הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג'ין משלוח בעכברים

28.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51481

⸱

5 במאי 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

במאמר זה

סיכום

בtransfection vivo של DNA עירום על ידי מסירת גן הידרודינמית מציג גנים לתוך הרקמה של בעלי חיים עם תגובה דלקתית מינימאלית. כמויות מספיקות של מוצר גן נוצרות באופן שתפקוד הגן והרגולציה, כמו גם מבנה חלבון ותפקוד ניתן לנתח.

תקציר

ביטוי יעיל של transgenes in vivo הוא בעלת חשיבות מכרעת בלימוד תפקוד גן ובפיתוח טיפולים למחלות. בשנים האחרונות, משלוח הידרודינמית גן (HGD) התפתחה כשיטת פשוטה, מהירה, בטוחה ויעילה לאספקת transgenes למכרסמים. טכניקה זו נשענת על הכוח שנוצר על ידי ההזרקה המהירה של כמויות גדולות של פתרון פיסיולוגי כדי להגדיל את החדירות של קרום תא של איברי perfused ובכך להעביר דנ"א לתוך תאים. אחד היתרונות העיקריים של HGD הוא היכולת להציג transgenes לתאי יונקים באמצעות DNA עירום פלסמיד (pDNA). היכרות עם גן אקסוגני באמצעות פלסמיד היא מינימאלי מייגע, יעיל ביותר ובניגוד לנישאים נגיפיים, בטוח להפליא. HGD שימש בתחילה להעברת גנים לעכברים, הוא משמש כעת כדי לספק מגוון רחב של חומרים, כולל oligonucleotides, כרומוזומים מלאכותיים, רנ"א, חלבונים ומולקולות קטנות לעכברים, חולדותו, במידה מוגבלת, בעלי חיים אחרים. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים ומתמקד בשלושה היבטים מרכזיים של השיטה שהן קריטיים לביצוע ההליך בהצלחה: הכנסה נכונה של המחט לווריד, נפח ההזרקה ומהירות המשלוח. ניתנות דוגמאות כדי להראות את יישומה של שיטה זו לביטוי החולף של שני גנים המקודדים חלבונים מופרשים, הפרימטים ספציפיים, אפוליפופרוטאין LI (תתנצ-I) וחלבונים הקשורים לhaptoglobin (HPR).

מבוא

מאז התיאור הראשון שלה על ידי יו et al. וג'אנג et al., משלוח הידרודינמית גן (HGD) הפך לכלי רב ערך ללימוד תפקוד גן במערכות מכרסמים מודל 1, 2. הטכניקה כרוכה בהזרקה המהירה (5-7 שניות) בהיקפים גדולים (8-12% ממשקל גוף) של פתרון לוריד הזנב של עכברים כדי להקל על הספיגה של ה-DNA פלסמיד על ידי התאים של אברי מטרת 1, 2. תנאים אלו מובילים לביטוי גנים חזק בכבד ובביטוי פחות גנים בכליות, טחול, הריאות ולב.

הזרקה של 10 מיקרוגרם פלסמיד pCMV-LacZ יכולה transfect ככל 40% מhepatocytes, מה שהופך HGD השיטה היעילה ביותר, לא ויראלי, in vivo מסירת הגן עד כה 1. בניגוד לנישאים נגיפיים, pDNA הוא קל להכנה, לא לעורר תגובה חיסונית במארח המכרסם 3 ואינו מהווה סיכון בריאותי על ידי recombining עם הסוףוירוסי ogenous. בנוסף, מאחר שמולקולות ה-DNA מועברות על ידי HGD לא צריכה אריזה, שיטה זו מתאימה למשלוח של כרומוזומים בקטריאלי מלאכותיים (BAC) גדולים כמו 150 KB 4. סוגים אחרים של מולקולות שכבר נמסרו על ידי שיטה הידרודינמית כוללים RNA 5-10, 11 morpholinos, חלבוני 12, 13 ומולקולות קטנות אחרות 12, 14. היתרונות והחסרונות של HGD על פני שיטות משלוח אחרות כבר נדונו בביקורות מצוינות בספרות 15-20 ומספר המחברים סיפק תיאור מפורט של ההליך 21-23.

היכרות transgenes לעכברים על ידי HGD היא בטוחה ויעיל 1-3, 24 והשיטה נעשתה שימוש בחולדות עם הצלחה דומה 25. עם שינויים מסוימים, ניסויי הוכחה של הקונספט בוצעו בתרנגולות 26, ראבביטים 27 וחזירים 28, אם כי, vivo היישום בטכניקה זו בבעלי חיים גדולים יותר עדיין מהווה אתגר. בעת השימוש בשיטה זו, עוד הגבלה נפוצה היא שרבים מוקטורי הביטוי היונקים הזמינים חסרים את המרכיבים כדי להשיג רמה גבוהה מתמשכת, של ביטוי גנים. באמצעות פלסמיד, ביטוי גני pCMV לוק באברי המטרה ניכר כבר בעשר דקות לאחר HGD, לעומת זאת, רמת הביטוי הראשונית, הגבוהה יורדת בצורה חדה בשבוע שלאחר הזרקת 1 הראשון. ביטוי transgene ארוך טווח אפשרי בהתאם לאמרגן ואינטרון השתמש בפלסמיד עיצוב 3, 24 זריקות עם זאת, תחזוקה של ביטוי גנים ברמה הגבוהה דורשת לעתים קרובות חוזרות ונשנות. מסיבה זו, HGD עשוי להיות פחות מתאים ללמוד מחלות כרוניות שהן תוצאה של חשיפה ארוך טווח לחלבונים מזיקים או מוצרי חלבון. עם המגבלות האלה, HGD הוא כלי רב עוצמה במיוחד ללימוד פותפקיד tential של גן ואת ההשפעה שלו מוטציות in vivo, כמו גם את ההשפעות והרגולציה של חלבונים הטיפוליים ולהקמת מודלים של בעלי חיים למחלות (לסקירה, ראה 15). לדוגמא, HGD ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציה לתחומים וחומצות אמינו של חלבונים על ידי החדרת בנפרד מבני גנים שונים לעכברים שהגנים המתאימים בנוקאאוט. יתר על כן, בטכניקה זו ניתן להשתמש בכל זן עכבר.

פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים עם דגש על ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להשיג transfection המוצלח: החדרת מחט נכונה לוריד, הזרקת הנפח ומהירות המשלוח. יישומה של שיטה זו בא לידי הביטוי במודל של עכברים של trypanosomiasis אפריקה, מחלה של בני אדם ובעלי חיים קטלנית 29, 30. בעוד כמה מינים של trypanosomes לגרום למחלות בבעלי חיים, רוב לא יכול לגרום למחלה בבני אדם בשל מולדת מתחמים חיסוניים בבגורמי עונג עילאי טבע דם הנקראים trypanosome ממס (TLFs) 29, 31 ב, 32. , ליפופרוטאינים אלה יוצרים הנקבוביות בצפיפות גבוהה (HDL) מכילים שני חלבונים ייחודיים, הפרימטים ספציפיים:. HPR, ליגנד, המאפשר את הספיגה של TLFs לtrypanosomes, ותתנצ-I, את רכיב ממס ביום 31 ב, 33-38 Trypanosoma rhodesiense brucei הוא מסוגל להדביק בני אדם בשל ביטוי של חלבון בסרום הקשורים התנגדות (SRA) שנקשר ומנטרל תתנצ-אני אדם 34, 39. בון TLF לא נוטרל על ידי SRA בשל תתנצ-חלבון מסתעף 40. כפי שדווח בעבר, באמצעות וקטור יונקים ביטוי (pRG977), ביטוי מהונדס של רכיבי TLF בון בעכברים מקנה הגנה מפני trypanosomes אדם זיהומיות 40. הנתונים שהוצגו כאן הנציג להדגים כיצד מסירת גן הידרודינמית ניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהאנטר קולג', האוניברסיטה של ​​העיר ניו יורק.

1. הכנה של ה-DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי

  1. פיק מושבה אחת של חיידקים המכילים את הגן של עניין בוקטור ביטוי יונקים מצלחת סלקטיבית טרי מפוספסת.
  2. בצע את ההמלצות שנמצאו בספר ההדרכה של ערכת טיהור פלסמיד זמינה מסחרי ללא רעלן פנימי לגידול וקציר חיידקים.
  3. לטהר DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי מתאי חיידקים על ידי ביצוע הפרוטוקול של ערכת טיהור פלסמיד ללא רעלן פנימי זמינה באופן מסחרי.
  4. השתמש בכלי פלסטיק ללא רעלן פנימי ולהתמודד עם ה-DNA בזהירות כדי להבטיח רעלן פנימי שאינו מחדש הציג לדגימת DNA לאחר שלב ההסרה.
  5. למדוד את הריכוז של ה-DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי על ידי קביעת הספיגה שלה ב260 ננומטר באמצעות MICRספקטרופוטומטר o נפח UV כמתואר להלן או סטנדרטי, ספקטרופוטומטר מבוסס קובט.
    1. נקה את המשטחים אופטיים התחתונים ועליונים של מערכת השמירה מדגם ספקטרופוטומטר מיקרו כדלקמן. μl פיפטה 1 של מים deionized נקיים על המערכת האופטית נמוכה יותר. סגור את זרוע המנוף והקש עליו כמה פעמים כדי לרחוץ את המערכת העליונה אופטית, ואז מנוף פתוח ולנגב לנקות עם רקמה.
    2. פתח את התוכנה של ספקטרופוטומטר מיקרו ובחר את מודול חומצות הגרעין.
    3. הנח מים deionized נקיים 1 μl על המערכת האופטית נמוכה יותר, להפחית את זרוע המנוף ובחר "לאתחל" מהתוכנה. ברגע אתחול הוא משטחים שלמים, נקיים שני אופטיים עם רקמה ..
    4. לבצע מדידה ריקה על ידי טעינת 1 μl של חיץ TE ללא רעלן פנימי (10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA) ובחירה באפשרות "ריק" מהתוכנה. משטחים ברגע מדידה ריקה נעשה, נקיים שני אופטיים עםרקמות.
    5. לבצע מדידת מדגם על ידי טעינת 1 μl של דגימת DNA ללא רעלן פנימי ובחירה באפשרות "למדוד" מהתוכנה. רשום את ריכוז ה-DNA. להעריך טוהר-DNA על ידי הקלטת יחס הספיגה 260/280 ננומטר שמופיע על המסך. מכיוון שהשימוש בדנ"א הטהור (260/280 יחס 1.8) לHGD רצוי מאוד, להימנע משימוש בדגימת DNA עם יחס 260/280 מתחת 1.7. ברגע שהמדידה נעשה, לנקות גם משטחים אופטיים עם רקמה.

2. משקל של עכברים

  1. מארק עכברים באופן מתאים למתח. שים לב: סימון של הזנב אינו מומלץ להליך זה.
    1. מיני עכבר מארק שיש פרווה לבנה (למשל השוויצרי וובסטר) על גבם עם טוש שחור. מרח את קרם הסימנים לאורך זמן בהתאם לצורך.
    2. מיני מארק עכבר שיש לי פרווה שחורה (למשל C57BL / 6) על ידי אוזן ניקוב כמה ימים מראש.
  2. שוקל individua עכבריםlly בעדינות על ידי הצבת אותם במחבת במשקל של בעלי חיים או דלי שהונח על איזון מעבדה דיגיטלי. רשום את המשקל של כל עכבר המשמש בניסוי, ביום של הניסוי.

3. הכנת מזרקים

  1. הכנת תערובת ההזרקה
    1. לחשב את כמות ה-DNA הנדרשת על ידי הנחת 5-50 פלסמיד דנ"א ללא רעלן פנימי מיקרוגרם לזריקה של כל עכבר.
      1. לקבוע את הכמות האופטימלית של ה-DNA פלסמיד בניסוי.
      2. בעת קביעת כמות ה-DNA הנדרש, מניח הזרקה של עכבר אחד נוסף לכל קבוצה, כמו טעינה תקינה של המזרקים תדרוש קצת תמהיל הזרקה נוסף. כדי לעזור לחישובים, לשקול את הדוגמא הבאה: להזריק 4 עכברי ניסוי ו4 שליטה, כל גרם במשקל 25, עם 50 פלסמיד דנ"א מיקרוגרם לכל עכבר. כדי לקבוע את כמות ה-DNA הנדרשת במקרה זה, לחשב עם 5 עכברים בכל קבוצה: 5 x 50 מיקרוגרם = 250 DNA מיקרוגרם דרוש לכל קבוצה.
    2. לקבוע את הכמות של תמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי) הנדרשת על ידי הנחת 10% ממשקל גוף להזרקה של כל עכבר.
      1. לפי הדוגמא לעיל, להזריק כל עכבר 25 גרם עם 50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד ב2.5 מיליליטר תמיסת מלח (נוזל גרם 2.5).
      2. בעת קביעת הסכום של תמיסת מלח הנדרש לקבוצה שלמה של עכברים, מניח הזרקה של עכבר נוסף לכל קבוצה, כדי לאפשר טעינה תקינה של המזרקים. בהתחשב בניסוי נתון, לחשב את כמות הדרושה למלוח 5 עכברים בכל קבוצה: 5 x 2.5 מיליליטר = 12.5 מיליליטר תמיסת מלח לכל קבוצה (או 25 מיליליטר בסך הכל). הערה: אם עכברים בתוך אותה הקבוצה אינם זהה במשקל (הבדל יותר מ -10% במשקל גוף), להכין הזרקה מתערבבת בנפרד.
    3. השתמש במלח חומר משמר וללא רעלן פנימי, סטרילי שאושר לשימוש בבני אדם, ב10 מיליליטר, בקבוקוני שימוש מרובים.
    4. באמצעות מחט 20 מד (0.9 מ"מ x 25 מ"מ) מחוברת לקצה luer נעילה של מזרק 20 מיליליטר,למשוך את הנוזל מבקבוקונים מלוחים ורוקן את המזרקים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. כדי לעזור pipetting מדויק של מלח בזמן הכנת תערובות הזרקת ה-DNA מלח, לאסוף מלח יותר מהדרוש להזרקה של כל העכברים בניסוי. לצורך הניסוי לעיל, לסגת מלוח מ3, 10 מיליליטר בקבוקונים (כולל של כ 30 מיליליטר) גם אם הכמות המחושבת של מי מלח הנחוץ לניסוי היא רק 25 מיליליטר.
    5. פיפטה את הכמות המחושבת של דנ"א לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר שונה. יש להיזהר שלא לגעת בצד של הצינור עם גוף פיפטה כדי למנוע כניסתה של רעלן פנימי. על פי הדוגמא, פיפטה 250 מיקרוגרם של שליטה ו250 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד הניסיוני לתוך צינורות חרוטי בנפרד.
    6. הוסף את הכמות הנדרשת של מי מלח לדנ"א באמצעות פיפטה סרולוגיות. בהתחשב בניסוי המדגם, פיפטה 12.5 מיליליטר תמיסת מלח לכל אחת מהתערובות הראשיים (ניסוי וביקורת).
    7. אפשר את כל הפתרונות להגיעטמפרטורת חדר לפני ההזרקה.
  2. הכנת מזרקים
    1. לכל עכבר, למלא 3 מיליליטר, מזרק עם תערובת ה-DNA מלוחה באמצעות מחט סטרילית, 20 מד (0.9 מ"מ x 25 מ"מ) סטרילי, luer נעילה. תשמור על עצמך, כדי למנוע בועות אוויר. הימנע משימוש במזרקים בנפח גבוה יותר כמו קצב הזרימה של הזרקה לא ניתן לשלוט טוב מאוד, וקשה לתמרן מזרקים גדולים יותר ביד אחת. הוצא כל תערובת ה-DNA מלוחה עודפת בחזרה לתוך צינור חרוטי כמו זה עשוי להיות שימוש חוזר.
    2. לעבור את המחט למחט סטרילית, 27-מד. מלא את המחט עם נוזל לחלוטין ללא החדרת בועות אוויר. כוון את עוצמת הקול של תערובת ה-DNA מלוחה כפי שחושב על בסיס המשקל של העכבר.
    3. אל תאפשר את המחט הסירה את המכסה לגעת כל משטח שאינו סטרילי. במידת צורך, מחטים עשויות להיות מחדש כתרים שימוש בטכניקה ביד אחת: להציב את הכובע על משטח שטוח, להכניס את המחט בלי להחזיק את הכובע ביד השנייה ולחץ את המחט כתריםנגד אובייקט מוצק כדי להבטיח את הכובע על המחט. המזרקים מוכנים לזריקות וריד זנב עכשיו.

4. משלוח DNA הידרודינמית

  1. שימו לב שעכברי הרדמה עשויים להפחית את הכדאיות. הימנע מביצוע HGD בחדר כי הוא קר מדי, כפי שזה יהיה גם להפחית את הכדאיות. אם בחדר יש טמפרטורת סביבה של C ° 20 או אם בהרדמה, הנח את העכברים על כרית חימום שנקבעה על 37 הודעה C ° הליך כדי למנוע אובדן של כל בעלי חיים. אם בהרדמה, להבטיח כי את הפה והחוטם של העכבר הם בלא הפרעה ואילו על כרית החום ולבחון את העכבר עד שהוא מתאושש באופן מלא. לא למנוע ממנו מזון או מים מהעכברים לפני HGD.
  2. לחמם את העכברים להרחבת כלי דם.
    1. מניחים את כלוב העכבר (עם מצעים כלולים) על משטח חום במשך 5 דקות, כך שהטמפרטורה של המצע היא כ 38-39 ° C. הטמפרטורה צריכה להיות נמוכה מספיק כדי לשמור על העכברים על כרית החוםהוארך התקופה.
    2. לחלופין, למקם את העכבר לעוצר גישה הגבי באיפוק מינימאלי. לחמם את הזנב של עכבר דקות 1 בעדינות על ידי מחזיק אותו עם פיסת הגזה הרטובות במים חמים. לאפשר עכבר מחדש עמדה, במידת צורך. נגב את הזנב עם רקמה לייבוש.
    3. לחלופין, עכבר חם על ידי הצבת הכלוב תחת מנורת חום לא יותר מ -2 דקות. אם אתם משתמשים במנורת חום, לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע התחממות יתר של העכבר.
  3. הזרקה לוריד זנב בהיקפים גדולים
    1. לשתק עוצרים גישת גב על משטח שטוח ידי קלטת מעבדה.
    2. מחזיק בזנבו, במקום את העכבר בעדינות לתוך העוצר ולהכניס את התקע. השתמש באיפוק כמו שדרוש כדי לשמור על הזנב משותק. ודא שהעכבר הוא נושם בחופשיות.
    3. אם העכבר הוא במצוקה קשה בכל נקודה במהלך ההליך, הסר את העכבר מהעוצר באופן מיידי ולאפשר לו לנוח.
    4. מקם את העכבר כל כךאחד מורידי הזנב לרוחב גלוי. אתר את ורידי הזנב לרוחב על ידי מסתכל ישר למטה בחלק האחורי של העכבר: הקו האדום פועל באמצע הזנב הוא עורק, בעוד הקווים הכחולים בכל צד של הזנב הם ורידי הזנב לרוחב.
    5. נגב את הזנב של העכבר ביסודיות עם ספוגית אלכוהול.
    6. שימוש הלא הזרקה השני, להחזיק את הזנב בחוזקה בין האצבע ואמה כך שהזנב עובר מתחת לאצבע המורה, מעל באמצע והאצבעות שלישיים ומתחת לאצבע הקטנה. לאפשר לאגודל להישאר חופשי לנוע. (איור 1 א)
    7. שימוש מצד השני, לנגב את האזור להיות מוזרקים שוב עם ספוגית אלכוהול. אפשר לאזור לייבוש.
    8. תרים את המזרק הטעון עם הזרקת היד והחזיק אותו בחבית בין האגודל ואת ארבע הספרות אחרת. אל תחזיק על הבוכנה.
    9. מקם את מקביל המזרק לזנב עם ההצבעה המחט לכיוון גופו של העכבר וההטיה (קצה אלכסוני) של המחט פונה כלפי מעלה.
    10. הכנס את המחט לתוך וריד הזנב. להמשיך עם ההזרקה רק אם הווריד ממוקם בצורה נכונה, וזה ניכר מהמחט הזזה בללא התנגדות. שים לב שעומק החדרת מחט הוא עניין של העדפה אישית לעומת זאת, הכנסה מלאה אינה מומלצת בשל סיכון מוגבר של גז מהווריד. הימנע הזזת המחט.
    11. שימוש באגודל של החזקת הזנב השני, לסגור על הרכזת של המחט ורכזת העיתונות נגד הזנב להחזיק מחט בעמדה. אל תפעיל לחץ קיצוני ולא להיאחז פיר מחט, כמו אלה לעכב את הזרימה של נוזלים לווריד. החזק את הזנב עם האצבע באופן רופף בשלב זה כדי לא לעכב (איור 1 א) הזרקה.
    12. למקם מחדש מחזיק מזרק ביד, כך שאצבע המורה והאמה מחזיקים על מקורבות והאצבע היא בסופו של הבוכנה (figurדואר 1A).
    13. לחץ כלפי מטה על בוכנה באחד תנועה, רציפה ומזריק את מלוא העצמה של נוזל ב6-8 שניות.
    14. הסר את המחט מהווריד ולעצור את הדימום על ידי הפעלת לחץ עדין על הזנב עם רקמה.
    15. הסר את העכבר מהעכבר עוצר ומקום לכלוב התאוששות מונח על גבי כרית חימום (מצעים צריכים להיות 37-38 מעלות צלזיוס). אם חדר ההזרקה הוא קר, שלב זה הוא קריטי להישרדות עכבר. להחזיק את הזנב של העכבר עד שהדימום מפסיק לחלוטין.
    16. שים לב לעכבר לשעה 1 לאחר לידת DNA הידרודינמית. התקופה ראשונית של מתנשף וחוסר תנועה היא נורמלית עקב הפרעות קצב הזמניים שנגרמו על ידי HGD אבל לוודא שהעכבר מראה סימנים של התאוששות בכ 5 דקות. אם הנשימה של העכבר הופכת להיות מאוד רדודה, לעסות בעדינות את הבטן של העכבר כדי להקל על נשימה. שים לב שהשיעור של התאוששות עשוי להיות מושפע מעט על ידי זן העכבר בשימוש.
    17. עכבר תשואהלכלוב דיור ולהבטיח כי העכבר של שפע של מזון ומים.
  4. הזרקה לוריד זנב בהיקפים גדולים באמצעות יד עמדה חלופית
    1. העבר את העכבר לעוצר ולהתכונן לזריקה על ידי ביצוע שלבי 4.3.1 דרך 4.3.5, כפי שתואר לעיל.
    2. הנח את הלא הזרקת היד על משטח שטוח עם ארבע אצבעות כפופות בזווית של תשעים מעלות. האצבעות (כולם מלבד אגודל) צריכים לנוח על גב אחד את השני, יצירת פלטפורמה. להחזיק את הזנב של העכבר בין האגודל ואצבע המורה (איור 1).
    3. שימוש מצד השני, לנגב את האזור להיות מוזרקים שוב עם ספוגית אלכוהול. אפשר לאזור לייבוש.
    4. תפוס את המזרק עם הזרקת היד ולהחזיק אותו על ידי מקורבות וסופו של הבוכנה, מוכנה להזרקה.
    5. להשלים את ההליך על ידי ביצוע פרוטוקול זה מהצעד 4.3.9 עד שלב 4.3.17, כפי שתואר לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מיקום נכון של המחט לוריד הזנב של העכבר (כפי שמודגם באיור 1) הוא תנאי הכרחי לאספקת transgene בהצלחה על ידי transfection מבוסס הידרודינמיקה. לעתים קרובות החלק המאתגר ביותר של הטכניקה, לעומת זאת, הוא השמירה של המחט בתוך וריד הזנב ללא תנועה כך שכל הנפח של הזריקה יכול להיות מועבר בתוך תקופה של 6-8. טעויות קטנות במהלך תהליך ההזרקה עלולות לגרום ליעילות transfection מופחת בהרבה וביטוי חלבון. לכן, זה הכרחי כדי לפקח על ההצלחה של HGD עבור כל ניסוי. אם החלבון המהונדס של עניין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאשר מבוצע כהלכה, HGD הוא אמצעי בטוח ויעיל להפליא של משלוח transgene. השלבים הקריטיים לHGD המוצלח הם: 1) מספק את הכמות הנכונה של ה-DNA בנפח גדול של מי מלח רכב 2) לוריד הזנב של עכבר 3) בפחות מ -8 שניות.

למרות התהליך של הזרקה עצמה ללא ספק דורש קצת מיומנות ידנית, ההצלחה של הליך שש שני זה לעתים קרובות נמצאת בהכנה קפדנית של הניסוי. כמות pDNA הדרושה כדי להשיג ביטוי גנים מקסימאלי עשויה להשתנות במידה רבה בהתאם לפלסמיד המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים לשיה יו (Regeneron Pharmaceuticals) להתחלה מלמד אותנו את הטכניקה וHGD ד"ר ראסל תומסון (אלברט איינשטיין לרפואה) להדרכה המתמדת שלו בהיבטים שונים של הטכנולוגיה. עבודה זו מומנה על ידי Hunter College, CUNY להתחיל את הקרנות ופרס NSF לחם IOS-1,249,166. אנו מודים NYULMC histopathology Core מרכז NYUCI תמיכת גרנט, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 להיסטולוגיה בכבד עכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

ערכת מגבון
רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הכנה לאלכוהולWebcol6818
AST, Amplite ColorimetricAAT Bioquest13801
צינור חרוטי, 50 מ"לBD Falcon352070
EndoFree פלסמיד ערכת מקסיQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
מאיר זנב עכברBraintree ScientificMTI RSTאו מחט שוות ערך
, 20 Gx 1 (0.9 מ"מx25 מ"מ)מחט305175BD
, 27 Gx 1/2 (0.9 מ"מx25 מ"מ)BD305109
pRG977 (וקטור ביטוי יונקים)נדרש הסכם העברת חומריםשל Regeneron Pharmaceuticals
נתרן כלורי, 0.9% INJ USP 10 מ"ל, Hospira מזרק פישרNC9054335
, 3 מ"ל, Luer-Lok TipBD309657Luer Lock הכרחי כדי לעמוד בלחץ מ-HGD

מקורות

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
  4. Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
  5. Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
  6. Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
  7. Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
  8. Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
  9. McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
  10. McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
  11. McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
  12. Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
  13. Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
  14. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
  15. Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
  16. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
  17. Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
  18. Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
  19. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
  20. Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
  21. Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
  22. Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
  23. Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
  24. Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
  25. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
  26. Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
  27. Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
  28. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
  29. Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
  30. Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
  31. Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
  32. Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
  33. Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
  34. Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
  35. Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
  36. Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
  37. Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
  38. Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
  39. Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
  40. Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
  41. Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
  42. Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
  43. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי חלבון זמניDNA פלסמידי עירוםהזרקה לווריד הזנבאנליזת Western Blotדגימת דם מעכברהכנת DNA פלסמידיטכניקת טעינת מזרקשמירה על מיקום המחטזיהוי APOL-I HPR
ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג'ין משלוח בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.