מאמר שיטה

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה במבחנה יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 באוגוסט 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנזה של HIV-1 מוגדרת הן על ידי מאפיינים נגיפיים והן על ידי גורמים גנטיים של המארח. כאן אנו מתארים שיטה חזקה המאפשרת מדידות הניתנות לשחזור כדי להעריך את ההשפעה של וריאציה של רצף גן ה-gag על יכולת השכפול במבחנה של הנגיף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשפעה המגנה של אללים רבים מסוג HLA Class I על פתוגנזה של HIV-1 והתקדמות המחלה מיוחסת, בחלקה, ליכולתם להתמקד בחלקים שמורים של גנום HIV-1 שבורחים בקושי. שינויים ברצף המיוחסים ללחץ חיסוני תאי מתעוררים ברחבי הגנום במהלך ההדבקה, ואם הם נמצאים באזורים שמורים של הגנום כמו Gag, יכולים להשפיע על יכולתו של הנגיף להשתכפל במבחנה. העברה של פולימורפיזמים הקשורים ל-HLA ב-Gag לנמענים לא תואמים של HLA הייתה קשורה לירידה בעומסים נגיפיים בנקודת הגדרה. שיערנו שזה עשוי לנבוע מיכולת שכפול מופחתת של הנגיף. כאן אנו מציגים שיטה חדשה להערכת השכפול במבחנה של HIV-1 כפי שהושפע מגן ההקאה שבודד מנקודות זמן חריפות מזמביה הנגועים בתת-סוג C. שיטה זו משתמשת בשיבוט מבוסס אנזים הגבלה כדי להכניס את גן ה-gag לתוך עמוד שדרה פרו-ויראלי נפוץ של תת-סוג C HIV-1, MJ4. זה הופך אותו למתאים יותר לחקר רצפי תת-סוג C מאשר שיטות קודמות המבוססות על רקומבינציה שהעריכו את השכפול במבחנה של רצפי gag-pro שמקורם כרוני. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות למחקרים של נגיפים מתת-סוגים אחרים. יתר על כן, פרוטוקול זה מפרט שיטה חזקה וניתנת לשחזור להערכת יכולת השכפול של הנגיפים הכימריים Gag-MJ4 על קו תאי T מבוסס CEM. שיטה זו שימשה לחקר נגיפים כימריים Gag-MJ4 שמקורם ב-149 תת-סוג C של זמביה שנדבקו באופן חריף, ואפשרה זיהוי של שאריות ב-Gag המשפיעות על השכפול. חשוב מכך, יישום טכניקה זו הקל על הבנה מעמיקה יותר של האופן שבו שכפול ויראלי מגדיר פרמטרים של פתוגנזה מוקדמת של HIV-1 כגון עומס נגיפי בנקודת הגדרה וירידה אורכית של תאי CD4+ T.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קביעת שני המארח ומאפיינים נגיפיים המשפיעים על הפתוגנזה HIV-1 והתקדמות מחלה היא בעל חשיבות עליונה לעיצוב חיסון רציונלים. התגובה החיסונית התאית היא מרכיב מרכזי של התגובה החיסונית האנושית לזיהום HIV-1. לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTL) נחוצים לשליטה הראשונית של viremia החריף, ולאפשר למארח להקים מדינה יציבה (נקודת סט) עומס נגיפי 1,2. דלדול ניסיוני של תאי מפעיל אלה גורם לאובדן שליטה הנגיפית 3,4. למרות זאת, לברוח מוטציות להתעורר בתוך הגנום הנגיפי שלחתור תחת הכרת CTL של תאים נגועים בנגיף 5-9.

אללים HLA מסוימים נקשרו עם עומס נגיפי נמוך והתקדמות מחלה איטית יותר כולל B * 57, B * 27 וB * 81 10-15. חלק מהיתרון המגן שלי אללים כיתת HLA ניתן לייחס לעובדה שהם ממקדים אזורים מוגבלים מבחינה תפקודית של הגנום כגון איסור פרסוםובחר למוטציות בריחה שתקטנה את יכולתו של הנגיף לשכפל במבחנה 16-21. למרות בריחה מהמערכת החיסונית התאית מועילה לווירוס בהקשר של מעמד HLA הבחירה אני אלל, את ההשפעה של מוטציות אלה עלולות להיות השלכות ההפרש למארח על העברת ל22,23 פרט HLA-תואם. לכן, הבנת ההשפעות של מוטציות הבריחה הקשורים HLA מועברים על יכולת שכפול נגיפית תהיה חשובה כדי לקדם את ההבנה של הפתוגנזה HIV-1 המוקדמת שלנו.

בעוד הרבה הושג התקדמות לזהות ולאפיין את פגמי הכושר של מוטציות בריחה בודדות הקשורים ספציפי כיתת HLA אני אללים של 24-29, מתרחשות באופן טבעי HIV-1 מבודד שעקבות ייחודיות ומורכבות של פולימורפיזם הקשורים-HLA, סביר הנובעת מHLA לחץ חיסוני בתיווך של רקעי immunogenetic שונים 30. בapניתוח revious, Goepfert et al. הראה כי הצטברות של המוטציות הקשורות-HLA ברצפי Gag מועברים נגזרים מ88 Zambians חריפות הנגוע הייתה קשורה לירידה בעומס נגיפי נקודת סט ביום 31 ב. זה הציע שהשידור של מוטציות בריחה מזיקות, במיוחד בGag, לנמעני HLA-תואם מספק תועלת קלינית, ויכול להיות בגלל נחלש שכפול נגיפי. במבט קדימה, זה הכרחי כדי ללמוד כיצד מורכב שילובים של פולימורפיזם Gag בתוך מבודדים באופן טבעי פועל בתיאום להגדיר מאפיינים של הנגיף מועבר כגון יכולת שכפול, ואיך שכפול מוקדם עשוי בתורו משפיע על HIV-1 פרמטרים קליניים ושלב מאוחר פתוגנזה.

ברוקמן et al. הפגין קשר בין יכולת השכפול של רצפי איסור פרסום-פרו מבודדת במהלך זיהום כרוני במה ועומס נגיפי בשני C תת הסוג B ודלקות ראשון32-35. יש הגישה הניסויית שהוצגה במחקרים אלה, אם כי מתאים לבחינת יכולת שכפול במבחנה של רצפים נגזרים מאנשים נגועים כרוני, כמה אזהרות טכניות ומגבלות ההופכות את לימוד HIV-1 קיבולת replicative בתת הסוג C יחידים בחריפות נגוע קשה. שיטה זו מסתמכת על רקומבינציה של רצפים מוגברים-PCR מבוסס אוכלוסייה לprovirus B NL4-3 תת הסוג, שנגזר בחלקו מLAV, מעבדה מותאמת מניות וירוס 36. דור וירוס בוצע על ידי שיתוף transfection של קו T-cell מבוסס CEM 37 עם amplicons PCR ומתעכל delta- איסור פרסום-פרו NL4-3 DNA. שיטה זו מחייבת תוצאה של וירוס על פני תקופה של שבועות עד חודשים, שעלול להיות שהטתה את האופי של מניות הווירוס התאוששו ביחס לquasispecies הנגיפי in vivo, ולכן שינוי המדידה שיכולת שכפול במבחנה. אני בשיטה זוזה מתאים יותר ללימוד אנשים נגועים כרוני, שבו בצורה יעילה בוחר לוירוס עם קיבולת replicative הגבוהה ביותר, ושבו שיבוט גרסאות נגיפיות שונות רבות ממספר גדול של אנשים באופן כרוני הנגועים הוא עבודה די אינטנסיבי ולכן לא ריאלי. עם זאת, בתוך פרט בחריפות נגוע, יש בדרך כלל 1:59 גרסאות הנוכחיות, ובכך מבטל את הסיכון של עיקום הטבע של מניות הווירוס התאוששו, דרך לחצי בחירה במבחנה, מאפשר להערכה מדויקת יותר של במבחנה שיכולת שכפול. שנית, שיטה זו דורשת recombining רצפי איסור פרסום-Pro C תת סוג לתוך עמוד השדרה נובעת תת סוג B, ויכולה להציג את ההטיות אי התאמת עמוד השדרה לניתוח. בשל מגבלות אלה, מספר רב של רצפים חייב להיות מנותח על מנת להתגבר על כל הטיות אפשריות הציגו.

כאן אנו מתארים appro הניסיוני חלופיACH המתאים ללימוד רצפים נגזרים מאנשים C תת סוג נגוע בחריפות. אנו משתמשים באסטרטגית שיבוט מבוסס אנזים הגבלה להציג את גן איסור הפרסום נובע מנקודות זמן זיהום חריפות של אנשים נגועים תת סוג HIV-1 C לתוך עמוד השדרה proviral C תת הסוג, MJ4. השימוש בMJ4 כעמוד השדרה נפוצה בה כדי לשכפל גני איסור פרסום הוא קריטי לניתוח רצפים נגזרים תת סוג C. MJ4 נגזר מבודד עיקרי 38, וכך יהיה פחות סיכוי להציג את ההטיה בשל אי התאמה בין תת עמוד השדרה וגן איסור פרסום. בנוסף, הגישה של שימוש בשיבוט הגבלה מבוססת אנזים מאפשרת לproviral בונה להיות transfected ישירות לתוך תאי 293T, ולהתאוששות של מניות וירוס משובטים הזהה לרצף איסור הפרסום המשובט.

השיטה המובאת להלן היא שיטת תפוקה גבוהה להערכת יכולת השכפול של C תת סוג נגזרה Gag-MJ4וירוסי chimeric. Transfection לתוך תאי 293T הוא פשוט וההתאוששות של וירוס לוקחת רק שלושה ימים. במבחנה יכולת שכפול assayed על הקו זהה CEM-CCR5 מבוסס T-cell שנוצר על ידי et ברוקמן אל. 37, אבל באמצעות שינויים בפרוטוקול חשובים נחוצים לשכפול המוצלח של וירוסי chimeric תת סוג C MJ4. השימוש בקו T-תא מתאים ולא PBMCs מאפשר למספר גדול של וירוסי MJ4-chimeric C תת הסוג להיבדק עם שחזור הגבוה assay. לבסוף, באמצעות assay טרנסקריפטאז radiolabeled לכימות של וירוס בsupernatant הוא יותר חסכוני מאשר באמצעות ערכות ELISA p24 הזמינים מסחרי. זה גם נותן טווח דינמי גבוהה יותר, מה שהיה חשוב לאיתור שני הווירוסים משכפלים גרוע ומאוד בתוך אותו assay ולאיתור הבדלים דקים בשכפול בין בידודים.

לסיכום, השיטה המוצגת כאן אפשרה להמחקר המעמיק של יכולת השכפול של רצפי איסור פרסום נובעים מתת הסוג HIV-1 C בחריפות אנשים נדבק מזמביה, וכפי שנכתב, יכול גם להיות מורחב כדי ללמוד תת סוג אחר C נגוע אוכלוסיות. רמה גבוהה של שונות ביכולות שכפול בין בידודי Gag השונים נצפתה. בנוסף, הצלחנו להראות קשר סטטיסטי בין יכולת השכפול של Gag המשודר ועומס נגיפי נקודה שנקבעה, כמו גם עם CD4 + ירידה על פני תקופה של שלוש שנות 39. תוצאות כאלה מדגישות את החשיבות של לימוד מאפיינים נגיפיים איך לשדר, כמו שיכולת שכפול, אינטראקציה עם המערכת החיסונית המארח להשפיע פתוגנזה במהלך הזיהום המוקדם ותהיה נפרד לפיתוח התערבויות חיסון יעילים, כמו גם טיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הגברה של ג'ין איסור הפרסום HIV-1 ממאשרום, קפוא פלזמה

  1. לחלץ רנ"א נגיפי מ140 μl המופשר HIV-1 בפלזמה נגועה באמצעות ערכת חילוץ.
    1. כאשר אפשרי, מייד להמשיך סינתזת cDNA לאחר מיצוי RNA כרנ"א הנגיפי יצא מן ההקפאה מניב את התוצאות הטובות ביותר ההגברה. במידת האפשר, להקים תמהיל אב PCR להגברת DNA בסיבוב הראשון ולאחסן ב 4 ° C לפני מיצוי רנ"א נגיפי.
  2. Reverse-לתמלל cDNA מRNA ולהגביר מוצרי DNA-סיבוב הראשון באמצעות הפוך transcriptase וDNA פולימרז thermostable בצעד אחד RT-PCR.
    1. קח RNA מתוך -80 מקפיא C ° (אם ההקפאה הייתה צורך) והפשרה קצרה בטמפרטורת חדר ואז למקם בבלוק קר. העברה 5 μl של רנ"א על ​​צינור אחד PCR המכיל 45 μl של תערובת הורים לתת נפח סופי של μl 50. מייד למקום שנותר דגימות RNA למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר האנזים הואdded לסיבוב הראשון תמהיל PCR הראשי (לוח 1 א), aliquot 45 μl לתוך צינור אחד PCR הגברה דק דופן למספר התגובות הרצויות. הקפד להשתמש בצינורות PCR עם כובעים בודדים ולא להפשיט כובעים כדי להבטיח זיהום צולב מינימאלי בין דגימות. מניחים צינורות PCR בבלוק קר כדי להגן על תבנית האנזים וRNA הטמפרטורה רגישה RT. הערה: דוגמאות יש להפעיל בשלושה עותקים כדי לטעום כראוי quasispecies ויראלי. כמו כן, חשוב לנצל את מוצר עם אנזים DNA פולימרז איכות גבוהה על מנת למזער misincorporation הציג-PCR. נא עיין ברשימת חומרים כימיים למוצר המומלץ.
    3. לאחר תבנית RNA נוסף לכל צינורות התגובה, להעביר צינורות PCR לthermocycler להגברת שימוש בתכנית Cycler המתואר בטבלה 1 ב '. הערה: המוצר של הגברה זה ישמש בסיבוב שני מקונן PCR.
  3. בצע מקונן seמנצח בסיבוב ההגברה PCR, באמצעות 1 μl של ההגברה הסיבוב הראשונה PCR (1.2) כתבנית DNA.
    1. Aliquot 49 μl של סיבוב השני תמהיל PCR הראשי (לוח 2 א) על צינור אחד PCR דק דופן למספר התגובות הרצויות. העברת 1 μl מהסיבוב הראשון ההגברה PCR לצינור כל תגובה לתת נפח סופי של μl 50. הערה: זה ישמש DNA תבנית כלהגברה בסיבוב השני. כמו כן, חשוב לנצל DNA פולימרז עם יכולות נאמנות והגהה גבוהות מאוד על מנת למזער misincorporation הציג-PCR. נא עיין ברשימת חומרים כימיים למוצר המומלץ.
    2. העבר את הסיבוב שני לערבב PCR תגובה לthermocycler ולהפעיל תכנית המתוארת בטבלה 2 ב. הערה: לאחר השלמת התכנית, המוצרים של תגובה זו יהיה לרוץ על ג'ל agarose כדי לאשר את הייצור של מוצר.
  4. הוסף 3 μl של צבע טעינת 5x עד 5 & #181; l של 50 μl בסיבוב שני נפח התגובה ולהפעיל ב120 V על 1% agarose ג'ל-TAE מכיל כתם DNA UV-ניאון עד להקות נפתרות. דמיין 1.6 להקות kb בפנס אור כחול (ראה איור 1 א).
  5. הפעל נותר 45 μl נפח תגובה על 1% agarose ג'ל-TAE מכיל כתם DNA, ותחתוך את הלהקות המתאימות בסכין גילוח נקי.
    1. לחלץ דנ"א מפרוסת ג'ל באמצעות ערכת טיהור ג'ל, elute במי nuclease חינם, לשלב שלוש תגובות חיוביות לנפש, ולהקפיא את המוצר ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

.2 Amplicons איסור פרסום הכנה לשיבוט על ידי הקדמה של אתרי הגבלה הכרחיים

  1. הגברת חזור הארוך המסוף (LTR) / 5 חלק 'UTR של פלסמיד MJ4 (ראה טבלה 3).
  2. דמיינו מוצרי 1.3 kb PCR על הפנס, amplicons החיובית בלו, ג'ל לטהר ולהקפיא כמו בעברתאר (1.4,1.5, ראה איור 1).
  3. צור התמזגה amplicons איסור פרסום MJ4 LTR- באמצעות "אחוי-חפיפה הארכה" PCR (ראה טבלה 4).
  4. דמיין, בלו, לטהר, ולהקפיא את 3.2 amplicons kb כמו ב1.4,1.5 (ראה איור 1 ג).

3 גני איסור פרסום השיבוט Amplified לMJ4, סוג המשנה C, Clone מולקולרי זיהומיות

  1. לעכל 1.5 מיקרוגרם של פלסמיד MJ4 ו1.5 מיקרוגרם של מוצר LTR- איסור הפרסום PCR מטוהר עם endonuclease הגבלת BclI (מתילציה רגישה) ל1.5 שעות על 50 מעלות צלזיוס (ראה 5 א).
  2. הוסף 1 μl של NgoMIV לתגובת העיכול ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. להוסיף צבע טעינת 5x להגבלה לעכל תגובות וElectrophorese הנפח הכולל על 1% agarose ג'ל-TAE מכיל כתם ג'ל DNA ל1-2 שעות ב100 V. דמיין, בלו לאט, ולטהר את להקות מצויינים לשיבוט כיורדים בעברribed (ראה איור 2).
  4. הכן תגובות קשירה באמצעות הוספה מטוהרת LTR- איסור פרסום וDNA וקטור MJ4 ב3: להוסיף 1 ליחס וקטור. דגירה תגובות קשירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס (ראה טבלת 5 ב).
  5. להפוך חיידקים כימיים המוסמכים JM109 עם מוצרי קשירה ולהפיץ על צלחות אגר LB עם אמפיצילין / מ"ל ​​100 מיקרוגרם ולצמוח ב30 מעלות צלזיוס במשך 22 + שעות.
    1. להפשיר JM109 תאים המוסמכים על קרח במשך 15 דקות. תווית 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות ומקררים על קרח.
    2. Aliquot 50-100 μl של תאי JM109 מראש מצונן 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. הוספת 2.5-5 μl תגובת קשירה לJM109 תאים, מצליף צינור קל לערבב ומייד חוזר לקרח. דגירה תאים המוסמכים עם מוצר קשירה על קרח למשך 30 דקות.
    3. הלם חום 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות המכילים תאים המוסמכים JM109 ותגובת קשירה בגוש חום 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות ולחזור לקרח לפחות 3 דקות.
    4. הוסף 50 μl של תקשורת SOC על צינור אחד microcentrifuge וצלחת כל תגובת השינוי על LB-צלחות אגר טמפרטורת חדר בתוספת 100 / מ"ל ​​מיקרוגרם של אמפיצילין.
    5. העברת צלחות לC חממת 30 מעלות ולצאת ל20 שעה, או עד מושבות בבירור נוצרות.
  6. פיק מושבות מבודדות ולגדול ב 4 מ"ל של LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין ב30 מעלות צלזיוס במשך 22 + שעות.
  7. ספין למטה תרבויות ב3,200 XG במשך 15 דקות, לשפוך את המרק, ולחלץ DNA פלסמיד.
  8. כדי לאשר שיבוט נאמנות, לחתוך DNA miniprep עם NgoMIV ואנזימי הגבלת HPAI בכפול לעכל ב37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לנתח על 1% agarose ג'ל-טה (ראה טבלה 5 ג).
  9. רצף האזור להכניס LTR-איסור הפרסום של כל פלסמיד באמצעות פריימרים הבאים: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3, וGagR6 (לוח 6) כדי לאשר את זהות רצף.
  10. השווה את הרצפים המשובטים שהושגו עם der רצפי אוכלוסייהived מamplicon המטוהר הראשוני מ1.5.1. שים לב: חשוב להעריך סופו של דבר את יכולת השכפול של שני שיבוטים עצמאיים על מנת להבטיח שפנוטיפים שכפול במבחנה כולם לא בשל טעויות עמוד השדרה הציגו במהלך תהליך השיבוט.

.4 דור וtitering של-MJ4 Gag וירוסים המוסמך שכפול כימרי

  1. צור וירוס מוסמך שכפול על ידי transfecting 1.5 מיקרוגרם של DNA miniprep פלסמיד MJ4 chimeric לתאי 293T באמצעות 4: 1 יחס של Fugene HD כפי שתואר על ידי הנסיך et al 39.
  2. מניות כייל נגיף שנקטפו בתאי TZM-bl כמפורט להלן ובנסיך et al 39.
    1. תאי TZM-bl צלחת 24 שעות לפני ההדבקה בוירוס על מנת שיהיה 30-40% monolayer תא ומחוברות ביום הבא. בדרך כלל זה יכול להיות מושגת על ידי הוספת 5 x 10 4 תאים בנפח כולל של 800 μl בכל טוב בצלחת 24 גם.
    2. לאחר הוספת תאים לטובים, בעדינות להזיז את הצלחת 24 גם קדימה ואחורה, ואז מצד לצד כדי להפיץ ביעילות תאים. אף פעם לא מערבולת - זה יגרום לתאים מצטברים במרכז הצלחת.
    3. למחרת, להכין 1% FBS בDMEM; זה ישמש כדי לדלל DEAE-Dextran ולדלל מניות וירוס. מניית DEAE-Dextran הוא 10 מ"ג / מ"ל ​​או 125x, וריכוז סופי של 80 מיקרוגרם / מ"ל ​​או 1x הוא רצוי.
    4. קחו את מניות וירוס להיבדק ממקפיא -80 מעלות צלזיוס ומקום על שייקר להפשיר בטמפרטורת חדר.
    5. בעזרת פיפטה רבה, סדרנו לדלל מניות וירוס בתרבית רקמה עגולה תחתית טופל 96 גם צלחת עם מכסה. זהו פרוטוקול דילול של פי 3. ראה לוח 7 לתכנית הדילול.
    6. הסר את המדיה מ24 גם צלחות TZM-bl זורעים באמצעות aspirator ואקום כדי לוודא שלא להפריע monolayer תא. להסיר רק את התקשורת מצלחת אחד 24 גם בכל פעם, כך שתאים לעשותלא יתייבש.
    7. הוסף 150 μl של 1x DEAE-Dextran + 1% FBS בתערובת DMEM זה היטב בעזרת פיפטה 1,000 μl. אל תשתמש בפיפטה החוזרת כמו זה משבש את השכבה.
    8. הוסף 150 μl של דילול כל וירוס גם המתאים. להוסיף וירוס למרכז היטב ולערבל בעדינות כדי לפזר באופן שווה על פני וירוס monolayer התא. דגירה תאים נגועים לשעה 2 בתרבית רקמת חממה ב 37 ° C ו 5% CO 2.
    9. לאחר הדגירה שעה 2, להוסיף FBS 0.5 מ"ל 10% בDMEM זה היטב ולהחזיר צלחות לחממה ל48 שעות נוספות.
    10. לאחר 48 שעה, תאים צריכים להיות 100% ומחוברות. בגלל MJ4 הוא וירוס מוסמך שכפול, יהיה כמה מוות של תאים, אבל זה היה צפוי.
    11. הסר את המדיה מכל הטוב ולהוסיף 400 μl / גם של תיקון פתרון (ראה לוח 8 א למתכון). תקן אחד בלבד צלחת בכל פעם. הוספת תיקון פתרון באמצעות פיפטה 1,000 μl, ולתת לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    12. הסר פתרון תיקון ולשטוף 3x עם PBS עם Ca 2 + / Mg 2 +. השתמש בבקבוק להשפריץ להוסיף PBS בעדינות לצד השני של הבאר, כדי למנוע שיבוש monolayer. לאחר לשטוף השלישי, למחוק יבש צלחת על נייר סופג.
    13. הוספת 400 μl / גם של פתרון מכתים (ראה הטבלה 8B למתכון) היטב בכל הצלחת 24 גם, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. פעמים דגירה כבר מקובלות, אבל צריכה להיות כל הזמן עקבית בין ניסויי titering פעמים דגירה.
    14. לשטוף 2x עם PBS עם Ca 2 + / Mg 2 + ולהבקיע לזיהום, או להוסיף PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הניקוד מאוחר יותר. יכולות להיות כל הזמן צלחות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה ימים, כל עוד monolayer נשמר התייבשות.
    15. להבקיע לזיהום, להשתמש בטוש בלתי מחיק לחלק בארות של צלחת 24 גם לרביעים. לספור את כל התאים הכחולים בתוך שדה הראייה, באמצעות הגדלה כוללת של 200X, פעם אחת בכל אחד מארבעת הרבעים של היטב.
    16. לחשב יחידות זיהומיות לכל μl כדלקמן: [(# תאים כחולים / 4) x 67] / = IU / μl (μl וירוס הוסיף). עיין בטבלה 8C עבור נפח בμl של וירוס מתווסף גם כל. כמה בארות ממוצעת יחד; המספרים צריכים להיות דומים יחסית לטיטרציה מדויקת.

.5 הכנת תרבות מדיה והרבייה של תאי GXR25 במבחנת Assay שכפול

  1. הכן RPMI המלא (cRPMI) לריבוי של תאי GXR25. הערה: זה מאוד חשוב לתאי התרבות GXR25 לפחות 4 חודשים לפני ניסויי שכפול מתוכננים (ראה לוח 9).
  2. פיצול תאי 01:10 פעמיים בשבוע ולשמור על צפיפות תאים בין 1 x 05-02 אוקטובר x 10 6 / תאים למ"ל.

.6 בשכפול במבחנה של Gag-MJ4 מפלצות בGXR25 (CEM-CCR5-GFP) תאים

  1. היום לפני אניnfection, לפצל תאים לריכוז בין 2-3 x 10 5 תאים / מ"ל, כך שהם נמצאים בצמיחת לוגריתמים ביום של הזיהום.
  2. ביום של זיהום, להסיר מניות וירוס ממקפיא -80 מעלות צלזיוס והפשרה. חשב את הנפח של הווירוס דרוש מכל מניה המבוסס על IU / כייל μl מassay תא TZM-bl כדי להדביק 5 x 10 5 GXR25 תאים בריבוי של זיהום של 0.05, תוך שימוש בנוסחה:
    μl נפח של וירוס לזיהום (μl) = 1 / X IU x 0.05 x 500,000
    הערה: יש לנו נבחרו משרד הפנים של 0.05 כזה תוצאות בשלב צמיחת לוגריתמים לכל הווירוסים שאנחנו צריכים לבדוק. חשוב לבצע ניסויים ראשוניים על מנת לקבוע את משרד הפנים האופטימלי כדי ללכוד צמיחת לוגריתמים עבור להיבדק הווירוס.
  3. לדלל וירוס בcRPMI בהיקף של 100 μl (על מנת להשיג 0.05 משרד הפנים) ולהוסיף לתוך באר של תרבית רקמת V-תחתון טופל 96 גם צלחת. הערה: כלול שני positive שליטה (MJ4 WT נגועה) ושלילית (תאים נגועים מדומים) בכל סט של ניסויי שכפול. הגדר את הצלחת כך שכל עמודה אחרת היא ריקה כדי להגביל את הזיהום צולב בין בארות. הביקורת החיובית היא הכרחית, כפי שישמש מאוחר יותר כסטנדרט לנרמל את מדרונות השכפול, שהם מדד לקצב השכפול של משכפל ניסיוני.
  4. ספירת תאי GXR25 באמצעות דלפק תא אוטומטי. לחשב את מספר התאים הדרושים בסך הכל לכל הזיהומים (5 x 10 5 # x זיהומים). Aliquot הנפח הנדרש ל50 מ"ל צינור צנטריפוגות כדי גלולה תאי חרוטי. תמיד לחשב ליותר זיהומי 25% מהדרוש.
  5. תקשורת לשאוב בזהירות וגלולה בcRPMI בריכוז של 5 x 10 5 תאים / 100 μl.
  6. תאי פיפטה לתוך שוקת סטרילי ומערבבים היטב. בעזרת פיפטה רב ערוצית, להוסיף תאי 100 μl לבאר כל הצלחת 96 היטב המכילה את הנגיף בדילול מלא. Mix ביסודיות.
  7. הוסף 2 μl של פתרון 5 מ"ג / מ"ל ​​(100x) של polybrene היטב כל אחד ומערבבים תאים ביסודיות.
  8. דגירה על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה עם 5% CO 2 למשך 3 שעות.
  9. כדי לשטוף את התאים נגועים, צלחת V-תחתון 96 היטב צנטריפוגות כדי גלולה תאים. לאחר מכן להסיר בזהירות 150 μl של המדיום ולהחליף עם 150 μl הטרי של cRPMI מבלי להפריע גלולה התא. חזור על 2 יותר פעמים (כולל צנטריפוגה) כדי לשטוף מספיק תאים.
  10. לאחר צנטריפוגה ותוספת של 150 μl cRPMI האחרונות, resuspend התא גלולה עם פיפטה רבה ולהוסיף את תערובת כולה תא / וירוס (כ 200 μl) מכל טוב באופן עצמאי ל800 μl של cRPMI בטוב של רקמה 24 גם צלחת תרבות.
  11. צלחת מקום ב5% חממת תרבות CO רקמה 2 על 37 מעלות צלזיוס.
  12. כל יומיים, להסיר של supernatant 100 μl מפני שטח של התרבות היטב ולהעביר להיטב 96 Uצלחת וחנות -bottom קפוא ב -80 מעלות צלזיוס עד לריצת assay quantitation וירוס. הערה: הסדר זהיר של supernatants בצלחות 96 היטב יאפשר להעברה רב ערוצית פיפטה של ​​supernatants התרבות בכימות virion באמצעות assay radiolabeled טרנסקריפטאז (RT). כל צלחת צריכה להכיל דגימות מסטנדרטיות זיהום כדי לנרמל וריאציה בין צלחת בקריאת assay RT.
  13. לאחר הסרת כל דגימת 100 μl, תאי פיצול 1: 2 על ידי תאי resuspending ביסודיות והסרת מחצית מהנפח שנותר (450 μl). לשחזר את עוצמת קול מקורי (1 מ"ל) על ידי הוספת 550 μl של cRPMI הטרי היטב כל אחד.

.7 ניתוח ההפוך transcriptase (RT) בתא Supernatants התרבות

פרוטוקול מותאם מאוסטרובסקי et al 40.

  1. הגדר את מכסה המנוע בטיחות ביולוגית בBSL-3 מתקן לשימוש עם חומרים רדיואקטיביים.
    1. הנח נייר סופג בהוaspirator ד ולהחליף לaspirator מיועד לשימוש רדיואקטיבי. הערה: כל פסולת רדיואקטיבית חייבת להיות מסולקת כראוי של עם בהתאם לתקנות בטיחות.
  2. להוסיף 1-2 μl של 10 mCi / מ"ל של [α- 33 P] dTTP ו4 μl של 1 M dithiothreitol (DTT) לכל aliquot 1 מ"ל של תערובת אב RT (ראה טבלה 10 ואוסטרובסקי et al. 40).
  3. לערבב בזהירות כל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge של תמהיל RT אדון, DTT, ו[ α- 33 P] dTTP עם טפטפת 1,000 μl והעברה לשוקת סטרילי.
  4. לוותר 25 μl של RT שכותרתו לערבב היטב לתוך כל אחד מ96, גם צלחת PCR דק דופן. הערה: כלול מקום לביקורת חיובית (זיהום WT MJ4) ובקרה שלילית (זיהום מוק).
  5. הוסף 5 μl של כל supernatant לצלחת PCR המכילה תערובת מאסטר RT.
  6. לאטום צלחת PCR עם כיסוי נייר כסף דבק ודגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס בthermocycler. מטעמי בטיחות, ריןטיפים se פיפטה עם Amphyl ולהיפטר מעצות במכל קטן המכילות פסולת Amphyl, אשר מאוחר יותר להיות מסולקים בפסולת רדיואקטיבית.
  7. לאחר דגירה, לעשות חורים קטנים בעטיפת נייר הכסף באמצעות פיפטה רב ערוצית 200 μl. הערה: אם טיפים פיפטה לגעת נוזל היטב, להחליף טיפים לפני שעברתם לעמודה או השורה הבאה.
  8. מיקס דגימות 5x והעברת 5 μl של כל דגימה לנייר DE-81. אוויר יבש 10 דקות.
  9. כתמי שטפי 5x עם 1x SSC (נתרן כלורי, נתרן ציטרט), ולאחר מכן 2x עם 90% אתנול ב5 דקות לכל לשטוף. לאפשר לאוויר יבש.
    1. מניחים כל כתם במכל שטיפה נפרד, כגון תיבת אחסון כריך, להוסיף מספיק לשטוף חיץ (1x SSC או 90% EtOH) כדי לכסות את הכתם, ולנער במשך 5 דקות.
    2. יוצקים את החיץ לשטוף לתוך מיכל וחזור על פעולה נפרד. הערה: 3 שוטף הראשון נחשב רדיואקטיביים וצריך להיות מסולק כראוי. יכולות להיות מסולקים 2 שטיפות האחרונות באופן קבוע.
  10. ברגע שיבש, מכוניתefully לעטוף כתם בניילון נצמד ולחשוף לphosphoscreen בקלטת סגורה היטב לילה בטמפרטורת חדר.
  11. לנתח phosphoscreens עם phosphorimager ולכמת תמלילי רדיואקטיבי.
  12. צייר עיגול מסביב לכל אות רדיואקטיביים באמצעות תוכנת OptiQuant. גרף הערכים הדיגיטלי Light Unit (DLU) כדי ליצור עקומות שכפול.
  13. על מנת ליצור ציוני שיכולת שכפול, ערכי DLU היו יומן 10 -transformed ומדרונות חושבו באמצעות היום 2, 4, ו -6 נקודות זמן. לאחר מכן מדרונות שכפול מחולקים על ידי השיפוע של WT MJ4 בציוני שיכולת שכפול כדי ליצור. חשוב לנרמל המבוסס על ערכי MJ4 WT המתקבלים מאותה צלחת RT להפחית שונות התוך assay.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לבצע פרוטוקול זה, אשר יוצר פלסמיד proviral מסוגלים להרכיב מפלצות מתפקדים במלואה, זיהומיות Gag-MJ4 כראוי, יש לנקוט בזהירות רבה על מנת ליצור את amplicons PCR המתאימה. קביעה אם PCR יצר amplicon איסור הפרסום בגודל המתאים היא קריטית. מוצרים צריכים להיות בתוך 100 זוגות בסיסים (bp) של amplicon כ 1,700 נ"ב מתואר באיור 1 א. אורכו של קטע זה המדויק משתנה בהתאם לגן איסור הפרסום תחת מחקר. בשלב בא, חלק 5 חוזר מסוף ארוך '(LTR) של השיבוט המולקולרי MJ4 חיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשל האורך והאופי טכני של פרוטוקול זה, ישנם מספר צעדים שהם קריטיים עבור שתי הבנייה המוצלחת של פלסמידים Gag-MJ4 chimeric כמו גם לכימות של קיבולת שכפול נגיפית. למרות שאסטרטגית השיבוט מבוססת אנזים הגבלה על כניסתה של גני איסור פרסום הזר לMJ4 המפורטים בפרוטוקול זה יש יתרונות רבים על פני שיטות המבוססות רקומבינציה השתמשו בעבר, הפרוטוקול יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, אם צעדים קריטיים אינם בדיוק אחריו.

ראשית, כי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מודים לכל המתנדבים בזמביה שהשתתפו במחקר הזה ולכל הצוות בפרויקט מחקר ה-HIV של זמביה אמורי בלוסקה שאפשרו את המחקר הזה. החוקרים רוצים להודות לג'ון אלן, סמיטה צ'אבאן ומקנזי הרלסטון על הסיוע הטכני וניהול הדגימות. אנו רוצים גם להודות לד"ר מארק ברוקמן על הדיונים שלו ועל התרומה הנדיבה של תאי GXR25.

מחקר זה מומן על ידי R01 AI64060 ו-R37 AI51231 (EH) והיוזמה הבינלאומית לחיסון איידס. עבודה זו התאפשרה בחלקה הודות לתמיכתו הנדיבה של העם האמריקני באמצעות הסוכנות האמריקאית לפיתוח בינלאומי (USAID). התוכן הוא באחריות מחברי המחקר ואינו משקף בהכרח את העמדות של USAID או של ממשלת ארצות הברית. עבודה זו נתמכה גם בחלקה על ידי הליבה לווירולוגיה במרכז אמורי לחקר האיידס (מענק P30 AI050409). DC ו-JP נתמכו בחלקם על ידי Action Cycling Fellowships. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק הבסיס של המרכז הלאומי לחקר פרימטים ירקס (2P51RR000165-51). פרויקט זה מומן בחלקו גם על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר P51RR165 ונתמך כיום על ידי המשרד לתוכניות תשתיות מחקר / OD P51OD11132.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PCR ריאגנטים
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNAמותאם אישית Oligo25 ננומול, מסיר תפל סטנדרטי
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מלח סטנדרטי
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGATG 3'IDTDNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מלח סטנדרטי
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNAמותאם אישית 25ננומול, מלח סטנדרטי
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNAמותאם אישית 25ננומול, מלח סטנדרטי
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCTCTCTCTCTTAGC 3'IDTDNAמותאם אישית 25ננומול, מלח סטנדרטי
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNAמותאם אישית אוליגו25 נמול, מלח סטנדרטי
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מלח סטנדרטי
עבור 3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTCTTGGAAATG 3'IDTDNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מלח סטנדרטי
GagR6: 5' CTGTATCATCTCTCTCCTG 3'IDTDNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מלח סטנדרטי
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT3'IDT DNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מסיר כוכבים סטנדרטי
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCTCTGCTTGCCCA 3'IDTDNAמותאם אישית אוליגו25 ננומול, מסיר סטנדרטי
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
פישר מים ללא נוקלאזSH30538FSמיוצר על ידי Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 רצועות צינורות, כחול (מכסה שטוח)DaiggerEF3647BX
SuperScript III מערכת RT-PCR חד שלביתLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA פולימראזפישרF-549L
PCR נוקלאוטיד מיקסרוש4638956001
אגרוז, חוזק ג'ל גבוהפישר50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb סולם DNAפישרPRG5711מיוצר על ידי Promega
Sybr כתם ג'ל DNA בטוח, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV ג'ל ו PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
סכיני גילוח, פיפיות חד פיפיותFisher12-640מיוצר על ידי Surgical
Design Thermocycler, PTC-200MJ Research
<חזק>מיקרוביולוגיה & ריאגנטים לשיבוט
LB אגר, מילרפישרBP1425-2
פאונד מרק, לנוקספישרBP1427-2
סטרילי 100 x 15 מ"מ פוליסטירן צלחות פטריפישר08-757-12
אמפיצילין מלח נתרןסיגמא-אולדריץ'A9518-5G
פלקון 14 מ"ל פוליפרופילן צינורות תחתונים עגולים BDBiosciences
אנדונוקלאז הגבלת MIVניו אינגלנד BioLabsR0564L
אנדונוקלאז הגבלת BclIניו אינגלנד BioLabsR0160L
אנדונוקלאז הגבלת HpaIניו אינגלנד BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μ lRoche10799009001
JM109 תאים מוסמכים, >108 cfu/μ gPromegaL2001
PureYield פלסמיד miniprep מערכת PromegaA1222
Safe Imager 2.0 אור כחול TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 צנטריפוגהבקמן קולטר367160
<חזק>ריאגנטים לתרבית תאים
אמפיל מנקה/חיטויפישר22-030-394
Fugene HD, 1 מ"לVWRPAE2311מיוצר על ידי Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates, 6 בארות, שטוחFisher07-200-83מיוצר על ידי Corning Life
Costar Plates, 24 בארות, שטוחFisher07-200-84מיוצר על ידי Corning Life
צלחות Costar, 96 בארות, עגולפישר07-200-95מיוצר על ידי Corning Life
Flasks, קורנינג פילטר עליון/צוואר משומר, 75 ס"מ2Fisher10-126-37
צלוחות, פילטר קורנינג עליון/צוואר משומר, 150 ס"מ2Fisher10-126-34מיוצר על ידי Corning Life
Conical Tubes, 50 מ"ל, כובע כחולפישר14-432-22מיוצר על ידי BD Biosciences
צינורות חרוטיים, 15 מ"ל, פקק כחולפישר14-959-70Cמיוצר על ידי BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIמיוצר על ידי Mediatech
RPMI, 500 מ"לLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 מ"לLife Technologies/Invitrogen11965-118
פניצילין/ סטרפטומיצין/גלוטמין, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS עם מגנזיום וסידן, 500 מ"לLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS ללא מגנזיום וסידןLife Technologies/Invitrogen20012-050
צינורות Sarstedt, צבעים שוניםSarstedt72.694.996
מגשי מאגר עבור רב ערוצי, 55 מ"לפישר13-681-501
DEAE-DextranפישרNC9691007
קורנינג 96 היטב שקוף V תרבית רקמות תחתונה מטופל מיקרופלייטפישר07-200-96מיוצר על ידי Corning Life
HEPES, 1 M BufferSolution Life Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, מוגדר, 500 מ"לFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941מיוצר על ידי Promega
Glutaraldehyde, דרגה II, 25% ב-H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M תמיסת מגנזיום כלורידSigma-AldrichM1028-100ML
תמיסת פורמלדהיד, לביולוגיה מולקולרית, 36.5%Sigma-AldrichF8775-500ML
אשלגן hexacyanoferrate (II) trihydrateSigma-AldrichP9387-100G
אשלגן hexacyanoferrate (III)Sigma-AldrichP8131-100G
צנטריפוגה Allegra X15-R בקמןקולטר392932
TC10 מונה תאים אוטומטיBio-Rad1450001
VistaVision מיקרוסקופ הפוךVWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025יש להתאים ל-pH 7.8 עם KOH
2 M אשלגן כלורי (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust עד 1 M תמיסה
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
חומצה פוליאדנילית (Poly rA) מלח אשלגן מידלנד ריאגנט ושות'P-3001
Oligo d(T) פריימרLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, מסך זרחן ברזולוציה גבוהה,פרקין-אלמר7001485
Corning Costar Thermowell 96 בארות צלחת דגם (M) פוליקרבונטפישר07-200-245מיוצר על ידי Corning Life
סרט איטום אלומיניום קורנינג 96 בארות,פישר07-200-684מיוצר על ידי Corning Life
DE-81 נייר חילופי אניוניםWhatman3658-915
טריסודיום ציטראט דיהידראטסיגמא-אולדריץ'S1804-1KG
נתרן כלוריפישרS671-3
קלטת אוטורדיוגרפיהפישרFB-CA-810
מסך פוספור לאחסון ציקלוןPackard
352059<td colspan="4"><ריאגנטים לבדיקת כימות טרנסקריפטאז >הפוך קטן לא סטרילי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HIV 1 Replication CapacityRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

מאמרים קשורים