גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

אחד האתגרים המתמשכים בהנדסת רקמות עצבית הוא יצירת צינור עצבי (NC) המחקה את המטריצה ​​סלולרית נוספת, שבו עצבים לגדול באופן טבעי. מחקרים הראו כי תאים מגיבים למספר גורמים בסביבה שלהם, כולל מכאני, טופוגרפי, דבק ואותות כימיים ^1-3. אחד האתגרים העיקריים בתחום זה הוא קביעת השילוב המתאים של אותות ובודת מערכת שיכול לשמור על רמזים לתקופה ממושכת כדי לתמוך בצמיחת תא ^4. נוירונים היקפיים ידועים מעדיפים מצע רך, יופנה על ידי סיבים מיושרים, ומגיב לגורם גדילה העצבית (NGF) ^5-7. NCS שיכול לספק רמזים כימיים לשבועות הוכח לספק התאוששות תפקודית משופרת קרוב יותר לזה של allografts, תקן הזהב הנוכחי לתיקון עצב ^8,9.

שונות חומרים ושיטות ייצור יכול לשמש לייצור מכאני וטופוגרפיאל מקלות ^10-13. רמזים מכאניים הם גלום בחומר שנבחר, מה שהופך את הבחירה של החומר המתאים ליישום הקריטי ^1,13. שיטות ייצור כדי לשלוט רמזים טופוגרפיים כוללים הפרדה פאזות, הרכבה עצמית וelectrospinning ^1,13. גם עבור יישומי microscale, מיקרופלואידיקה, photopatterning, תחריט, מדיח מלח, או קצף גז יכול לשמש ^14-17. Electrospinning התפתח כדרך הפופולרית ביותר למהנדס מצעים סיביים לתרבית רקמה בשל גמישות וקלות הייצור ^13,18-23. nanofibers electrospun מיוצר על ידי יישום מתח גבוה לפתרון פולימר גורם לו להדוף את עצמו ולמתוח על פני פער קצר לפרוק ^24. פיגום מיושר ניתן ליצור על ידי איסוף הסיבים על mandrel מסתובבת מקורקע ופיגומים הבלתי מזדהים נאספים על צלחת נייחת ^25. איתות הידבקות יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי שנינות פיגום הסיבייםפיברונקטין h או להטות פפטיד הידבקות, כגון RGD, לHA לפני electrospinning ^26.

אותות כימיים, כגון גורמי גדילה, הם הכי קשים לשמור לאורך תקופות ממושכות, כי הם זקוקים למקור לשחרור מבוקר. מערכות רבות כבר ניסינו להוסיף שחרור מבוקר לרשתות סיבי electrospun עם רמות שונות של הצלחה. שיטות אלה כוללות electrospinning תערובת, electrospinning תחליב, electrospinning פגז הליבה והצמיד חלבון ^27. בנוסף, electrospinning נעשה באופן מסורתי בממס נדיף, אשר יכול לפגוע בכדאיות של החלבון ^28, לכן שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבון יש לקחת בחשבון.

גישה זו מציינת במפורש בשילוב אותות מכאניים, טופוגרפיים, כימי ודבק כדי ליצור פיגום מתכונן לצמיחת עצבים היקפית. מכניקת פיגום נשלטת דווקא על ידי סינתזהmethacrylated חומצה היאלורונית (HA). אתרי methacrylation משמשים לצרף crosslinkers תגובתי תמונה. חומר crosslinked הוא כבר לא מסיסים במים ומתפרק באופן בלעדי על ידי אנזימים ^29. הסכום של crosslinking משנה את קצב הפירוק, מכניקה ומאפיינים פיזיים אחרים של החומר. באמצעות HA עם 30 methacrylation%, שבו יש מודול מתיחה של ~ 500 אבא, יוצר מצע רך שקרוב למכניקת הילידים של רקמה עצבית, והוא העדיף בדרך כלל על ידי נוירונים ^26,29. Electrospinning על mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים לאות טופוגרפית. באמצעות electrospinning יחד עם microspheres מספק אותות כימיים בתוך הפיגום לאורך תקופות ממושכות. כדי לתמוך בmicrospheres צמיחת neurite מכיל NGF המשמשים ליצירת האות הכימית. שלא כמו רוב חומרי electrospun HA הוא מסיס במים ולכן NGF אינו נתקל ממסים קשים במהלך ייצור. כדי להוסיף אות דבק, SCAffold מצופה פיברונקטין. המערכת הושלמה מכילה את כל ארבעת סוגים של אותות שתוארו לעיל: סיבים רכים (מכאניים) מיושרים (טופוגרפיים) עם NGF שחרור microspheres (כימי) מצופה בפיברונקטין (דבק). ייצור ובדיקה של מערכת זו מתוארת בפרוטוקול זה.

התהליך מתחיל בייצור של microspheres עם זוגי אמולסיה מים-ב- שמן מים. התחליב הוא התייצב עם חומרים פעילי שטח, פוליוויניל אלכוהול (PVA). שלב המים הפנימי מכיל את החלבון. כפי שהוא הוסיף לשלב שמן, המכילים את חומר מעטפת PLGA מומס בdichloromethane (DCM), פעילי השטח יוצר מחסום בין שלבי הגנה על החלבון מDCM. אמולסיה זו היא יותר מאשר מפוזרת בשלב מים אחר המכיל PVA כדי ליצור את המשטח החיצוני של microspheres. התחליב היציב הוא עורר לאפשר DCM להתאדות. לאחר השטיפה וlyophilizing אתה נשאר עם המשך microspheres היבשaining החלבון.

לאחר microspheres הושלם הם מוכנים להיות electrospun לפיגומים. ראשית, עליך להכין את פתרון electrospinning. הצמיגות של הפתרון היא קריטית להיווצרות סיבים נכונה. פתרונות של HA הטהור אינם עומדים בדרישה זו; PEO נוסף כפולימר מנשא כדי לאפשר electrospinning. Microspheres מתווספים לפתרון וelectrospun וכתוצאה מפיגום סיבי עם microspheres מופץ ברחבי.

ברגע שהייצור הוא מלא, החלבון צריך להיבדק כדי לוודא את כדאיותה. כדי לעשות זאת, ניתן להשתמש בו תא ראשוני המגיב לNGF. פרוטוקול זה משתמש הגבי שורש הגרעינים (DRG) מעוברי עופות ישנים 8-10 יום. חבילות התא הם זורעים על גבי פיגומים המכילים microspheres מלא NGF או אלה כי הם ריקים. אם NGF הוא עדיין בת קיימא אתה צריך לראות צמיחת neurite משופרת על הפיגומים המכילים NGF. אם NGF הוא כבר לא בת קיימא זה יהיהלא לקדם neurites להרחיב ואמורה להופיע דומה לשליטה.

ההליך המדויק שתואר במסמך זה מתמקד בתמיכה עצבית, לעומת זאת, עם שינויים פשוטים לחומר, שיטת electrospinning, וחלבוני המערכת יכולה להיות מותאמת לסוגים שונים של תאים ורקמות.

.1 מים / שמן / מים זוגי אמולסיה Microsphere ייצור

1. ראשית להכין 2% ו0.5% w / v פתרונות של אלכוהול פוליוויניל (PVA) במים ללא יונים. מערבבים את הפתרונות על 50 מעלות צלזיוס עד ברור, זה עלול לקחת כמה שעות. הכן פתרון של 2% v / v איזופרופיל אלכוהול במים ללא יונים.
2. הכן תמיסה מימית של חלבון הידרופילי רצוי. הטבלה שלהלן מספקת ניסוחים ירושלים.

טבלת 1:. פתרונות חלבון דוגמא פתרונות החלבון הבאים כבר במארז בהצלחה וelectrospun שימוש בפרוטוקול זה. ניתן להשתמש בפתרוני חלבון הידרופילי אחרים לפי צורך.

3. הנח 40 מ"ל של פתרון PVA 0.5% לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ומניח בצד.
4. בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל לפזר 300 מ"ג של 65:35פולי (חומצה לקטית גליקולית שיתוף) (PLGA) ב 3 מ"ל של dichloromethane. מיקסר מערבולת ניתן להשתמש כדי להאיץ את פירוק PLGA.
5. לשלב 200 μl של פתרון חלבון ו4 μl של 2% פתרון PVA. יוצקים את תערובת החלבונים לתוך תמיסת PLGA (צעד 1.4). הפתרונות יישארו בעיקר נפרדים.
6. מניחים את הצינור לתוך כוס של מי קרח. באמצעות sonicator שרביט ב ~ 10 ווטס (RMS), להתסיס את הפתרון לכמה שניות (5-10) ועד תחליב לבן וקרם אחיד נוצר.
7. יוצקים את התחליב לתוך צינור 50 מ"ל מכיל 0.5% PVA (שלב 1.3). מערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 20 שניות. הפתרון יהיה לפתח עכירות.
8. העבר את התחליב לכוס 200 מ"ל ומניחים על צלחת ומערבבים ב350 סל"ד למשך 2 דקות. הוסף 50 מ"ל של 2% באלכוהול רפואי לכוס בצלחת ומערבבים. אפשר התערובת להמשיך ערבוב מינימאלי של שעה 1 כדי לאפשר DCM להתאדות וPLGA להקשיח.
9. ההעברה tהוא microsphere פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה.
10. צנטריפוגה ב425 XG במשך 3 דקות. Microspheres יאסוף בחלק התחתון של הצינור ומופיע לבן. מוציא בזהירות את supernatant מהצינור, מעל microspheres, ולאחסן בבקבוק 500 מ"ל.
11. יש לשטוף את microspheres עם מים ללא יונים על ידי מילוי הצינור שלושה רבעים מלאים וטלטלת אותה כדי להפיץ את microspheres בנוזל.
12. חזור על שלבים 1.10 & 1.11 ארבעה פעמים.
13. בעקבות השטיפה הסופית, להסיר את supernatant שוב ומניחים בבקבוק 500 מ"ל עם דוגמאות האחרות. להקפיא את microspheres שנאסף בצינור צנטריפוגות, אז Lyophilize לפחות 24 שעות.
14. דמיין את microspheres תחת מיקרוסקופ אור או עם מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. Microspheres לא גדול יותר 60 מיקרומטר הוא לelectrospinning היעיל. אם microspheres הם גדול מדי, פעמים sonicating או vortexing יותר עשויות להידרש בשלב 1.6 או 1.7.
<li> חנות microspheres המיובש במקפיא -20 ° C.
15. אופציונאלי: השתמש assay חלבון, לפי הוראות יצרן, כדי לבדוק את כמות החלבון בבקבוק 500 מ"ל מצעד 1.10 ^30. זה משמש לחישוב אחוזים של חלבון במארז בmicrospheres, על ידי הפחתת הכמות בפתרון ממה שהיה בשימוש בתהליך הייצור.

הערה: כדי להמחיש את מיקום החלבון בmicrosphere להוסיף Rhodamine 2 מיקרוגרם / מ"ל לפתרון PLGA ^{31 ובלתמצת} חלבון מצומדות FITC איור 1 מציג דוגמא..

.2 Electrospinning עם מיקרוסכמות

1. לפני הכנת פתרון electrospinning, ליצור פתרון 0.5% w / v של photoinitiator, במים ללא יונים על ידי ההמסה על 37 מעלות צלזיוס. תהליך זה יכול להימשך מספר שעות.
2. צור 2% w / v methacrylated חומצה היאלורונית (מהא) (ראה Burdick et al. לסינתזה) ^29, 3%w / v 900 פולי KD (אתילן אוקסיד) (PEO) ו0.05% w / פתרון יוזם התמונה v במים ללא יונים.
   1. לחשב את הכמות הנכונה של מהא וPEO לעצמה הרצויה. לדוגמא, 10 מ"ל של electrospinning פתרון דורש 200 מ"ג של מהא ו300 מ"ג של PEO.
   2. ממיסים את PEO במים ללא יונים ב90% מהנפח הסופי הרצוי (9 מ"ל לדוגמא זו). זה עלול לקחת כמה שעות, צלחת מחוממת ומערבבים או אמבט מים ב 37 C ° ניתן להשתמש כדי להאיץ את התהליך.
   3. הבא להוסיף מהא ולהשתמש במיקסר מערבולת לעורר הפתרון עד בהיר. זה ייקח רק כמה דקות.
   4. לבסוף להוסיף את פתרון יוזם תמונה 0.5% למלא את שאר 10% הנפח (מ"ל 1 לדוגמא זו).
3. הוספת microspheres בריכוז הרצוי עד 400 מ"ג / מ"ל. מערבבים את הפתרון על מיקסר מערבולת עד microspheres מפוזר באופן שווה בפתרון.
4. מעבירים את הפתרון למזרק ולצרף bl 18 מד 6 אינץמחט קצה UNT.
5. הנח את המזרק במשאבת מזרק ולהגדיר אותו לוותר ב1.2 מ"ל / שעה.
6. קלטת שכבה של נייר אלומיניום על צלחת האוסף או mandrel. זה מאפשר לעד קל נקי ואחסון של הפיגום המוגמר. Mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים. צלחת שטוחה או mandrel הנייח תגרום לסיבים מסודרים באופן אקראי.
7. חבר את חוט הקרקע מכוח מקור מתח גבוה למנגנון הגבייה. חבר את התקע החיובי למחט.
8. התאם את פני השטח משאבת מזרק וגבייה, כך שיש 15 סנטימטר בין קצה המחט ומשטח אוסף.
9. התחל שאיבת הפולימר, כאשר הפתרון נראה לעין בסוף המזרק, להפעיל את מקור המתח ולהגדיר את המתח ל24 ק זהירות:. ברגע שהמתח מופעל לא לגעת בשום חלק מתכתי של המערכת. תשלום יכול גם לקפוץ למרחקים קצרים מחלקים חשמליים לעור.
10. הפעל את הפתרון עד דעובי פיגום esired מושגת. כשיושלם לכבות מקור מתח ומשאבת מזרק.
11. הסר רדיד עם פיגום מצורף. פיגומים שהושלמו מכילים חלבון מאוחסנים ב-20 ° C מקפיא.

.3 חלבון את הפעילות הביולוגית של הבדיקה

1. הכן תקשורת תרבית תאים. הוסף 10% v / v בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין / v v, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין V / V לבינוני של הנשר השתנה Dulbecco.
2. coverslips זכוכית בחר שמתאים לחלוטין לצלחת גם.
3. השתמש 3 methacrylate propyl (Trimethoxysilyl) לטיפול בcoverslips כפי שתואר על ידי היצרן. Methacrylation משפר דבקות פיגום לcoverslips.
4. צרף coverslips methacrylated לאזור האוסף של electrospinner עם קלטת דו צדדית נשלפת לפני electrospinning. ספינינג על coverslips מקל טיפול וצפייה.
5. Electrospin לעובי רצוי כפי שתואר לעיל.
6. חרה electrospinning להסיר בזהירות coverslips מmandrel. מניחים את הפיגום coverslips המצופה לתוך תא חנקן ברור ולהבטיח כי כל החמצן מטוהר.
7. מניחים את החדר והפיגום תחת ² ננומטר 365 אור 10 mW / cm במשך 15 דקות. לאחר crosslinking מקום לצלחת גם בגודל המתאים. ודא שצד הפיגום פונה כלפי מעלה.
8. פיגומי מקום מתחת לפנס קוטל חיידקים ל30 דקות לעקר. אם פיברונקטין הרצוי או חלבון אחר משמש כציפוי כדי לשפר את הידבקות תא. עקוב אחר ההוראות של היצרן לפיגומי מעיל.
9. קציר הגבי שורש הגרעינים (DRG) כפי שתוארו בעבר על ידי הולנבק ^32. DRG אחד יהיה צורך לכל coverslip פיגום מכוסה נבדק.
10. הנח 100-200 μl של תקשורת על כל פיגום בצלחת גם. בזהירות להניח DRG אחד על כל פיגום בטיפת התקשורת. לפיגום עבה ייתכן שתהיה צורך יותר בתקשורת; DRG צריך להיות שקוע באופן מלא ולא floaטינג.
11. דגירה הפיגום וDRG על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לתא לדבוק בפיגום.
12. מלא את התקשורת לרמה המתאימה להיטב ומניח בחזרה לתוך החממה. המשך דוגרים במשך 4-6 ימים.
13. לאחר תקופת הדגירה להסיר בזהירות את התקשורת מכל טוב ולשטוף בעדינות פעם עם PBS. תקן תאים ל30 דקות באמצעות 4% w / paraformaldehyde v.
14. תאי כתם באמצעות כתם נוגדן לneurofilament. זה יאפשר הדמיה של התוצאה neurite לכימות. גם DAPI יכול לשמש לצפייה בגרעינים של התאים. פרוטוקול דוגמא מכתים תואר על ידי Sundararaghavan ועמיתים ^14.
15. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    1. מניחים צלחת גם על הבמה של מיקרוסקופ.
    2. אתר את מסת התאים באמצעות הגדרות מסננת ועירור לDAPI.
    3. ברגע שהתא הוא לעבור את המסנן לFITC לדמיין neurites המורחבת. Uלשיר פונקצית התפר במיקרוסקופ לאסוף ולשלב תמונות רבות ככל נחוץ כדי לראות את המבנה כולו. חזור על פעולה עבור DAPI, FITC ושדה בהיר.

Microspheres 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר עם אנקפסולציה חלבון מעל 85% הופקו באופן עקבי וelectrospun לפיגומים. גודל נקבע על ידי הדמיה דגימות של microspheres משלוש מנות ייצור נפרדות. התמונות שבו נתפסו על מיקרוסקופ אופטי ואורכים שבו נמדד באמצעות תוכנת מעבדה מסחרית. איור 1 מציגה היסטוגרמה של התפלגות הגודל. שיעור Encapsulation נבדק גם משלוש מנות microsphere נפרדות, על ידי כימותי החלבון שנמלט במהלך תהליך הייצור.

איור 2 מראה microspheres נציג עם Rhodamine (2 מיקרוגרם / מ"ל) ב-FITC אלבומין בסרום פגז ושור PLGA (BSA) כמוס בתוך. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפגז ניתן לראות בבירור (אדום) עם החלבון מרוכז על הפנים (הירוק).

כדי להעריך אנקפסולציה, microsphereים היה מלא בBSA ונבדק לשחרור חלבון עם assay חלבון ברדפורד. PLGA מתפרק על ידי הידרוליזה של אג"ח אסתר, יצירת פערים גדולים יותר לבריחה חלבון. Microspheres להמשיך שחרור במשך 60 ימים (איור 3). השחרור מתחיל בפרץ ראשוני ולאחר מכן ממשיך כmicrospheres לשבור.

לאחר electrospinning microspheres ניתן לראות בכל רחבי המבנה הסיבי 3D. איור 4 מראה תמונת SEM של הפיגום השלם שבו ניתן לראות תחומים במספר שכבות (המסומן בחצים). הפצה של microspheres בפיגומים נמדדה להיות 15.3 ± 3.6 תחומים / 2 מ"מ. הפיגום מחזיק microspheres במקום מניעת הגירה ממקום היעד. כmicrospheres לשבור הם משחררים NGF לתוך הפיגום לעודד 33,34 צמיחת neurite. זה יוצר משלוח מתמשך של חלבון לאורך כל הפיגום כדי לתמוך בצמיחה של תאים ותאים לעודד לחדור לפיגום.

לבסוף, הגבי שורש הגרעינים (DRG) שמשו כדי לבדוק את הכדאיות של NGF בmicrospheres, בתוך הפיגום. איור 5 מראה DRG זורעים על פיגום המכיל microspheres עמוס NGF ליד אחת microspheres המכיל ללא חלבון בהם. יש הרחבות יותר neurite גלויים המשתרעות מDRG על פיגום NGF, המצביעות על כך NGF נשאר קיימא ועידוד צמיחה.

איור 1 התפלגות גודל Microsphere. מיקרוסכמות מיוצרת על ידי פרוטוקול זה הם 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר. הגרף מראה היסטוגרמה של קוטר microsphere ב5 מיקרומטר פחים.

2highres.jpg "/>
איור 2 תמונה של פלורסנט מיקרוסכמות. 2 מיקרוגרם / מ"ל Rhodamine נכללה בפתרון PLGA לדמיין את קליפת microsphere (אדום) וBSA-FITC נעטף לדמיין את החלבון (ירוק). חלבון באופן ברור ניתן לראות בתוך המעגל. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 חלבון שחרור עקום. שחרור BSA מmicrospheres מעל 60 ימים נמדדו באמצעות assay חלבון ברדפורד. הפרץ הראשוני הוא כנראה עקב BSA שצורף למשטח החיצוני. כPLGA מתפרק, החלבון משתחרר לאורך זמן.

/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
איור 4 פיגום המכיל מיקרוסכמות. תהליך electrospinning מאפשר microspheres להיות משולב בכל העומק של הפיגום. חצים () מציינים את המיקום של microspheres. בר = 500 תמונה מיקרומטר. הגדלה גבוהה (B) בקנה מידה של microsphere אחד עם nanofibers מהפיגום מעליו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

.5 תאים ראשוניים איור NGF את הפעילות הביולוגית של מבחן. הגבי שורש הגרעינים נבצרו מביצי אפרוח בן 8 ימים וזורעים על פיגומים עם microspheres מולא NGF (א) או microspheres הריק (B). DRGsהיו מוכתמים בנוגדן neurofilament, נוגדנים משני FITC וDAPI לדמיין את גרעין התא. תמונות מראות מוגברות תולדת neurite בנוכחות microspheres NGF הטעון כפי שצוינה על ידי neurites FITC הצבעונית (ירוקה). זה מראה שפורסם NGF הוא בת קיימא ויכול לקדם את הצמיחה. תמונות צולמו עם מיקרוסקופ confocal. סרגל = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.