שני פוטונים In vivo הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

Summary

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

Abstract

בקליפת המוח של היונקים, תאי עצב יוצרים רשתות מאוד מסובכות ולהחליף מידע בסינפסות. שינויים בחוזק סינפטי, כמו גם תוספת / הסרה של סינפסות, מתרחשים באופן חוויה תלויה, המספקים את היסוד המבני של פלסטיות עצבית. כרכיבי postsynaptic של סינפסות המעוררות ביותר בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים נחשבים פרוקסי טוב של סינפסות. יתרונות לוקחים גנטיקה עכבר וטכניקות תיוג פלורסנט, נוירונים בודדים והמבנים הסינפטי שלהם יכולים להיות מתויגים במוח שלם. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה transcranial באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים לעקוב קוצים שכותרתו fluorescently postsynaptic הדנדריטים לאורך זמן in vivo. פרוטוקול זה משתמש בהכנה דלילה, גולגולת, אשר משומרת על הגולגולת שלמה ותמנע תופעות דלקתיות הנגרמות על ידי חשיפה של קרומי המוח וקליפת המוח. לכן, ניתן לרכוש תמונות מייד לאחר surgery מתבצע. הליך הניסוי ניתן לבצע שוב ושוב על פני מרווחי זמן שונים, החל משעות לשנים. היישום של הכנה זו גם ניתן להרחיב כדי לחקור אזורים שונים בקליפת המוח ושכבות, כמו גם סוגי תאים אחרים, בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

היונקים הקליפה משתתפת בתפקודי מוח רבים, משליטת תפיסה והתנועה חושית לעיבוד מידע מופשט וקוגניציה. פונקציות שונות בקליפת המוח לבנות על מעגלים עצביים שונים, אשר מורכבים סוגים שונים של נוירונים תקשורת והחלפת מידע בסינפסות בודדות של. המבנה והתפקוד של סינפסות באופן עקבי להיות שונה בתגובה לחוויות ופתולוגיות. במוח הבוגר, פלסטיות הסינפטית לובשת צורה של שני שינויי כוח ובנוסף / הסרה של סינפסות, ממלאת תפקידים חשובים ביצירת ותחזוקה של מעגלים עצביים פונקציונליים. קוצים הדנדריטים הם רכיבי postsynaptic של רוב סינפסות מעוררות במוח של היונקים. התחלופה המתמדת ושינויים מורפולוגיים של קוצים הם האמינו לשמש אינדיקטור טוב של שינויים בקשרים סינפטיים

Protocol

אישור צריך להיות ממוסדים הביתה לפני תחילתו של הניתוח ומחקר הדמיה. ניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות מאוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז מוסדי הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. ניתוח

1. החיטוי כל מכשירי הניתוח ולעקר את סביבת העבודה עם אלכוהול 70% ביסודיות לפני הניתוח.
2. להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal הזרקה (IP) של פתרון KX הרדמה (200 מ"ג / קטמין קילוגרם ו20 מ"ג / קילוגרם xylazine) בהתאם למשקל גופו של עכ....

Results

בעכברי שורת YFP-H ^25, חלבון פלואורסצנטי צהוב מבטא בקבוצת משנה של נוירונים פירמידליים בשכבת V, אשר פרויקט דנדריטים קודקודם לשכבות השטחיות בקליפת המוח. דרך ההכנה דלילה, הגולגולת, מגזרים הדנדריטים שכותרתו fluorescently יכולים להיות צילמו שוב ושוב מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים על מרווחי הדמיה שונים, הנעים בין שעות לחודשים. כאן אנו מראים דוגמא להדמיה של אותו דנדריטים מעל 8 ימים בקליפת המוח המוטורי של עכבר ישן 1 בחודש, שבו עמוד השדרה פרט, כמו גם filopodia ניתן דמיינו לאורך דנדר.......

Discussion

כדי להשיג הכנה דלילה, גולגולת מוצלחת, כמה צעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. 1) העובי של הגולגולת. יש עצם גולגולת מבנה כריך, עם שתי שכבות של עצם קומפקטי בצפיפות גבוהה ושכבה אמצעית של עצם ספוגי בצפיפות נמוכה. בעוד תרגיל מיקרו במהירות גבוהה הוא מתאים להסרת השכבות החיצוניות של עצם קומפקטי ועצם ספוגי, להב microsurgical הוא אידיאלי לדילול השכבה הפנימית של עצם קומפקטי. כעובי וקשיחות של עליות הגולגולת במהלך פיתוח, הדמיה של עכברים בוגרים דורשת עצם יותר שיש להסירו כדי להשיג תמונות באיכות טובה........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
קטמין	ביונישה פארמה	67457-034-10	מעורבב עם קסילזין להרדמה
קסילזין	לויד	139-236	מעורבב עם קטמין להרדמה
מי מלח	הוספירה	0409-7983-09	0.9% NaCl להזרקה והדמיה
סכיני גילוח	מיקרוסקופ אלקטרונים	72000	סכיני גילוח נירוסטה כפולים
רפידות אלכוהול	פישר סיינטיפיק	06-669-62	רפידות הכנה לאלכוהול סטריליות
משחת עיניים	הנרי שיין	102-9470	משחת עיניים פטרולאטום חומר סיכה עיני סטרילי
מקדחה מיקרו במהירות גבוהה	Fine Science	Tools 18000-17	מקדחת המיקרו המהירה מתאימה לדילול השכבה החיצונית של עצם קומפקטית ומיקוד לשטח קטן
קוצי	פלדה מיקרו מקדחהFine Science Tools	19007-14	בקוטר 1.4 מ"מ
	Surgistar	6961	הלהב המיקרוכירורגי מתאים לדילול השכבה הפנימית של עצם קומפקטית ושכבה אמצעית של עצם ספוגית
דבק ציאנואקרילט Fisher	Scientific	NC9062131	תקן את לוחית הראש על הגולגולת
תפר	Havard מכשיר	510461	תפר משי סטרילי שאינו סופג, 6-0 מונופילמנט
חיתוך מיקרוסקופ	אולימפוס		SZ61
מצלמת CCD	אינסוף
מיקרוסקופ דו-פוטוני	טכנולוגיות ערבה Ultima		IV
10X אובייקטיבי	אולימפוס		NA 0.30, אוויר
60X אובייקטיבי	אולימפוס		NA 1.1, IR חדיר, טבילה במים
לייזר Ti-sapphire	ספקטרה-פיזיקה		מאי טאי HP