תאים סרטניים.

תקציר

סרום דם משמש כchemoattractant כיוון שתאי הסרטן להגר ולפלוש, להקל intravasation לmicrovessels. עם זאת, המולקולות בפועל כיוון שבו התאים לנדוד להישאר חמקמקות. assay פלישה שונה זו פותח כדי לזהות מטרות שנוהגות נדידת תאים ופלישה. טכניקה זו משווה את מדד הפלישה תחת שלושה תנאים כדי לקבוע אם הורמון מסוים, גורם גדילה, או ציטוקינים משחק תפקיד בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. תנאים אלה כוללים אני) בסרום שור עוברי נורמלי (FBS), ii)-הפשיט פחם FBS (CS-FBS), אשר מסיר הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים וiii) מולקולת CS-FBS + (מסומן "X"). שינוי משמעותי בפלישת תא עם CS-FBS בהשוואה לFBS, מצביע על מעורבותם של הורמונים, ציטוקינים או גורמי גדילה בתיווך השינוי. אז יכולות להיות הוסיפו בחזרה מולקולות בודדות לCS-FBS לassay יכולתם מחדשפסוק או להציל את הפנוטיפ הפלישה. יתר על כן, ניתן לשלב שתיים או יותר גורמים כדי להעריך את התוסף או תופעות סינרגיסטי של מולקולות רבות בנהיגה או עיכוב פלישה. בסך הכל, בשיטה זו מאפשרת לחוקר כדי לקבוע אם הורמונים, ציטוקינים, ואו גורמי גדילה / לשחק תפקיד בפלישת תא על ידי המשרת כchemoattractants או מעכבים של פלישה לסוג מסוים של תאי סרטן או מוטציה ספציפית. על ידי זיהוי chemoattractants ומעכבים ספציפיים, assay הפלישה שונה זה עשוי לעזור להבהיר מסלולי איתות המכוונים את פלישת תאי הסרטן.

מבוא

Assay פלישת רומן פותח במטרה לזהות את מעורבותם של הורמונים מסוימים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה כchemoattractants בפלישת תאי סרטן. היכולת של תאים סרטניים לפלוש דרך המטריצה ​​תאית (ECM) היא סימן היכר של פנוטיפ גרורתי ^1-3. תאי פלישה נעשו שימוש נרחב כמו במבחנה כלים ללמוד פלישת תאי סרטן והגירה ועשויים לספק ידע באשר למנגנוני in vivo פלישת גידול וגרור. התאים מורכבים מהתרבות מוסיף תא גלילי קיננו בתוך הבארות של צלחות תרבית תאים. התחתיות מוסיף הן קרומי פוליקרבונט או קלקר חדיר למחצה של גודל נקבובית מוגדר.

בassay הפלישה הסטנדרטי, תאים הם זורעים על הממברנה להכניס את עם תקשורת חופשית בסרום והניחו לתוך בארות תרבית תאים שמלאות בchemoattractants סרום או כמו סרום-ליםet עד כוח chemoattractive. תאי כונני הכוח הזה כדי לנוע בקרום חדיר למחצה (ההגירה) או לחלופין, באמצעות ציפוי של מטריצה ​​תאית (פלישה), אז מה שיכול להיות מוכתמת באמצעות צבעים קונבנציונליים כדי לזהות ולכמת את מספר התאים. מספר התא אז מנורמל לפי העומק של הגירה ופלישה בשורת תאים לא פולשנית. שיטה זו מאפשרת לחוקר להעריך את הפוטנציאל פולשני של סוגי תאים שונים תחת מגוון רחב של תנאים, כוללים מניפולציות גנטיות.

הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה הם רכיבים קריטיים של סרום ויותר ויותר במוצגים להיות קשורים לנהיגת פנוטיפ פולשני ^4. עם זאת, הטבע, התפקיד, וספציפיות של מולקולות סרום chemoattractive אלה בתיווך פלישה עדיין להישאר חמקמקים. האתגר נשאר כדי לקבוע מה ספציפי גורמים בchemoattractants סרום או כמו סרום-הם אחראים לנהיגהפלישת סרטן תאים, כמו גם את מה שמולקולות עלולות לעכב את תהליך הפלישה. בדוח זה, אנו מתארים שיטה להעריך את המעורבות האפשרית של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי צמיחה הנוכחיים בסרום, כמו מולקולות הנהיגה chemoattraction והפלישה של תאים סרטניים.

בהציע פרוטוקול שונה זו, הפשטת פחם משמשת כדי להסיר הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה מסרום 2% שור עוברי (FBS) כדי ליצור FBS פחם 2% הפשיט (CS-FBS). שני 2% FBS ו -2% CS-FBS משמשים כסוכנים להקים כוח chemoattractive לנהוג פלישת תאי סרטן. באמצעות 2% CS-FBS כסוכן chemoattractive בהשוואה ל -2% FBS הרגיל מעניק מספר יתרונות הכוללים ראשון, ובולט ביותר, היכולת ללמוד את הפנוטיפ פלישת הסרטן בהעדר המופחת / היחסי של הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה. הוא גם מאפשר לחוקר להעריך אם ההסרה הקולקטיבית של הורמונים, גורמי גדילה, וCYtokines גורם לעלייה או ירידה במדד פולשנית. Assay לאחר מכן נועד לקבוע אם התוספת של רכיב בודד, המיועד כ" X "יכולה לעכב, ירידה, עלייה, או לשחזר את המדד פולשנית לערכו המקורי (ראה איורים 2 ו -3). למרות שמתודולוגיה זו היא ספציפית להשגת הרמות הפיזיולוגיות של הרכיב שהוסר מהסרום במהלך הפשטת פחם, זה צריך להיות גם ציין כי הפשטת פחם יכולה להשפיע גם על מסלולי העברת אותות. לדוגמא, זה כבר דווח כי הפשטת פחם יכולה להפחית את פעילות phosphatase אלקליין של תאי osteoprogenitor ולגרום adipogenesis באמצעות הפחתה של מפעילי MAPK ^5. תקשורת הפשיטה פחם היא זמינה באופן מסחרי, ומבוססות על הפרוטוקול שתוארה המשלב פחם עם dextran וטופחו עם O בסרום שור עוברי / N ^6.

assay זו פותח בrespoNSE לתוצאה שדווחה על ידי צוקר et al. ⁷ המחברים הוכיחו כי פנוטיפ מוטנטי משפיע תקשורת צומת הפער הפגין עליית מדד הפלישה בעת העברה לתקשורת עם FBS 2% נורמלים. עלייה זו בוטלה עם ההחלפה של סרום-הפשיט פחם. מתוצאה זו, החוקרים הסיקו כי הגירה מושפעת זה מוטציה למולקולת lipophilic (לייתר דיוק, הורמון, גורם גדילה, או ציטוקינים) ^7. זה ידוע היטב כי הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לתווך מסלולי איתות מעורבים בקידום גידול ופלישה ^4. לפיכך, חשוב לחוקרים מדעיים כדי לקבוע מה גורם (ים) נוהג פלישת הגידול של תאי הסרטן המסוים שלהם או מוטציות תחת מחקר. Assay נועד לעסוק בתפקיד של רכיבים בודדים בריכוז הפיזיולוגי שלהם, כפי שנקבע על פי ההפרש בין הריכוז של הרכיב ו# 8220; X "בFBS הנורמלי וCS-FBS. באמצעות הפיתוח של assay זה, חוקרים יכולים להשיג תובנה רבה יותר על המסלול פולשנית הספציפי המסדירים את המערכת שלהם.

הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לעתים קרובות סווגו כמקדמי גידול ^8. חלק מגורמים אלה כמו EGF משמש כמקורות ישירים לchemoattractants בתאי פלישה ^9. לפיכך, סביר להניח כי אלה מייצגים את המרכיבים העיקריים של הסרום שפלישת גידול ישיר. פרוטוקול זה מציע פשוט, אך משמעותי, שינוי במבחנת assay הפלישה הקונבנציונלי המאפשר חוקר להעריך את מעורבותם של הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. עם זאת, assay נועד לספק החוקר עם תשובה באשר לשאלה האם ההליך יהיה יעיל למחקר שלהם בכל צעד בתחילת הניתוח, כדי שלא לנצל את הזמן וr יקריםesources אם כמיותר. שיטה זו משתמשת CS-FBS והוא מסתמך על שיקול דעתו החוקרים שכמולקולות להמשיך כמועמדים מובילים שפוטנציאל לתווך פלישת תאי הסרטן. התוצאות מניתוחים אלו צריכים להוכיח להיות שימושיים בזיהוי רכיבי שסרום לשמש chemoattractants או מעכבים עבור קו תא המסוים או מוטציה הנלמד. בנוסף, גישה זו עשויה לעזור לחוקר לזהות מסלולי איתות מפתח או קידום או עיכוב פלישת תאים סרטניים; כך מכוון את עיצוב סמים עתיד.

פרוטוקול

1. מכין את אמצעי התקשורת שונה ורכיבים נוספים

1. לפני הניסוי, להכין תקשורת בהיקף של DMEM או מדיה אחרת שצוינה בתוספת או FBS הנורמלי, הפחם הפשיט FBS, או FBS פחם הופשט בתוספת הרכיב להיבדק. שימו לב שניתן לבדוק רכיבים מרובים בכל ניסוי.
2. לשקול את ולדלל את ההורמונים, גורמי גדילה, או ציטוקינים כראוי להיות מומסים בסרום הפחם הופשט בריכוז הפיזיולוגי.

2. מכין את מטריקס קולגן על קרח

1. להכין 2 מיליליטר קולגן אני מטריקס ב -2.2 מ"ג / מיליליטר על ידי הוספת הרכיבים המסוננים סטרילי הבאים על קרח: 200 10x μl PBS (pH 7.4), 5.4 μl 1 N NaOH, 600 μl של H ₂ O מזוקק פעמיים, ואני 1.2 מיליליטר קולגן (ב3.63 מ"ג / מיליליטר).
2. שמור לי פתרון קולגן על קרח עד מוכן לצלחת.

3. להכין צלחות הגירה / פלישה לAssay

1. עבור כל קו תא להיבדק, להשתמש צלחת תא 24 גם אחד שבו 12 בארות להכיל מוסיף. השתמש 12 בארות נוספות שאינו מכילות מוסיף להוספת תקשורת chemoattractant והעברת ההכנסות לקבוצת הניסיון.
   הערה: מטריצת קולגן על צלחות עם קרום teraphthalate פוליאתילן (PET) וגודל נקבובית 8 מיקרומטר היא אופטימלית לשורות התאים להשתמש כאן. עם זאת, מטריצת matrigel בצלחות Precoated יכולה גם להחליף עם הגודל הנקבובית ירד בהתאם לשורת התאים נחקרת.
2. ברור לתייג את הצלחת, באמצעות 3 בארות לכל מצב להיות מנותחות (הגירת FBS, הגירת CS-FBS, פלישת FBS, ופלישת CS-FBS כמו גם FBS הגירה לשליטה, שורת תאים לא פולשנית). הגירת assay על ידי תנועה דרך נקבוביות בקרום PET, ופלישת assay על ידי תנועה באמצעות מטריצת קולגן או matrigel ולאחר מכן דרך נקבוביות בקרום. השתמש בסמני צבע שונים לכל מצב תא לid בתהליך הציפוי.

4. לוותר מטריקס הפלישה

1. בזהירות פיפטה 75 μl של פתרון מטריצת קולגן למוסיף לשמש למבחני פלישה. השתמש בזהירות כדי למנוע בועות. לפזר בועות על ידי יישום קצה פיפטה הפוך אל פני השטח.
2. העבר את הצלחת עם מוסיף מצופה קולגן ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור למשך 30 דקות כדי לאפשר ג'ל כדי לחזק.

5. פלייט התאים על גבי ממברנה או הפלישה מטריקס

1. בינתיים, trypsinize תאים ולהוסיף מדיה עם 10% FBS. תאי ספין ב XG 200 במשך 5 דקות על צנטריפוגה בראש הטבלה ולשטוף 3x בתקשורת חופשית בסרום.
2. גלול בתקשורת חופשית בסרום. ספירת תאים עם hemocytometer או נגד שקופיות אוטומטיות. הוסף מדיה סרום ללא לריכוז סופי של 5 x 10 ⁴ תאים / מיליליטר.
3. כאשר מטריצת קולגן יש הקרושה (לאחר 30 דקות), להוסיף 700 μl של תקשורת עם או2% FBS מוגדר או פחם-הפשיט FBS היטב כל אחד. של 12 מוסיף לכל צלחת:
   • יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS
   • יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS
   • יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS
   • יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS
   1. להשתמש בצלחות נוספות בהתאם למספר גורמים הנבדקים ועם שליטה לא קולגן המתאים לכל מצב.
4. הוסף השעיה תא למוסיף בשעה 5 x 10 ⁴ תאים / מיליליטר, ציפוי 500 תאי μl לכל כנס בכל מוסיף ההגירה ופלישה.
5. דגירה התאים במשך 22 שעות על 37 מעלות צלזיוס.

6. לכמת את מספר הנודד ותאים פולשים

1. צביעת הגדר של בארות באמצעות מקבע מתנול, eosin, וhemotoxylin, בבארות נפרדות.
2. השתמש בצמר גפן כדי להסיר תאים ומטריצה ​​מכל טוב.Rrepeat עם יישום ספוגית שני לכל אחד.
3. עם מלקחיים, לטבול להכניס כל אחד 5 פעמים 1 שניות לכל אחד מהפתרונים 3 ברציפות.
4. לאפשר מוסיף לייבוש O / N.
5. כך או i) להסיר את המסננים עם אזמל, החיתוך בזהירות מסביב לקצוות ולעלות בשקופית עם שמן coverslip וטבילה, או ii) תאפשר מוסיף לייבוש O / N ההפוך ולהשתמש במוסיף ישירות למיקרוסקופיה.
6. למחרת, להציג שקופיות או מוסיף תחת מיקרוסקופ עם מטרת 20X ולקחת 5 תמונות מאזורים שונים של המסנן. כדי לשפר את העקביות, לקחת 4 שדות חיצוניים ומרכז אחד.
7. ספירת תאים לכל תנאי שימוש בתוכנת ImageJ ואחול על נוסחות להלן.
8. לקבוע את פלישת אחוזים כדלקמן:
   אומר # תאים הפולשים באמצעות קולגן אני מכניס =
   אומר # של תאים הנודדים דרך להכניס שליטה = b
   פלישת% = (a / b) * 100
9. לקבוע מדד הפלישה ב 2% FBS כדלקמן:
   פלישת% מתאים שassayed (ב 2% FBS) = ג
   % פלישה של תאים לא פולשנית שליטה ב( 2% FBS) = d
   הפלישה Index (FBS) = (ג / ד)
10. לקבוע מדד הפלישה ב 2% CS-FBS כדלקמן:
    פלישת% מתאים שassayed (ב 2% CS-FBS) = e
    פלישת% מתאים לא פולשנית שליטה ב( 2% CS-FBS) = f
    הפלישה Index (CS-FBS) = (ה / ו)

7. חזור על הפרוטוקול ניסויי השוואה-הפשיט פחם FBS לFBS הפשיט פחם + X _n עם גורמים מרובים משולבים

1. חזור על התהליך מספר פעמים לפי הצורך תוך שימוש ברכיבים שונים עבור "X" או שילוב של רכיבים.
2. החל החישובים כדי לקבוע את תרומתו של כל "X" גורם לתופעות הגירה ופלישה.

תוצאות

מדד הפלישה מחושב עבור כל תנאי לפי נורמליזציה לשורת תאים לא פולשנית. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו 1205Lu תא מלנומה ושורות תאי יציבות גרסה הוקמה כקווים פולשנית שלנו, כמו גם את הגרסה טרום לא פולשנית, WM793 ממנו התאים 1205Lu נגזרו ¹⁰ המשמשים כבקרה לוגית. גם אנו מנצלים אני קולגן כמטריצת הפלישה משום שהוא המרכיב העיקרי של הדרמיס. זה בהתאם למחקר קודם לפי מטריצת הפלישה האופטימלית משתנית בהתאם לקו התא ועם in vivo מידת ההתאמה תוצאות ^11. assay פלישה זו מתואר ב...

דיון

גרורות סרטנית היא תהליך רב שלבי. התאים חייבים לפרוץ את הקרום במרתף, intravasate לmicrovessels או מערכת הלימפה או הדם, שבו הם מועברים לאתרים מרוחקים. תאי הגידול אז extravasate וליישב לmacrometastasis ^12. התקדמות דרך אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), פלישת גידול, וגרורות שופרה על ידי הורמוני סטרואידי ^13,14, צמיחת גורמי ^15-18, וציטוקינים ^19-21. מולקולות אלה הן כל כך קריטיות לטיפול במסלול האיתות של התקדמות גידול, כי הפיתוח של assay כדי לטפל בתפק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוספות בקרת BioCoat עם 8.0 ומיקרו; m קרום PET	קורנינג	354578	12 בכל אחת משתי צלחות 24 בארות. PET = פוליאתילן טרפתלט
קולגן I, זנב חולדה	קורנינג	354236	מקור = גיד זנב חולדה, טוהר = 90%
מקבע; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	קיבוע מבוסס מתנול, המטוקסילין/אאוזין
סרום בקר עוברי	Life Technologies	16000	מוגדר
כסרום בקר עוברי מופשט	FBS Life Technologies	12676	מוגדר
כסרום בקר עוברי	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	מוגדר כ-FBS
סרום בקר עוברי מופשט פחם	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	מוגדר כ-CS-FBS

פחם CS-FBS