מאמר שיטה

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה

38.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51526

⸱

12 בינואר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

במאמר זה

סיכום

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו. מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

תקציר

אורגנוגנזה היא חקר האופן שבו איברים מוגדרים ולאחר מכן רוכשים את צורתם ותפקודיהם הספציפיים במהלך ההתפתחות. העובר Xenopuslaevis שימושי מאוד לחקר אורגנוגנזה מכיוון שגודלם הגדול הופך אותם למתאימים מאוד לזיהוי איברים בשלבים המוקדמים ביותר באורגנוגנזה. בשלב זה, השיטה העיקרית המשמשת לזיהוי איבר ספציפי או פרימורדיום היא הכלאה שלמה באתרה עם בדיקות RNA אנטי-סנס מסומנות ספציפיות לגן המתבטא באיבר המבוקש. בנוסף, קל יחסית לתפעל גנים או מסלולי איתות ב-Xenopus והכלאה באתרה מאפשרת לבדוק שינויים בנוכחות או במורפולוגיה של איבר מטרה. הכלאה שלמה באתרה היא פרוטוקול רב-יומי עם שלבים רבים המעורבים. כאן אנו מספקים פרוטוקול פשוט עם מספר מופחת של שלבים וריאגנטים בשימוש שעובד היטב עבור בדיקות שגרתיות. רובוטים היברידיים באתרם הקלו מאוד על התהליך ואנו מפרטים כיצד ומתי אנו משתמשים בטכנולוגיה זו בתהליך. לאחר השלמת הכלאה באתר, לכידת התמונה הטובה ביותר של התוצאה יכולה להיות מתסכלת. אנו מספקים עצות כיצד לייעל את ההדמיה של תוצאות הכלאה באתר. למרות שהפרוטוקול מתאר הערכת אורגנוגנזה ב-Xenopus laevis, כמעט בוודאות ניתן להתאים את אותו פרוטוקול בסיסי ל-Xenopus tropicalis ולמערכות מודל אחרות.

מבוא

דפוס הביטוי של גן ספציפי הוא פיסת מידע חשובה בקביעת התפקיד הפוטנציאלי של אותו גן בהתפתחות של איבר או סוג תא מסוים. במילים פשוטות, אם היא לא באה לידי ביטוי בזמן ובמקום הנכונים, סביר להניח שהיא לא תשחק תפקיד מפתח. בקסנופוס, כמו ברוב העוברים המוקדמים, הבדיקה הנפוצה ביותר לזיהוי ביטוי של גן היא הכלאה שלמה באתרה באמצעות בדיקות RNA אנטי-סנס. השימוש בצביעת נוגדנים כדי להעריך את ביטוי הגן בקסנופוס הופך נפוץ יותר כאשר חוקרים מגלים נוגדנים, הגדלים בדרך כלל כנגד חלבוני יונקים, המגיבים להומולוג Xenopus או מייצרים 1-3 משלהם. עם זאת, הרוב המכריע של המחקרים על קסנופוס אורגנוגנזה עדיין משתמשים בבדיקות RNA אנטיסנס. כאשר משתמשים בנוגדנים, כל נוגדן בודד דורש לעתים קרובות אופטימיזציה לפרוטוקולי ריכוז הנוגדנים העיקריים או קיבועם. לעומת זאת, הפרוטוקול עבור הכלאות באתרן הוא למעשה קבוע עבור בדיקות שונות. הרעיון הבסיסי הוא פשוט יחסית ופרוטוקול סטנדרטי מצוין הוקם היטב 4. הפרוטוקול שלנו הוא גרסה יעילה של פרוטוקול 4 המקורי שעדיין מספק זיהוי מצוין של דפוסי ביטוי גנים בעובר המוקדם. העוברים מקובעים ולאחר מכן מוכנים להכלאה על ידי שינוי תמיסות וטמפרטורות כך שיאפשרו קשירה קפדנית גבוהה של בדיקת ה-RNA האנטי-סנס המסומנת ל-mRNA היעד שלה. הגשושית הלא קשורה נשטפת ולאחר מכן מכינים את העוברים לקשירת נוגדן כנגד התווית על בדיקות ה-RNA. לאחר מכן נשטף עודף נוגדנים ונעשה שימוש בתגובת צבע אנזימטית כדי לאתר היכן בדיקת ה-RNA קשורה בעובר. ישנם כיום מספר קווים טרנסגניים של Xenopus המניעים ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות ספציפיות ואלה זמינים במרכזי המלאי של Xenopus כגון משאב Xenopus הלאומי בוודס הול. בעוד שאפשרות זו שימושית מאוד עבור ניסויים רבים הדורשים בחינת אורגנוגנזה בעוברים חיים, אפשרות זו דורשת דיור נפרד לקווים הטרנסגניים.

הכלאה באתרה יכולה לתאר בבירור היכן ייווצרו איברים או סוגי תאים מסוימים בעובר המוקדם (איור 1). הטכניקה רגישה להפליא בהתחשב בכך שניתן לזהות ביטוי גנים במספר קטן של תאים בעובר בודד 5. עם זאת, הכלאה באתרה באמצעות עוצמת הצביעה הקולורימטרית אינה נחשבת ניתנת לכימות מכיוון שתגובת הצבע אינה ליניארית. למרות הקושי לכמת את עוצמת הצביעה, שינויים בהבעה מורגשים לרוב למדי; במיוחד כאשר ההכלאה באתרה מראה עליות או ירידות ניתנות לכימות בגודל תחומי הביטוי 6,7.

היתרונות הברורים של הכלאה שלמה באתרה הופכים אותה לבדיקה קריטית בחקר ההתפתחות המוקדמת. עם זאת, זה גוזל זמן ודורש שלבים רבים על פני מספר ימים. פרוטוקול זה הוא גרסה פשוטה של הפרוטוקול הסטנדרטי המבטל מספר שלבים מבלי לפגוע באיכות התוצאה באתר. הפישוט גם מבטל מקורות של שונות, מה שמקל על פתרון בעיות אם הכלאה במקום אינה אופטימלית. באופן ספציפי, ביטלנו את השימוש בטיפולי פרוטאינאז K ו-RNAse בעובר, שני שלבים שיכולים להיות תלויים באיכות המגיב ויכולים גם להפחית את עוצמת האות אם הם מוגזמים. הפרוטוקול מספק גם מידה מסוימת של חיסכון בעלויות עקב ביטול השימוש במספר ריאגנטים. לבסוף, פרוטוקול זה מספק גם כמה הנחיות פשוטות ללכידת תמונות משופרות של תוצאות הכלאה באתר. למרות שפרוטוקול זה מותאם לעבודה בעוברי קסנופוס, סביר להניח שלפחות חלק מהפשטות יהיו ישימות לעבודת הכלאה באתרה במערכות עובר אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. העובר הכנה

  1. אם לא נעשה באופן שגרתי כחלק מתרבות עובר, דה-הג'לי עובר באמצעות ציסטאין 2.5%, pH 8.0 לפני קיבוע 8. למרות שזה לא הכרחי, הוא שימושי וללאחר מכן להסיר באופן ידני את מעטפת ההפריה לפני הקיבוע באמצעות מלקחיים בסדר.
    1. השתמש בטפטפות פסטר זכוכית להעביר את העוברים. פיפטה אינה רחבה מספיק כדי להעביר עוברים כך להשתמש בעט יהלום לחתוך טפטפת הזכוכית בנקודה רחבה מספיק כדי להרים את עובר. לחסל את הקצוות החדים של טפטפות לאחר החיתוך על ידי העברה במהירות את הקצה לחתוך דרך הלהבה של מבער בונזן כדי להמס את הקצוות החדים.
      הערה: טיפול צריך לקחת, כמו הזכוכית עדיין יכולה להיות חמה מספיק כדי לגרום לכוויות למרות שזה נראה שמקורר על ידי בדיקה ויזואלית.
  2. בצע את קיבעון העובר בשלבים. ראשית, להכין צלוחיות זכוכית לשימוש בקיבעון עובר. השתמש בבקבוקונים הללו לכל השלבים כולל סופיאחסון. השתמש בבקבוקונים שברורים עם חותם טפלון טוב במכסה, המאפשרים לניטור עוברי במהלך כל השלבים של התהליך. תווית הצלוחיות עם מידע ניסיוני מתאים באמצעות סמן קבוע ולאחר מכן לכסות את התווית עם סרט ברור, כמו גם סמן קבוע יאבד במהלך ההליך בשל השימוש באלכוהול וממסים אחרים.
    1. השתמש Mempfa לתקן את העוברים. הפוך מניות של paraformaldehyde 8% בקבוצות של 50-100 מיליליטר בכל פעם. השתמש בכ -75% מH 2 O הנדרש וחום 50-60 מעלות צלזיוס, אשר נדרשה כדי לקבל את paraformaldehyde לפתרון.
      הערה: פתרון זה הוא מעט שונה מMemfa שימש בגרסות פרוטוקול שפורסמו מבוגרות בכך שהוא מנצל paraformaldehyde במקום פורמלדהיד.
    2. להוסיף 2-3 טיפות של NaOH 10N או עד pH הוא כ 7.5 (נייר pH שימוש כדי לבדוק pH). Paraformaldehyde הוא מאוד רעיל, ולכן ליצור פתרון המניות במנדף. ברגע שפסקפורמלדהיד הוא בפתרון, לסנן את הפתרון באמצעות נייר Whatman לתוך מיכל טרי ולהוסיף H 2 O לנפח הסופי. במידת הצורך, לאחסן פתרון paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.
    3. להרכיב את הרכיבים הנותרים של פתרון Mempfa קיבעון (טבלת 1). ודא שריכוז העבודה הסופי של paraformaldehyde הוא 4%. אחסן את כל הרכיבים של פתרון הקיבעון על 4 מעלות צלזיוס במניות.
    4. בעזרת פיפטה קריסטל, לתקן את העוברים על ידי הוספת העוברים לבקבוקוני זכוכית שכותרתו כי כבר מלאים במ"ל כ 3-4 פתרון Mempfa (טבלת 1). הימנע מתיקון יותר מ 20-30 עוברים לכל בקבוקון. הוסף את העוברים עם מינימום של העברת נוזל ממדיום העובר. תקן את העוברים בפתרון Mempfa לשעת 2 ​​בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
    5. למבנים האנדודרם מאוחר לבצע במנח על מכשירים נגזרים בטן והאנדודרם מבודדים באופן ידני 9,10, המאפשר לחדירה טובה של החללית וגם ימנע כתמי חלל.
    6. אחסן פתרון של מתנול 100% ב -20 ° C. לאחר קיבוע paraformaldehyde, להחליף את פתרון Mempfa עם כ 4 מיליליטר של -20 ° C, מתנול 100% לאחסון של העוברים.
    7. לערבל את הבקבוקונים לאחר תוספת של מתנול כדי למנוע את העוברים יידבקו לזכוכית או עוברים אחרים. כמו כן, ודא הבקבוקונים בחוזקה אטומים כי מתנול יכול להתאדות במקפיא לאורך זמן אם רופף.
      הערה: ניתן לאחסן עוברים לשנה לפחות, וסביר יותר, במתנול לפני מכתים ללא איבוד איכות הכלאה באתר.

2. בדיקה הכנה

  1. השתמש 1-2 מיקרוגרם של תבנית ה- DNA על מנת להפוך את הבדיקות שכותרתו digoxigenin. פלסמיד Cut המכיל את רצף ה- DNA המתאים בסוף '5 של הגן של עניין עם הגבלת האנזים מתאים לthaוקטור t ליצור בדיקות antisense.
    הערה: פלסמיד צריך אתר קישור RNA פולימראז המתאים (למשל T7, T3, או SP6).
  2. לאפשר את ה- DNA, מים, NTP לערבב וחיץ פולימראז כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני הרכבת תגובת סינתזת בדיקה. מוסיף את הרכיבים של סינתזת התגובה RNA לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר בצו כמפורט בטבלה 2. התאם את נפח מים הוסיף להביא את הנפח הכולל של סינתזת תגובת בדיקה עד 20 μl. להרכיב את התגובה בטמפרטורת חדר, כי רכיבים של חיץ פולימראז יכולים להאיץ את ה- DNA התבנית כאשר בריכוזים גבוהים וקרים.
  3. דגירה תגובת השעתוק עבור שעת 2 ​​ב 37 ° C.
    הערה: incubations של מעט יותר משעתיים מובילה לשום תופעות לוואי, אלא גם להראות קצת גדלה תשואה. אם טופח במשך שעה אחת, התשואה תקטן, אבל עדיין מספיק כדי להפוך את בדיקה טובה.
    1. בזמן ההמתנה לתגובת השעתוק ועד סופו, להפוך את הג'ל agarose אשר ישמש כדי לבדוק את האיכות של החללית. להמס 1 מיקרוגרם של agarose בשל חיץ 1x טה 100 מיליליטר (ראה טבלה 1) על ידי חימום הפתרון לנקודת הרתיחה. הסר את הפתרון מחום כאשר אבקת agarose נמסה לגמרי.
    2. הוסף 2 μl ethidium ברומיד פתרון מניות (10 מ"ג / מיליליטר) לכ -100 מיליליטר של ג'ל agarose כאשר agarose התקרר לכ -60 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר ויזואליזציה של RNA באור אולטרה סגול (UV).
      הערה: פתרון agarose ג'ל זה יכול להיות כל הזמן בחממה C ° 60, כך שיכול להיות שפכו ג'לי עתיד ללא המסה חוזרת ונשנית. תשמרו על עצמך בטיפול ברומיד ethidium בשל רעילות אפשרית.
  4. להוסיף μl 1 DNAseI (כיתה חופשית RNAse) לתגובת השעתוק לאחר הדגירה שעה 2 ודגירה נוספת 10 דקות ב 37 ° C לחסל תבנית ה- DNA.
  5. הסר 1 μl של תמהיל התגובה ללבדוק 1% ג'ל agarose-טה והשאר (20 μl) להוסיף 80 μl של 1% SDS במאגר TE (10 מ"מ טריס pH 8.0, 1 mM EDTA), 10 μl של 5M NH 4 Acetate, ו- 220 μl אתנול קר של. וורטקס התמהיל נמרץ ומניח בצד על קרח עד לתוצאות בדיקת איכות RNA ידועות.
    1. הפעל את μl 1 של RNA להסיר לפני הממטרים ב1% ג'ל agarose-טה. כדי להקל על העמסה על הג'ל, להוסיף 4-5 μl מים וμl 1 של צבע טעינה הסטנדרטי לRNA. צפה RNA על הג'ל באמצעות transilluminator אור UV כדי לבדוק את איכות הבדיקה (ראה דיון).
  6. לזרז את הרנ"א שנותר ששמר בצד על קרח בשלב 2.5 על ידי ספינינג בmicrocentrifuge במלוא מהירות במשך 10 עד 15 דקות. לצייר את supernatant עם טפטפת זכוכית נמשך החוצה ולאפשר לו להתייבש בקצרה.
    1. Resuspend הבדיקה עם 1 מיליליטר של חיץ הכלאת RNA (טבלת 1) בצינור Eppendorf. וורטקס וbriefly לחמם את הצינור עד 37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב. מעביר את פתרון הבדיקה כדי 15 מיליליטר בורג צינור קלקר כובע ולמלא ל7-10 מיליליטר עם חיץ הכלאת RNA. הערה: הבדיקה יכולה להיות מדוללת נוספת (דילול נוסף של 10 לקפל עדיין יכול לעבוד) ופעמים רבות תוצאה רקע נמוך אבל התגובות מכתים גם להימשך זמן רב יותר.

3. הכלאה באתר

  1. קח את העוברים שאוחסנו במתנול -20 ° C ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר. בצע את ההליך כולו בבקבוקוני הזכוכית. אם עוברים שונים מקבוצה אחת הולכים להיות הסתכלו על ידי בדיקות שונות, לשמור אותם בבקבוקון אחד עד ממש לפני הבדיקות נוספות כדי להפחית את השונות ועבודה ביום הראשון.
    1. רעננותם עובר דרך סדרת מתנול כפי שמתואר בטבלה 3 (ראה טבלה 1 למתכונים לשטוף) בהכנה לתוספת של הבדיקה. מערבולת בעדינות את אמברימערכת ההפעלה לאחר כל שינוי כדי להבטיח שהם לא נשמרים לצדדים או אחד את השני, ולטלטל את העוברים על ידי הרכבה הבקבוקונים על nutator. בעת העברת הנוזלים, לבדוק את החלק הפנימי של הכובעים כדי להבטיח שעוברים לא היו לכודים שם.
    2. פעם אחת בפתרון הבדיקה, להכליא את עוברי לילה כפי שמתואר בטבלה 3.
  2. הסר את פתרון הבדיקה. שמור את הבדיקה בשימוש על ידי אחסון 15 מיליליטר בורג צינור כובע קלקר, מסומן בתאריך ומספר הפעמים שהבדיקה נעשתה שימוש, ב -20 ° C.
    הערה: אותו הבדיקה ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות שללאחר מכן בהכלאות באתר עד תגובות colorimetric להתחיל לקחת זמן רב באופן חריג להגיע עוצמה רצויה.
    1. ברגע שהבדיקה היא שהוסר, להכין את העוברים למכתים נוגדן נגד הבדיקה באמצעות הסדרה של שוטף המפורטים בטבלה 4. שינוי הטמפרטורה כנדרש (לוח 4) על ידי הזזת tהוא nutator, עם בקבוקונים של עוברים המצורפים, ישירות לתוך תנורי הכלאה שמוגדרים לטמפרטורה המתאימה.
    2. מרכיבים את הנפח המתאים של MAB + HTSS + BR + אנטי-Dig נוגדן (לוח 4) בזמן שהעוברים שטופחו על ידי MAB + HTSS + BR פתרון חסימה כך שהנוגדן חסום לפני הוספה ל עוברים. הפוך את פתרונות החסימה טריים ביום של שימוש.
  3. הסר את פתרון הנוגדן ולהתחיל שטיפות כפי שמתואר בטבלה הבאה 5 דגירה הלילה עם נוגדן. לבצע לפחות עשר 30 שטיפות דקות כדי להתכונן לצביעה עם מצע phosphatase אלקליין ולהפחית את הרקע ככל האפשר. השתמש באחת חיץ MAB או פתרון TBT (טבלת 1) לשלבי הכביסה.
    הערה: פתרון TBT הוא TTw כי יש 2 מ"ג / מיליליטר של BSA הוסיף.
    1. החלף את הפתרון לשטוף האחרון עם מצע phosphatase אלקליין הסגול BM. בצע את reac מכתיםtion באו טמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: מכתים הוא יותר מהיר ב- C ° 37, אבל אם נשאר כל הלילה, מכתים רקע מקובל לעתים קרובות יכול להיות תוצאה. התגובות מכתים לעתים קרובות דורשות צביעת הלילה וטמפרטורת חדר היא הבטוחה ביותר לכך.
    2. אם נדרש צביעה נוספת והפתרון הסגול BM הוא לוקח על צבע כחול, להחליף את הפתרון מכתים עם טרי BM הסגול ולשים את הצינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס. אם mRNA היעד הוא מאוד עשיר, לשים את העוברים בפתרון מכתים ב 4 ° C למשך לילה ולאחר מכן להעביר את העוברים לטמפרטורת חדר או 37 ° C כדי לאפשר ניטור טוב יותר של התגובה מכתים.
    3. צג תגובות חדשות בזהירות, כזמן תוצאה סופית משתנה במידה ניכרת בין RNAs היעד שונה. לשם עקביות, לעצור את התגובה מכתים (ראה 3.4) כאשר אין אתרים חדשים של ביטוי נובע עם דגירה ארוכה יותר. חשוב לציין, אם הכלאה באתר נמצא בשימוש כassayלניסויים מסתכלים על קבוצות טיפול שונות, להשתמש באותו הזמן לתגובות צבע בין עוברי טיפול ושליטה.
  4. לעצור את התגובה מכתים ולהכין את העוברים לאחסון והקלטת תמונה על ידי שינוי הנוזלים כפי שמתואר בטבלה 6. לא לטלטל את העוברים בשלב זה, כי הסרת הכתם יכולה להיות דמיין כצביעה סגולה של מתנול סביב העוברים.
    הערה: לעתים קרובות יש לי עוברים צביעה בצבע תכלת מהפתרון מכתים ומתנול הקר לפחות באופן חלקי יכולה להסיר את זה, למרות שזה אינו מספיק כדי להסיר את הרקע כבד או כתמי חלל. מתנול קר מתייחס למתנול שנשמר ב-20 ° C במקפיא.
    1. רעננותם את העוברים ולתקן את הכתם עם Mempfa (לוח 6). ברגע קבוע, להסיר את Mempfa ולשטוף את העוברים עם מתנול 25%.
    2. הסר את מתנול 25% ולהוסיף את פתרון ההלבנה אם ההסרה של פיגמנט אנדוגנינדרש. תשמור על עצמך בטיפול בפתרון ההלבנה כפי שהוא יכול לגרום לכוויות. שים לב להלבנה מקרוב כפי שזה קורה במהירות יחסית ואת מידת ההלבנה יכולה להיות מגוונת לאפקטים שונים (איור 2).
    3. ליבש עוברים דרך סדרת מתנול מתנול 100% עבור אחסון לטווח ארוך הבאה הלבנה, או להעביר לPBS עבור אחסון לטווח קצר וההדמיה הבאה (ראה טבלה 6).

4. עוברים הדמיה

  1. ברגע שעובר השלים את תהליך הצביעה, תמונת העובר, כך שהמידע על איפה הגן של העניין מתבטא הוא נתפס לקהל רחב יותר. השתמש 1% agarose כרקע לצפייה בעוברים הבלתי מסולקת.
    הערה: agarose נותן רקע כחול / אפור שעומד בניגוד היטב עם העובר והצבע הכחול של התגובה מכתים. זה גם עוזר לפזר צללים והשתקפויות שלהסיט את תשומת לב מן העובר מסיחים את דעת.
    1. להוסיף agarose למים ולאחר מכן מביא לרתיחה עד agarose הוא בפתרון ולאחר מכן לתת מגניב עד 50 לפני שנשפכים לתוך צלחת פטרי. כמו במקרה של פתרון ג'ל טה, לאחסן פתרון agarose ב -55 מעלות צלזיוס חממה לשימושים מרובים. יוצקים את agarose עד לעומק של כ -2 מ"מ בצלחת פטרי. במידת הצורך, להתאים את עומק agarose להניב מעט שונה צל הרקע.
    2. בעקבות התייבשות מהאחסון במתנול לתמיסה מימית (PBS או TTw), באמצעות סדרת מתנול, מניח את העוברים בצלחת פטרי עם בסיס agarose (ראה לוח 6). שמור את הפתרון נקי ואם נדרש, להשתמש בסינון פשוט לחסל חומר חלקיקים קטן שיכול לשבש את הרקע הנקי של תמונות טובות.
    3. לתמונה עובר מהשקפות חלופיות, כגון מהצד הגחון, לחתוך דקים ערוצים בagarose כדי להתאים את העובר באמצעות מלקחיים עדינים ומניח את העוברים באותם ערוצים לכיוון (איור 3 ). תשמרו על עצמך במניפולציה של העוברים כפי שהם נפגעו בקלות.
      הערה: רוב השלבים עמדה אופיינית שהם מניחים כאשר הניחו פתרון. לדוגמא, עובר blastula השלבים נוטים לשבת בצד עד לבעלי חיים. ברגע שעובר מתחיל להאריך, הם שכבו בצד שלהם.
  2. השתמש במקור האור האופטי סיבים כדי להאיר את העובר מזווית רדודה, יצירת צללים על העובר המספקים עומק לתמונה ולעזור להבחין מבני משטח. משום הלבנה יכולה לחסל פיגמנט המספק ציוני דרך שימושיות, להשתמש בהצללה לעוברים מאוד מולבנים.
  3. נקה את העוברים לצביעת תמונה שהוא עמוק בתוך העובר, כגון בnotochord, הריאות, או באזורים של המוח, (איור 4). כדי להשיג זאת, לשים את העוברים דרך סדרת מתנול עד 100% מתנול.
    1. לאחר טבילה מלאה במתנול, להעביר את העוברים לנזיל אלכוהול פתרון של חלק אחד ושני חלקים בנזיל להיותnzoate (באב). עובר אשר יצוף על פני השטח, אלא כמתנול מתערבב עם באב, הם ישקעו באב. לבצע כל צעד העוסק באב בבקבוקוני זכוכית או כלים; באב יתמוסס כל פלסטיק או צבע.
    2. ברגע שפינה, להציג את העוברים עם אור מועבר מגיע מלמטה העובר. התאם את עוצמת האור, כמו גם את הזווית מלמטה כדי לשפר את הניגודיות ומספק את הצבע הטוב ביותר.
    3. כאשר עוברים פינו צפייה להעלות את צלחת פטרי מזכוכית משל הבסיס. לעשות את זה פשוט על ידי השימוש בשני מכסים בצלחת פטרי אחרים כדי לגייס אותו כך שהאזור של המנה עם עוברים הוא גבוה.
      הערה: זו יש את היתרון של לקחת את הבסיס מחוץ לפוקוס וביטול השפעות מסיחות את הדעת מפגמים או כתמים על בסיס מיקרוסקופ שיכול להפריע לתמונה.

הכלאה באתר 5. זוגי ב

  1. כדי בו זמנית כדי להציג את דפוס הביטוי של two גנים שונים בעובר יחיד, לסנתז שתי בדיקות, אחת לכל אחד מהגנים השונים. לסנתז בדיקה אחת באמצעות DIG-11-UTP כתווית כפי שתואר לעיל. לדלל את המוצר של תגובת השעתוק במאגר הכלאה RNA להניב בדיקה מרוכזת יותר מאשר 3x משמש ליחיד בהכלאות באתר.
    1. לסנתז בדיקה נוספת של ריבית תוך שימוש באותו הפרוטוקול כלDIG שכותרתו חקר פרט לכך שההעמסה-12-UTP חייב להיות תחליף לDIG-11-UTP. לדלל את המוצר של תגובת השעתוק במאגר הכלאה RNA להניב בדיקה מרוכזת יותר מאשר 3x משמש ליחיד בהכלאות באתר.
    2. מערבבים את שתי בדיקות מרוכזות ביחס של 1: 1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בבדיקה שכותרתו והעמסת לגן המציג את הביטוי החזק ביותר באחד בפרוטוקול הכלאה באתר.
  2. השתמש באותו בפרוטוקול הכלאה באתר תאר לאחד באתרו </ Em> הכלאות, למעט שימוש בבדיקה הכפולה (בדיקה המכילה תערובת 1.5x מרוכזת של בדיקות שכותרתו digoxigenin ושכותרתו והעמסת) בסופו של היום הראשון במקום יחיד בבדיקת הכלאה באתר.
    1. בצע את פרוטוקול הכלאה אחת ביום השני של כפול בפרוטוקול הכלאה באתר, פרט לברי שימוש אנטי-והעמסת-AP Fab בדילול 1: 4,000 במקום של שברים אנטי DIG-AP Fab. לשטוף את הנוגדן העודף מהעובר כמו באחת בפרוטוקול באתר ולבצע את תגובת הצבע הראשונה באמצעות מצע BM-הסגול AP.
  3. בעקבות תגובת הצבע הראשונה, להשבית את נוגדן flourescein ב 0.1 M pH גליצין 2.0 במשך 40 דקות ואחריו חמש עשר דקות בשוטף MAB. חסום את העוברים בMAB + HTSS + BR למשך 90 דקות. הוסף את הנוגדן אנטי DIG בדילול 1: 2,000 בMAB + HTSS + BR דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    1. למחרת, לשטוף את העוברים הoroughly בMAB (12 שטיפות של 30 דקות) כדי להסיר את הנוגדן העודף.
    2. לשטוף את העוברים במשך 10 דקות בAP הצפת (טבלה 1) ולאחר מכן כתם עם BCIP (0.5mg / מיליליטר בAP Buffer).
      הערה: באתרו שילוב צריך לתת כתם כחול-סגול כהה לתגובת הצבע הראשונה ותגובת צבע תכלת לשנייה (איור 5).
    3. לעצור את תגובת הצבע הסופית על ידי הסרת חיץ AP ולשטוף שלוש פעמים עם MAB. תקן את העוברים עם Mempfa במשך 10 דקות. לשטוף את העוברים עם 5 שוטף מהיר בMAB או TBT.
    4. עם שילוב הצבעים הזה, השימוש במתנול בטיפולים שלאחר הצביעה הוא כבר לא אפשרי, כפי שהוא יבטל את הצבע לבד BCIP. אחסן את העוברים לאחר מכתים וקיבעון בPBS עם 0.02% אזיד הנתרן. מכתים עוצמה יכולה להיות חלש עם כפול במנח. אם מדובר בבעיה, להפחית את שטיפות לארבעה, כל אחד מ2 משך שעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השימוש בבדיקות רקמות ספציפיות יכול לספק מידע מצטיין בכל הקשור למצב של פיתוח לאיברים ספציפיים. בדוגמאות הבאות, שלבו של העובר מבוסס על שולחן בימוי Nieuwkoop וFaber 11. אם האדם משתמש בגני טופס בדיקות ביטאו לאחר בידול, טרופונין אני לב בשלב 28-30, למשל (איור 1 ג), נוכחות או גודל של איבר מובחן ניתן להעריך בכל שלב שלאחר התמיינות. לפני שנים, embryologists היו מסוגל לעשות ניתוח כזה המבוסס על ידע מדהים של היסטולוגיה של העובר המוקדם 12,13 אבל ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היכולת להשתמש בכלאה באתר כדי להמחיש את דפוס הביטוי של גנים מסוימים נשארת השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לזיהוי איברים ספציפיים או סוגי תאים בעובר Xenopus. סיבה לכך הוא מספר יתרונות המוצעים על ידי טכניקה זו. הביטוי של גן יכול לזהות מבנים ספציפיים היטב לפני כל סימן היסטולוגית של בידול כגון במקרה של ביטוי nkx2.5 באבות הלב לפני כל תיחום ברור של תאים אלה 18. לאחר שכל חומרים כימיים נמצאים ביד, זה גם מאוד חסכוני. דור של רבים בדיקות בודדות, שניתן לעשות שימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות ל-CIHR על תמיכתם במלגות של סטיב דיימלינג ולמחלקה לרפואת ילדים, אוניברסיטת מערב אונטריו על תמיכתם בסטיב דיימלינג, רמי חלבי וסטפני גרובר. עבודה זו נתמכה על ידי R2654A11 המענקים של NSERC ותוסף NSERC Discovery Accelerator

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שייקרים צינורות LabguakeVWR17-08-2011
בקבוקוני VWRVWR 10-07-2012
L-ציסטאיןBioShopCYS342.500
ריבונוקלאוזיד טריפוספט סט, 100 מ"מRoche11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
מעכב Rnase (Rnase OUT)Invitrogen 10777-019
T7 RNA פולימראזפרמנטסEPO111
T3 רנ"א פולימראזפרמנטסEPO101
SP6 רנ"א פולימראזפרמנטסEPO131
דנאז 1אינוויטרוגן 18047-019
סרום כבשים  Wisent31150
מגיב חוסםRoche11096176001
BM סגול Ap SubstrateRoche11442094001
Anti-Digoxigenin-AP שברי פברוארRoche11093274910
מתנולVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
מגביםBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehydeBioShopPAR070.500 
פורממיד  VWR       CAFX0420-4 
RNARoche10109223001
חומצה מאלית  VWR       CAMX0100-3
תלת-נתרן ציטראטBioShopCIT001
מי חמצן (תמיסה 30%)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
בנזיל אלכוהולסיגמאB-1042
בנזיל בנזואטסיגמאB-6630
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500

מקורות

  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
  4. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
  6. Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
  7. Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
  10. Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  12. Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
  13. Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
  14. Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XenopusARO

מאמרים קשורים