אנו מתארים בדיקת פקק מטריג'ל כדי להמחיש את הפוטנציאל האנגיוגני של מאגר של גורמים המופרשים על ידי תאים סרטניים באמצעות שתי שיטות הדמיה משלימות, אולטרסאונד ואנדומיקרוסקופיה. המטריגל, ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאית (ECM), משמש להחדרת גורמים אנגיוגניים למארח (עכבר) המופרשים למדיה המותנית (C.M).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Assay תקע matrigel תת-עורי בעכברים הוא שיטת הבחירה להערכת in vivo של גורמים פרו ואנטי-angiogenic. בשיטה זו, גורמים רצויים מוכנסים ג'ל ECM-לחקות קר-הנוזלי ש, לאחר הזרקה תת עורית, מתמצק ליצירת סביבה מחקה את הסביבה בסרטן. מטריצה זו מאפשרת החדירה של תאי מארח, כגון תאי אנדותל, ולכן, ההיווצרות של כלי דם.
במסמך זה אנו מציעים בדיקה חדשה ששונתה תקע matrigel, אשר יכול להיות מנוצלת כדי להמחיש את פוטנציאל angiogenic של בריכה של גורמים המופרשים על ידי תאי סרטן, בניגוד לגורם ספציפי (למשל, bFGF וVEGF) או סוכן. התקע המכיל ג'ל ECM-לחקות מנוצל כדי להציג את המארח (כלומר, עכבר) עם בריכה של גורמים המופרשים לCM של תאי גליובלסטומה מניב גידול בצמיחה מהירה. שתארנו השוואה מקיפה של פוטנציאל angiogenic של עברגליובלסטומה U-87 MG אדם והשיבוט הנגזר הרדום שלה, במודל מערכת זו, המציגה אנגיוגנזה המושרית בU-87 התאים MG ההורים. CM הוא הוכן על ידי סינון תקשורת שנאספו מצלחות תרבית רקמה ומחוברות של שני שורות תאים הבאים דגירה 48 שעות. מכאן, שהוא מכיל גורמים היחידים המופרשים על ידי התאים, ללא התאים עצמם. שתוארה כאן הוא השילוב של שתי שיטות הדמיה, microbubbles הדמיה אולטרסאונד חומר ניגוד וendomicroscopy fibered-confocal intravital, לאפיון מדויק, בזמן אמת של המידה, המורפולוגיה ופונקציונליות של כלי דם חדש שיוקמו בתוך התקעים.
מבוא
Assay אנגיוגנזה תקע matrigel תואר לראשונה על ידי Kibbey et al. בשנת 1992, שבו הוא משמש להערכת גירוי אנגיוגנזה ידי SIKVAV פפטיד (Ser-איל-ליס-Val-עלא-Val) 1. בניגוד למבחני אנגיוגנזה אחרים in vivo, כמו אנגיוגנזה קרנית העכבר או מבחני קרום chorioallantoic חומוס, assay זה הוא קל יחסית לביצוע 2. ג'ל ECM-לחקות המוזרק עלול להכיל תאים, פרו-angiogenic או תרכובות ו / או גורמים אנטי-angiogenic. כאשר אנו מעריכים את הפעילות של תרכובת אנטי angiogenic, התקע בדרך כלל מכיל תערובת של גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF), והחומר אנטי-angiogenic יכול להינתן ישירות לתקע או מערכתי <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל נהלי בעלי החיים אושרו ובוצעו בעמידה בתקנים של אוניברסיטת תל אביב לרפואה ע"ש סאקלר מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).
1. הכנת Media אוויר
- זרע 2 x 10 6 U-87 תאי MG בצלחת תרבות 10 סנטימטרים בנפח של 8 מיליליטר הבינוני של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו 1% פתרון הפניצילין / סטרפטומיצין / nystatin.
- דגירה תאים ב 37 ° C; 5% CO 2 עד להשגת confluency המלא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השתלת תקעי ג'ל ECM-לחקות עם CM משורת תאים מניב גידול angiogenic בצמיחה מהירה U-87 MG, תוצאות באנגיוגנזה הנרחבת. כלי דם זה יכול להיות חוקרים בהרחבה על ידי שימוש בשתי שיטות הדמיה משלימות.
ההדמיה בארה"ב חומר ניגוד microbubbles מגלה גיוס נרחב של כלי דם פונקציונליים לתקע על ידי הממחיש את זרימת דם נרחבת בתוך U-87 MG CM תקעים טעונים, בניגוד לזרימת דם לגילוי בתוך תקעים המכילים CM מהתאים מניב גידול רדומים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שילוב שיטות הדמיה משלימות מאפשר הקניית המידע על הכלי-הדם הקטן בצפיפות, פונקציונלי והמורפולוגיה של רכיבי אנגיוגנזה שונים. CM Loading על תקעי ג'ל ECM-לחקות יוצר מייקרו-סביבה של גידול, אשר מופרד מאוכלוסיות תאים אחרות, כמו תאי אנדותל, שגויסו וextravasate לתקע.
על ידי ביצוע, במקביל, microbubbles הדמיה ארה"ב חומר ניגוד והדמיה endomicroscopy confocal fibered, אנו יכולים להסיק כי בריכה של גורמים המופרשים על ידי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מעבדת המחקר סאצ'י-פאינרו נתמכת באופן חלקי על ידי האגודה הבינלאומית לחקר הסרטן (AICR), הקרן הגרמנית-ישראלית (GIF), הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 1309/10), פרס הגשר השוויצרי, וכן על ידי מענקים מהמיזם הלאומי לננוטכנולוגיה בישראל (INNI), התוכנית לתחום הטכנולוגיה המוקד (FTA): ננו-רפואה לת'רנוסטיקה מותאמת אישית, ועל ידי קרן המחקר לננוטכנולוגיה ע"ש ליאונה מ. והארי ב. הלמסלי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מאייד ואקום סיבובי | - | -- | |
| גורמי גדילה מופחתים ללא פנול מטריג'ל | BD Bioscience | FAL356231 | להפשיר בן לילה, ב-4 מעלות; C על |
| קרם הסרת שיער | - | -- | |
| מערכת הדמיה אמריקאית Vevo2100 | VisualSonics Inc. | - | דורש ידע קודם בהפעלה או סיוע של טכנאי מורשה |
| 55 מגה-הרץ 708 בדיקה | VisualSonics Inc. | - | - |
| תוכנת הדמיה Vevo2100 | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX-DEFINITY | |
| microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | הפעלה למשך 45 שניות באמצעות VialMix לפני השימוש |
| CellVizio (אנדומיקרוסקופ קונפוקלי סיבים) | Mauna Kea | Technologies-דורש ידע קודם בהפעלה או בסיוע של טכנאי מורשה | |
| ProFlex MiniO/30 בדיקה | Mauna Kea טכנולוגיות | - | |
| דקסטרן 70 kD עם תווית FITC | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| תוכנת ImageCell | Mauna Kea Technologies | - | |
| ערכת כיול | Mauna Kea Technologies | - | |
| Dulbecco s שונה Eagle' s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | תעשיות ביולוגיות | 04-007-1A | |
| תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין/ניסטטין | תעשיות ביולוגיות | 03-032-1B |
מקורות
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
