Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות

הגורם העיקרי לתמותה בחולים עם קרצינומה של תאי כליות (RCC) הוא מחלה גרורתית מערכתית שמתרחשת בדרך כלל בעקבות ניתוח להסרת גידול ראשוני גדל בכליות. עם זאת, מעט מאוד מודלים גידול פרה הערכת תרופות ניסיוניות בעכברים כוללים מחלה גרורתית, ועוד פחות מזה בנאמנות לשחזר את השלבים הקליניים של גידול מקומי, ניתוח, וייזום מיקרו גרורתי ספונטני והתקדמות ^1-3. פער בבדיקה זו הפך להיות חשוב יותר ויותר בהערכה של טיפולים חדשים כמו שלפעמים השפעות אנטי סרטניים מרשימות לראות במודלים של בעלי חיים לא תמיד מתורגמות לטיפול מוצלח באופן דומה של חולים ^4. הבדלים כאלה בתוצאות עשויים לנבוע מefficacies תרופת ההפרש בין דגמים המקומיים מחוץ לרחם או orthotopic גידול ראשוניים ומחלה גרורתית בשלב מאוחר ^5-7. במקרה של RCC, רק מחקרים מעטים הועסקו הוקםפרוטוקולי nimal הכוללים הישנות מחלה ספונטנית שמחק חולים שבדרך כלל יש לו כליות נושאות גידולים באופן מלא או באופן חלקי הוסרו ^2,3. הסיבות למחסור זה בבדיקות במודל עכבר להשתנות. ראשית, יש את העלות של בעלי החיים הגבוהה וההשתנות הגלומה בבחירת תאי גידול ואת הפוטנציאל גרורתי. לדוגמא, שורות תאי כליה אנושיות נוטות לשלוח גרורות לעתים נדירות, ויש לבחור על סיבובים רבים של השתלה ראשונית orthotopic ובחירה גרורתי להפיק גרסאות שאופן עקבי להפיץ ויוצרים נגעים רחוקים (ראו תיאור של גזירת שורת תאים אנושית כגון ^8-10) . לעומת זאת, תאי עכבר במודלים של מערכת חיסון נוטים להתנהג בצורה אגרסיבית, ומספרי תא נמוכים חייבים להיות מוזרקים עם matrigel להפחית התפשטות מערכתית מיידית ^3. שנית, metastati ספונטני קשיים טכניים בביצוע השתלה נכונה, כריתה כירורגית (כריתת כליה), ומעקב (וכימות)צמיחת ג יכולה להיות מאתגרת ומספר משתנים קריטיים צריכים חשבון בעת ​​העסקת טכניקה זו (ראה דיון לפרטים נוספים). מטרתו של פרוטוקול זה היא לתאר את הצעדים החיוניים (כמו גם בעיות פוטנציאליות) של השתלת orthotopic, כריתה (כריתת כליה), וניטור של מחלת RCC גרורתי ספונטנית ולהציע קו מנחה לסטנדרטי (ונפוץ יותר) להשתמש בין מעבדות מדעיות כי להעריך את היעילות של תרופות ניסיוניות.

1. השתלת גידול בכליות Orthotopic

1. תרבית תאים
   1. לפני השתלת orthotopic, לגדל תאי עכבר RENCA ^לוק כmonolayer לconfluency 75%.
   2. בעקבות trypsinization וresuspension בתקשורת 5% FBS המכיל, תאי צנטריפוגות ב 1,000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, חוזרים 3 פעמים כדי לשטוף ב-PBS. אז resuspend התאים בסרום ללא מדיה לריכוז של 5 x 10 ^{4 לוק} / 5 סרום ללא מדיה μl RENCA.
      הערה: בהתאם לגרסה או הקו סלולרי בשימוש, ניתן resuspended תאי ביחס של 1:1 מmatrigel ותקשורת חופשית בסרום כדי להאט צמיחה אגרסיבית מאוד עכבר תא והפצה לאחר השתלה.
2. השתלת ניתוח ותא
   הערה: כל המחקרים בבעלי החיים שמתוארים בו, כוללים תחזוקה ונחישות של נקודות קצה ניסיוניות, בוצעו על פי עמ 'ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש מוסדית (IACUC)rotocol אושר על ידי Roswell Park Cancer Institute.
   1. הרדימי אחד עכבר BALB / C באמצעות Isoflurane (2-3%). צבוט את הרגל ולבדוק לרפלקס כדי להבטיח הרדמה מספיק. החל משחה וטרינר לעיניים כדי למנוע התייבשות. העבר את העכבר שכיבה לרוחב נכון ולגלח את צד שמאל בין קדמי ואחורי גפה. החל אלכוהול ויוד לאורך אזור המותני הגבי להכין סביבה נקיה מחיידקים באזור לחתך.
   2. השתמש במספריים כירורגית ליזום חתך בעור 1 סנטימטר בכיוון אורך בין הצלע האחרונה ומפרק הירך. שחרר רקמת חיבור מתחת לעור באמצעות מספריים לנתיחה בוטים. השתמש במספריים כירורגית כדי לעשות חתך 0.5 סנטימטר בכיוון אורך בדופן הבטן. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לדחוף למטה בעדינות סביב פצע פתוח - זה יהיה exteriorize הכליות ולאפשר לקיבוע עדין של איבר לפני הזריקה.
   3. טען את מזרק המילטון עם 5 μl תערובת התא מוכנה. לimplan תת קופסיתtations, יכולה להיות מועסקות בשתי שיטות השתלה:
      1. שטחי: ריצה במקביל לכליות, מחט להכניס חוקיים אורכים תחת הקפסולה הכליות (אבל מעל parenchyma) עם הקצה המשופע מעלה. ברגע שהמחט נמצאת במקומו, מזריק את כל התאים עד צורות בועה הלבנות קטנות. לאט לאט להסיר את המחט מכמוסה ומייד למחוק מעל הזרקה עם המוליך כותנה שקצהו סטרילי כדי לספוג כל דליפה ולמנוע הפצת תא.
      2. פנימי: עם קצה למעלה ומתחילים מהצד של ההפך כליה לאתר השתלה סופי משופעים, להכניס מחט דרך הפנים של כליות עד המחט גלויה (אך לא ניקוב) החלל תת קופסית. הזרק את כל התאים עד צורות בועה לבנה ואתר הזרקת ספוגית כדי למנוע כל דליפה.
   4. בעדינות להחזיר את הכליות לחלל הגוף. סגור את קיר גוף הבטן באמצעות תפר 5-0 Vicryl נספג. לאחר ההשלמה, למשוך את שכבת העור יחד ומניח 2-3 wound קליפים. קליפים להבטיח איתנים ומחולק באופן שווה כדי להבטיח שאין חשיפת פצע. לפני ההתאוששות לנהל 500 μl של .0.9% NaCl ושל עצירות (0.01 מ"ג / מיליליטר) 100 μl מתחת לעור באמצעות מחט 25 G. באופן שיגרתי לפקח מיקום סרטון ויציבות, ולהסיר אחרי 10 ימים.

2. Nephrectomy / הסרת גידול ראשונית

1. עקוב פרוטוקול זהה להרדמת עכבר, חוסר תנועה, חתך, וחשיפה של כליות כמתואר בסעיפי 1.2.1 ו 1.2.2 (לעיל).
2. השתמש זוג שני של מלקחיים על מנת לבודד את הכליות בעדינות על ידי הסרת רקמת חיבור שומן מקצה הזנב ואת בלוטת יותרת הכליה מקצה הגולגולת של הכליה. בעוד לתפוס את הכליות בעדינות, להשתמש תפר נספג 5-0 Vicryl לעשות קשר כפול סביב השופכן, עורק כליה, ווריד. לאט מאובטח ולאחר מכן לחתוך מעל הקשר כדי להסיר את הכליה. אם כל סימן של איבוד דם באופן מיידי, או שיש סיכון לאחיזה מספיקהתפר בשופכן, עורק, וריד, ואז להשתמש cauterizer במקום מספריים לחתוך מעל קשר.
3. ברגע שהכליות מוסרות, לבדוק היטב עבור כל דימום מהעורק קשור ולהשתמש cauterizer במידת צורך. סגור את קיר גוף הבטן באמצעות 5-0 Vicryl. משוך את שכבת העור יחד ומניח 2-3 קליפים פצע הבא באותו אמצעי זהירות כפי שתואר ב1.2.4. לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים יומיים לאחר ניתוח לסימני מצוקה, דימום, או ניידות מוגבלת. פעל לפי הנחיות מוסדיות לבעלי חיים בבטחה.

3. ניטור גרורתי התקדמות ולוקליזציה בנקודתי קצה

1. כימות מחלה גרורתית: ניטור Bioluminescent
   1. ראה המתודולוגיה שתוארה קודם לכן ביופיטר לניטור גרורות באמצעות תאי transfected עם לוציפראז ולכמת באמצעות ^11,12 מערכת ההדמיה Xenogen IVIS.
2. מדריך לנתיחה לאחר מוות ויזואלי להערכה השוואתית של חלוקה גרורתיtion
   1. להקריב את החיות על פי הנחיות מוסדיות באמצעות נקודות קצה, כולל סימני מצוקה, נשימה מאומצת, ירידה במשקל, וכו '
      הערה: ניטור מדוקדק של בעלי חיים הוא קריטי כמו התקדמות גרורתית ספונטנית יכולה להיות משתנה ומהירה מאוד.
   2. השתמש במספריים כירורגית ליזום חתך מעל השופכה שממשיכה את חלל בית החזה ללסת תחתונה נמוכה יותר. השתמש במספריים הסתיימו בוטים להפריד את העור מהשרירים של דופן הבטן.
   3. ליזום חתכים לאורך זרועות ורגליים. עור פיל משם. מקרוב לבחון את fascia העור וקיר בטן לגושים, ואז בלוטות הלימפה השטחיות: מפשעתי, זרוע, בית השחי וצוואר הרחם שטחי.
   4. עושה חתך בדופן הבטן ולחתוך לאורך הצדדים לרוחב שמאלה וימינה עד לסרעפת. עם חתך אחד אופקי להסיר את החלק הקדמי של דופן הבטן חשופה הקרביים.
   5. לבחון את המראה בלתי מופרע של f הקרבייםאו גס גידולים ראויים לציון. כמו כן שים לב את התוכן של הקיבה ומעיים; אם הם ריקים, העכבר אולי לא היה מסוגל לאכול. אם התוכן הוא כהים, זה עשוי להצביע על ראיות של דימום עליון / תחתון של קיבה ומעיים.
   6. מבחינה ויזואלית להבקיע כל איבר לנוכחות גידול או היעדרות, הקצאת ציון הכולל לכל קבוצה בעכבר (4 חיות לכל קבוצה משמשת כדוגמא באיור 1D-i).
      הערות: 1) הגדלה של בלוטות הלימפה לא בהכרח אומרת שזה גידול הסרטני; אם כן, הוא במידה רבה בגודל, תקיף מאוד, וצבע לבנבן, סביר להניח גולה גרורתי. 2) חלבי מוגזם או נוזל עכור בבטן מצביע על מיימת. מיימת עשויה לכלול הצטברויות מוצקות על אברי הבטן, במיוחד בין האונות של הכבד והקיבה. 3) לאיברים כגון ריאות, גושים מרובים יכולים להיות נוכחים ונספר להשוואות בין בעלי חיים הבודדים (ראה ¹³ לדוגמא).
   7. לזהות גידולי ברוטו או מומים של אברי בטן הבודדים: כבד, טחול, כליות ולבלב על ידי הסרת בזהירות ושטיפה עם PBS מבקבוק להשפריץ.
   8. לאחר הסרת אברי הבטן, לבדוק את בלוטות הלימפה בבטן, כוללים המותני, עצם העצה, כליות, ובלוטות לימפה mesenteric.
   9. להעריך סרעפת עדויות להתפשטות גרורה.
      הערה: התפשטות נרחבת על הסרעפת יכולה לגרום לו לאבד את התכווצותו, מה שמוביל לעמל או אובדן הנשימה.
   10. הסר את הסרעפת ולעשות שני חתכים רוחב בחלל בית החזה, הסרת החלק הקדמי על מנת לחשוף את הריאות ולב.
   11. הסר את ריאות ולב בעדינות על ידי אחיזה ומרים את הוושט וחיתוך קנה הנשימה מעל הלב. להעריך רקמות לגושים. סוחטים את לב. חוסר העקביות קפיצית עשוי להצביע על הווה גידול.
   12. השתמש במספריים כירורגית לחתוך באופן ליניארי דרך גולגולת. להסיר בעדינות חתיכות קטנות של גולגולת עד שלאהמוח כולו הוא נחשף. חפש בכל רחבי מוח לגושים גלויים או כתמי מומים.

איור 1 א מציג סכמטי המתווה את הנהלים המפורטים בסיכום פרוטוקול זה. מספר גורמים חשובים יש לקחת בחשבון לכל צעד. לדוגמא, בשלב 1 זה מראה שתי שיטות להשתלת תאים סרטניים תת קופסית לתוך הכליה. יכולים להיות מושתלים תאים סרטניים לתוך החלל תת קופסית עם לבן בועה קטנה המאשרת את המיקום מקומי של תאים עם זליגה למנוע על ידי הסרה זהירה של מחט ונוזל נמלט עודף בניקוי (איור 1 ב-i). כדי למנוע דליפה, יכולים להיות מושתלים תאים פנימיים ראשון שהגיעו למקום תת קופסית (איור 1 ב-II), ושילוב עם matrigel למניעת ההפצה הראשונית של תאים סרטניים למחזור הדם. להסרה כירורגית של כליה, עיתוי מדויק תלוי בצמיחה והפוטנציאל גרורתי של הקו הסלולרי בשימוש. בפועל כריתת כליה אופטימלית כולל הליך מהיר, אך מבוקר, כירורגית כדי למזער את מצוקת עכבר והתאוששות. Tקשירת ight ומאובטחת של Vicryl לסגור שופכן, עורק הכליה וריד היא מפתח, כדי למנוע דימום (ראה תרשים 1C). יש להשתמש בצריבה, אבל רק אם פוטנציאל של דימום יתר דורש התערבות. לבסוף, מעקב של מחלת ספונטנית על ידי הערכת bioluminescent לא פולשנית מאפשר ניטור מתמשך של נגעים וצמיחת תורת הנסתר, כמו גם כימות בנקודת הסיום (ראה איור 1D). עם זאת, השימוש בתאים שכותרתו לוציפראז במודלים של גרורות ספונטניות לפעמים יכול להוביל לבחירת תאים הסרטניים משובט של גרסאות שלא יכול להביע את גן transfected, ולכן לא תמיד נראה לעין לאחר סיבובים רבים של בחירה או את צמיחת גידול לטווח ארוך. במקרה זה, ניתוח היסטולוגית רלוונטי מבחינה קלינית ניתן לבצע כדי לזהות נגעי מיקרו גרורתי או, אם לא מבחינה טכנית (של בחינה כלכלית) אפשרי, שיטת ניקוד חזותית להעריך מחלה המאקרו גרורתי חזותית יכולה לשמש כמדד שטחי של presence / היעדרות של נגעים ברקמות איברים (איורים 1D-i ו1D-II).

דוגמא איור 1.) סכמטי של ניתוחים כולל השתלה (שלב 1), כריתה / כריתת כליה ניתוחית (שלב 2), והערכה של מחלה גרורתית לאחר ניתוח (שלב 3). ב) להשתלה תת קופסית כוללים (i) דוגמא שטחי וכן (ii) הטכניקה פנימית. C) של הליך ניתוחי כריתת כליה (אני) ותמונה מייצגת של כליות נכרתה עם גידול מושתל (ii). ד ') הערכה של i מחלה גרורתית ספונטנית לאחר ניתוח באמצעות) שיטת ניקוד חזותית להעריך הפצת מחלה (תוצאות נציג מ5 קבוצות של 4 בעלי חיים), וii) נתונים bioluminescent מייד לפני ואחרי הקרבה לquantitatively להעריך נגעי מיקרו ומקרו גרורתי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

יש המחברים אין לחשוף.