מאמר שיטה

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל דרוזופילה רקמות באתר

DOI:

10.3791/51528

⸱

14 באוגוסט 2014

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים שבוצעו בתסיסנית עוברים וזחלים מספקים תובנה חיונית לתהליכים התפתחותיים כגון מפרט גורל התא וorganogenesis. Immunostaining מאפשר ההדמיה של פיתוח רקמות ואיברים. עם זאת, לציפורן הגנה שיוצרת בסופו של עובר מונעת חלחול של נוגדנים לעוברי בשלב מאוחר וזחלים. בעוד לנתיחה לפני immunostaining משמשת באופן קבוע לנתח רקמות זחל דרוזופילה, זה מוכיח לא יעיל עבור חלק ניתוחים בגלל רקמות קטנות עשויות להיות קשות לאתר ולבודד. Sonication מספק חלופה לנתיחה בפרוטוקולי immunostaining דרוזופילה זחל. זה מאפשר עיבוד מהיר, בו זמני של מספר הגדול של עוברים בשלב מאוחר וזחלים ושומר במורפולוגיה באתר. לאחר הקיבוע בפורמלין, מדגם sonicated. לדוגמא נתונה אז immunostaining עם נמלה העיקרית אנטיגן ספציפיibodies ונוגדנים משני שכותרתו fluorescently לדמיין סוגי תאי היעד וחלבונים ספציפיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במהלך התהליך של sonication, מיקום נכון של בדיקה sonicating מעל המדגם, כמו גם את המשך ועוצמת sonication, הוא קריטי. שינויים קלים additonal לפרוטוקולי immunostaining סטנדרטיים עשויים להידרש לכתמים באיכות גבוהות. לנוגדנים עם אות נמוכה יחס רעש, פעמים דגירה ארוכות יותר הן בדרך כלל צורך בכך. כהוכחה של קונספט לפרוטוקול הקל sonication זה, אנו מראים immunostains של שלושה סוגי רקמות (אשכים, השחלות, ורקמות עצביות) בטווח של שלבי התפתחות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עוברי דרוזופילה וזחלים מספקים מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים באיברים ורקמות רבים. הדמיה של תאים בודדים היא לעתים קרובות יש צורך במחקרים אלה על מנת לוודא הסביבות המורכבות שבו תאים לפתח. ויזואליזציה של תאים ברקמות יכולה להיות מושג באמצעות immunostaining. ובכן תיאר immunostaining פרוטוקולים קיימים לרקמות עוברי דרוזופילה <17 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL) 1-3. עם זאת, צורות מגן ציפורן לקראת הסוף של עובר, מניעת חלחול נוגדן יעיל. לפיכך, פרוטוקולי immunostaining אלה אינם יעילים בניתוח של רקמות בעוברים בשלב מאוחר ובשלבים מאוחרים יותר של התפתחות זחל (instar 1 st (L1), instar 2 nd (L2), ו3 instar rd (L3)). חוסר יעילות זה מטיל מחסום להבנה של תהליכים דינמיים המתרחשים בתקופה התפתחותית מורחבת זה 4. Tissנתיחת ue היא טכניקה מועסק נרחב לעקוף מכשול זה 5-7. עם זאת, לנתיחה יכולה להוכיח לא יעילה. חילוץ ניתן לשעבוד על ידי קושי באיתור או בידוד עוברי ורקמות זחל. יתר על כן, ההסרה הפיסית של רקמות היעד עלולה לגרום נזק על ידי פקיעתם או בכך שלא לחלץ אותם בשלמותם.

Sonication הוא שיטה שמעסיקה גלי קול להפריע אינטראקציות מולקולאריים. זה כבר נעשה שימוש כדי לשבש את שלמות ציפורן זחל תסיסנית כדי immunostain פיתוח סוגי תאים עצביים 6. פרוטוקול זה הותאם לimmunostain עוברי בשלב מאוחר ובלוטות מין זחל, אשר יכול להיות קטנה כמו 50μm בקוטר 8-10. באמצעות מחקרים כאלה, התהליך של תאי גזע בתאי מין היווצרות נישה גברית (GSC) התאפיין בשלב מאוחר עוברי דרוזופילה 8-10 ומנגנוני ויסות התפתחות תאי גזע וDIFferentiation בבלוטות מין עוברי בשלב מאוחר וזחלים כבר הובהר 9-12. לפיכך, sonication מספק אלטרנטיבה יעילה לנתיחת רקמות שעלולות להיות קשה בגלל גודל של רקמה. יתר על כן, היא מאפשרת immunostaining של רקמות דרוזופילה באתר, עוזב תאים בהקשר של הגוף כולו ושמירה במורפולוגיה באתר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לimmunostaining הקרינה של עוברי בשלב מאוחר עד תחילת / רקמות אמצע-L3 באתר. ניתוח של רקמת אשכים ועצביים דרוזופילה מוצג בנציג התוצאות כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול immunostaining זה עשוי להיות מותאם לנתח רקמות אחרות דרוזופילה, כמו גם רקמות באורגניזמים אחרים עם עור מת חיצוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הכנת קייג אוסף

  1. הרדימי זבובים צעירים, פורה עם CO 2. העבר את הזבובים מורדמים לכלוב. כדי להשיג תשואה אופטימלית, להשתמש 100-120 זבובים בוגרים נעים בין 2-7 ימים של גיל ב4: 1 יחס של נקבות לזכרים. לאפשר זבובי תקופת הסתגלות מתאימה, ~ 24 שעות לפני קבלת מדגם לקיבעון. אם הכלוב הוקם עם נקבות בתולי הזדווגו לגברים, שימוש 36 - תקופת הסתגלות שעה 48.
  2. בקצה הפתוח של הכלוב, להציב צלחת אגר מיץ תפוחים מוכן מראש עם ירידה בגודל מטבע של שמרים להדביק במרכז על הפתיחה של הכלוב. ואז, בטוח עם קלטת. לאטום את הצומת בין הצלחת אגר מיץ תפוחים והכלוב עם Parafilm.
  3. מניחים את הכלוב במכל המשני עם צלחת אגר מיץ תפוחים כבסיס ולאפשר הזבובים להתרבות בטמפרטורה מוגדרת לתקופה מתאימה של זמן, כפי שנקבעו על ידי הניסוי.
    wi פעמים אוסף לדוגמא: הערהיהיה להשתנות. לדוגמא, בעת האיסוף עובר שלב מאוחר / מוקדם זחלי L1 (17 - 24 hr), לאפשר זבובים להטיל ביצים על צלחות אגר מיץ תפוחים במשך 7 שעות ב25 מעלות לפני ההזדקנות של מדגם ל17 שעה 25 מעלות צלזיוס. באופן דומה, לאוסף של זחלי אמצע סוף המאה הראשונים instar (36 - 48 hr) לאפשר זבובים להטיל ביצים במשך שעה 12 25 מעלות צלזיוס לפני ההזדקנות של מדגם ל36 שעה 25 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר תקופת הזמן היא מלאה, הקש על הכלוב על שולחן, כדי שזבובים לרדת מהצלחת אגר מיץ תפוחים ללא הרדמה. במהירות להחליף את הצלחת בשימוש עם אחד טרי המכיל טיפה של שמרים להדביק. אבטח את הצלחת הטרי עם קלטת וparafilm ולאחסן את הכלוב עם צלחת אגר מיץ תפוחים כבסיס.
  5. מוציא בזהירות את טיפת שמרים מהצלחת המשומשת עם מרית מתכת. מכסה מניח על צלחת מיץ תפוחים משמש ומאפשר הניח עוברים לגיל אם בניסוי נחוץ.
    שים לב: בעוד הזדקנות דגימות, צלחות עשויות להיות מאוחסנות ב25 ° C אלא אם כן טמפרטורות גבוהות יותר הן experimentally הנדרש. דוגמאות של איך מזדקן עובר לגבייה שתוארה לעיל (ראה הערה לצעד 1.3). ההסרה של שמרים להדביק לפני לדגום הזדקנות מבוצעת כדי למנוע זחלים מזוחל לתוך השמרים והפירוק אגר מתחת. שאריות אגר מיץ תפוחים ושמרי ממרח שנותרו לספק חומרים מזינים לצמיחת זחל. בעוד עוברים הניחו ישירות בשמרים להדביק הולכים לאיבוד דרך הסרת שמרים להדביק, הפסד זה עדיף על שמרים ושאריות אגר במדגם שיכול להפחית את יעילות כתמים. צריך אחד לבחור שלא להסיר את השמרים להדביק, שמרים יכולים להיות מעובה עם פוספט הצפת טריטון X-100 (PBTx), מעורבב עם מברשת צבע, ולאחר מכן הוסרו מהמדגם עם מסננת תא לפני הקיבוע.

2 קיבוע

  1. ברגע שהעוברים הניחו על הצלחת אגר מיץ התפוחים הזדקנו עד לנקודת הזמן הרצויה, להשתמש במכחול קטן רטוב עם פוספט הצפת טריטון X-100 פתרון (PBTx) כדי להסיר בזהירות מדגם מהצלחת דואר.
    הערה: זחלים מבוגרים ניידים ויכולים לזחול על החלק הפנימי של המכסה. מדגם זה עשוי להיות שנאסף באופן דומה על ידי ההסרה עם מכחול.
  2. נגב את המדגם עמוס המכחול נגד הרכס הפונה הפנימי של מסננת תא. לאחר מכן, יש לשטוף את הקירות של המסננת ומכחול עם בקבוק להשפריץ מכיל פתרון PBTx. מניחים כיסוי צלחת פטרי מתחת למסננת כדי ללכוד את פתרון PBTx.
  3. , אחרי הכל המדגם הועבר למסננת לשפוך מספיק PBTx לתוך המסננת כדי להעלות את המדגם מהרשת. לאחר מכן, הרם את המסננת ושופך את תכולת צלחת פטרי לתוך מיכל פסולת נוזלי.
  4. 2.3 שלוש פעמים חזר על שלב כדי להסיר שמרים ולעוף פסולת שייתכן שהועברה יחד עם המדגם.
  5. יוצקים מספיק אקונומיקה 50% (NaOCl) / מים (DDH 2 O) פתרון למסננת כדי להעלות את זחלי הרשת. לאפשר זחלים לשבת בפתרון למשך 5 דקות. לאחר מכן, הרם את המסננת ולשפוך את tהוא התוכן של צלחת פטרי במכל פסולת נוזלית.
    הערה: Bleach נדרש רק בדגימות עוברית בגילים 0-22 שעה כדי להסיר את קרום כוריוני. היישום של אקונומיקה לדגימות מבוגרות יכול להיות מושמט, אך הכללתה היא לא מזיקה. אם המחדל הוא רצוי, להחליף את אקונומיקה בשלב זה עם PBTx. יש להשתמש באקונומיקה מדולל בתוך 24 שעות של הכנת פתרון.
  6. לשטוף מדגם במסננת עם PBTx על ידי שפיכה מספיק PBTx לתוך המסננת כדי להעלות את המדגם מהרשת. לאפשר מדגם לשבת בפתרון במשך 3 דקות. לאחר מכן, הרם את המסננת ושופך את תכולת צלחת פטרי לתוך מיכל פסולת נוזלי.
  7. חזור על שלב 2.6 חמש פעמים.
  8. להספיג תחתית יבשה מסננת תא, ולאחר מכן להעביר מדגם לתוך בקבוקון המכיל נצנץ 1.75 מ"ל של תמיסת PEMS באמצעות מכחול.
  9. עובד במנדף מאוורר, להוסיף 250 μl של פורמלדהיד 37% ו -8 מ"ל של heptane כיתה מגיב לבקבוקון הנצנץ.
    הערה: פורמלדהיד וheptane הם מסוכנים. למטרות בטיחות, תמשיך לעבוד במנדף מאוורר וללבוש כפפות מתאימות לצעדים 2.9-3.3.
  10. לאפשר הבקבוקון ללחוץ ב200 סל"ד או מהירות בינונית דומה ל20 דקות.
  11. הוסף 10 מ"ל של מתנול לבקבוקון נצנץ מבלי להסיר את השלב מימיים הקודם ולאפשר את הבקבוקון ללנער במרץ ב500 סל"ד דקות 1.
    הערה: מתנול הוא מסוכן. תמשיך לעבוד במנדף מאוורר וללבוש כפפות מתאימות.
  12. הסר בקבוקון מייקר ומייד יוצק תוכן לתוך מסננת תא מעל מיכל פסולת נוזלי בשכונה. הוספת מתנול נוסף לבקבוקון ולרוץ דרך מסננת התא כנדרשת כדי להבטיח את כל המדגם הוסר.
    הערה: מסננות סלולארי עשויות לגרום באיטיות. כדי לתקן את זה, לגעת רקמות מעבדה לתחתית מסננת התא כדי לצייר את הפתרון דרך המסננת במהירות רבה יותר. מתנול, פורמלין, וheptane צריך להיותמאוחסן במיכלים פסולת מתאימים עד לסילוק נאות בהתאם להנחיות מוסדיות.
  13. תחתית יבש של מסננת תא באמצעות רקמות במעבדה, ולאחר מכן להשתמש במכחול להעביר מדגם שנתפס במסננת לצינור 1.5 מ"ל מכיל microcentrifuge 0.5 מ"ל של מתנול.
    הערה: אם בקבוקוני נצנץ מרובים נמצאים בשימוש, בצעו את השלבים 2.12 ו2.13 אחד בקבוקון בכל פעם כדי למנוע מדגם מהתייבשות על מסננות תא.
  14. לאחר המדגם נוסף לצינור microcentrifuge, להסיר מתנול עם טפטפת. מדגם להבטיח יש התיישב לחלק התחתון של הצינור.
  15. יש לשטוף את המדגם בצינור microcentrifuge על ידי הוספה כ 0.5 מ"ל של מתנול לצינור. חכה למדגם להתיישב ולאחר מכן להסיר מתנול עם טפטפת.
  16. חזור על שלב 15 שלוש פעמים.
  17. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול לצינור, ולאחר מכן לאחסן ב-20 ° C במקפיא לשימוש מאוחר יותר.

.3 Rehydration והכנת לדוגמא עבור Immunostaining

  1. הסר מתנול מצינור microcentrifuge עם טפטפת, שעזב את המדגם בצינור. פסולת חנות מתנול למכל הפסולת המתאימה עד מועד הסילוק נאות.
    הערה: כדי לשפר את יעילות sonication, להשתמש לא יותר מ 3 מ"מ של מדגם התיישב בחלק התחתון של צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. מדגם עודף עשוי להיות מועבר לצינור נפרד עם טפטפת לפני תחילת הצעד להחזרת הנוזלים מעל. חיתוך קצה פיפטה בסכין גילוח נקי יכול לשמש כדי למנוע סתימה של קצה פיפטה.
  2. הוספת 1.0 מ"ל של מתנול פתרון 50% / פוספט הצפת Tween (PBTw) לצינור והרוק במשך 3 דקות.
  3. הסר פתרון מתנול למכל הפסולת המתאים ולשטוף עם 1.0 מיקרוליטר של PBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה, לאפשר המדגם להתיישב לפני הציור את PBTw עם טפטפת.
  4. הוספת 1.0 מ"ל של שור הסרום אלבומין / פוספט שנאגרו Tween (BBTw) לערבב לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על כיסא נדנדה, לאפשר sample להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
  5. חזור על שלב 3.4 שתי פעמים מקפידים להסיר כמה שיותר BBTw ככל האפשר מבלי לאבד דגימה לאחר השטיפה האחרונה.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של BBTw לצינור ומניח את הצינור על קרח.

.4 Sonication של דוגמא

  1. הגדר את sonicator 10% משרעת המרבית ולייעד זמן ריצה של sonication הקבוע 2 שניות.
    הערה: הגדרות אלה הן ספציפיות לsonicator מצויינים בחומרים וציוד בלוח ועשויה לדרוש אופטימיזציה לsonicators שונה.
  2. לפני sonication של מדגם, לנקות את חללית sonicator על ידי הצבת את הקצה החללית לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל מלא sonicator מים ולרוץ ללא יונים כדי לנקות את הבדיקה. בדיקה sonicator יבש עם רקמה במעבדה אחרי הריצה.
  3. להטביע את הבדיקה לתוך הצינור המכיל microcentrifuge מדגם, כך שהוא נמצא בעמדת 3 עד 4 כ מ"מ מעל המדגם ולהתחיל sonication.
  4. הסר את mצינור icrocentrifuge ולמקם אותו על קרח לפחות 30 שניות כדי לפזר חום מsonication ולאפשר מדגם להתיישב בחלק התחתון של צינור microcentrifuge.
  5. חזור על שלבים 4.3 ו4.4 לפי צורך בהתבסס על גיל של מדגם בטיפול.
    הערה: לקבלת sonication אופטימלי נפח דגימה, עוברים צעירים מן 17 שעה אינו דורש sonication, אבל אלה בין 17 ו24 שעה (שלב 17 / מוקדם-L1) דורש שתי sonications. זחלים בין 24 - 36 (מוקדם / אמצע L1), 36 - 48 (מאוחר-L1 האמצע /), 48 - 60 (מוקדם / אמצע L2), 60-72 (אמצע / סוף-L2), 72-84 ( מוקדם-L3), 84-96 (מוקדם / אמצע L3), 96-108 שעה (אמצע / סוף-L3) דורשים 5, 9, 11, 13, 15, 18, ו22 sonications בהתאמה. ראה דיון לפרטים נוספים בפעמי sonication.
  6. לשטוף עם 1.0 מ"ל BBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר המדגם להתיישב לפני הציור את BBTw עם טפטפת.
  7. הוספת 1.0 מ"ל של BBTw לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על הנדנדה, לאפשר המדגם להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
  8. חזור על שלב 4.7 שתי פעמים.

.5 Immunostaining

  1. לחסום מדגם ידי הוספת 5% בסרום נורמלי מדולל בBBTw ​​לצינור microcentrifuge. תסיר את החסימה לאחר הנדנדה עבור שעה 1.
    הערה: השתמש בסרום נורמלי מהמין שבו הנוגדנים משני נוצרים.
  2. לדלל נוגדנים ראשוניים לנכס את העבודה ריכוז בפתרון 5% / BBTw סרום נורמלי.
  3. מדגם רוק בO פתרון נוגדן הראשוני / N ב 4 מעלות צלזיוס או לפחות 3 שעות ב RT (כ 22 ° C.
    הערה: פעמים דגירה נוגדן וטמפרטורות עשויות להשתנות. O / N דגירה על 4 מעלות צלזיוס או 3 שעות ב RT הוא בדרך כלל מספיק. עם זאת, תקופת דגירה של יומיים עשויה לשפר את איכות צביעה, במיוחד עם דגימות מבוגרות או כאשר נוגדנים ראשוניים נמוך זיקה משמשים. incubations יותר מבוצע בדרך כלל על 4 מעלות צלזיוס. שיקולים דומים צריכים להיעשות בעת שימוש בנוגדנים משני (ראה 5.10).
  4. לאפשר מדגם להתיישב לחלק תחתון של צינור microfuge. לצייר את נוגדנים ראשוניים עם פיפטה. להציל את הנוגדנים לשימוש חוזר אם תרצה בכך.
  5. לשטוף עם 1.0 מ"ל של BBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר מדגם להתיישב לפני הציור את BBTw עם טפטפת.
  6. הוספת 1.0 מ"ל של BBTw לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על הנדנדה, לאפשר מדגם להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
  7. חזור על שלב 5.6 חמש פעמים.
  8. מדגם בלוק על ידי הוספת 5% בסרום נורמלי פתרון / BBTw לצינור microcentrifuge. תסיר את החסימה לאחר הנדנדה ל30 דקות לשעה 1.
    הערה: צעד חסימה נוסף זו אינה הכרחית, אבל עשויה לשפר את איכות צביעה לנוגדנים ספציפיים.
  9. לדלל נוגדנים משני לנכס את העבודה ריכוז בפתרון 5% / BBTw סרום נורמלי.
  10. לעטוף צינור microcentrifuge בנייר אלומיניום כדי להפחית את הדהיה כתוצאה מחשיפה לאור. מדגם רוק בפתרון נוגדנים משני במשך 12 עד 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס או לפחות 3 שעות ב RT (כ 22 C °.
  11. לאפשר מדגם להתיישב לתחתית צינור microfuge. לצייר את נוגדנים משני עם פיפטה.
  12. לשטוף עם 1.0 מ"ל של PBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר מדגם להתיישב לפני הציור את PBTw עם טפטפת.
  13. הוספת 1.0 מ"ל של PBTw לבקבוקון והרוק. אחרי 5 דקות על הנדנדה, לאפשר המדגם להתיישב ולהסיר PBTw עם פיפטה.
  14. חזור על שלב 5.13 שלוש פעמים.
  15. אופציונאלי: הוסף DAPI מדולל 1: 1,000 בPBTw. מדגם רוק עטוף בנייר אלומיניום למשך 3 דקות; לאחר מכן להסיר את פתרון DAPI עם טפטפת. יש לשטוף חמש פעמים עם 1.0 מ"ל של PBTw, המאפשר דגימה להתיישב לפני הסרת PBTw עם פיפטה.
  16. הוספת 80 - 100 μl של 1,4-diazabicyclo [2.2.2] אוקטן פתרון (DABCO) לצינור microcentrifuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: סוכן אנטי לדעוך מבוסס גליצרול נוסף עשוי להיות תחליף ל.

.6 ניתוח

  1. לפני ההרכבה מדגם על גבי שקופיות, להוסיף תוספת 5 - 10 μl של DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade פתרון לצינור microcentrifuge.
    הערה: לדוגמא ניתן להוסיף לשקופיות ללא נתיחה. לדוגמא הוסיף לשקופית נפח משתנה עם גודל להחליק לכסות. כאשר pipetting מדגם על שקופית, קצה פיפטה עלול להתנתק באמצעות סכין גילוח כדי למנוע גז מדגם. זה בדרך כלל שימושי בשורה המדגם בשורות לניתוח קל. התוספת של PPD כסוכן antifade נוסף לא ייתכן שתידרש, אבל יכולה למנוע photobleaching אם דגימות נשמרות לטווח ארוך.
  2. מניח בעדינות כיסוי הזכוכית להחליק על מדגם. ואז, להחליק את המכסה מאובטח במקום באמצעות לק.
  3. צפה ברכוב מדגם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את היעילות של immunostaining מבוסס sonication בניתוח עוברי בשלב מאוחר וברקמות זחל באתר, עוברי wild-type וזחלים עובדו לimmunostaining של אשכים, השחלות, ורקמה עצבית. דגימות הם צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal ותוצאות נציג מוצגות (איור 1 ואיור 2). תוצאות עולות כי הפרוטוקול המתואר הוא יעיל המאפשר הדמיה תכונות מורפולוגיות, כמו גם תאים בודדים באתר במהלך שלבי התפתחות דרוזופילה מאוחר עובריים דרך מוקדם / אמצע L3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה להצלחת immunostain למקד דרוזופילה עוברית ורקמות זחל באתר, ובכך מבטל את הצורך בנתיחה. לפי פרוטוקולים לפני מכתים עוברים המוקדמים 1,2,3, קרום כוריוני מוסר באמצעות אקונומיקה 50% (NaOCl). דגימות קבועות בפורמלין ומתנול. בגלל ציפורן הזחל גורמת מדגם ישן יותר לצוף, המדגם כולו מועבר דרך תא מסננת, כדי להבטיח שמירת זחל. מדגם מאוחסן, אם תרצה בכך, במתנול כיתה כימית. לאחר התייבשות, תהליך sonication מיושם כהלכה משבש את שלמות ציפורן הזחל. זה קריטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לרות ליהמן וDorthea Godt שעושים חסד סיפק נוגדנים ושה ופקק התנועה. ברצוננו להודות למרכז מניות Bloomington באוניברסיטת אינדיאנה לשמירה על מניות ובלבד ובנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה. אנו מודים לכל החברים במעבדה Wawersik לייעוץ והתמיכה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי מונרו חוקרי גרנט התכנית (לAF וLB) וNSF להעניק IOS0823151 (לMW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טבלה 1: ריאגנטים ומאגרים
מאגר פוספט Triton X-100 (PBTx)עבור 5 ליטר: 500 מ"ל PBS 10X, 4.45 ליטר ddH2O, 50 מ"ל טריטון 10%. אחסן ב-RT.
מי מלח חוצץ פוספט 10X (PBS 10X)עבור 1 ליטר ב-dH2O: 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4. הוסף רכיבים ומלא לנפח המתאים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
טריטון 10%ל-50 מ"ל: 5 מ"ל טריטון, 5 מ"ל PBS 10X, 45 מ"ל ddH2O. רוק לערבוב. אחסן ב-RT.
צינורות PEMS0.1 מ' (pH 6.9), 2.0 מ"מ MgSO<תת>4, 1.0 מ"מ EGTA. אחסן ב-RT.
צינורותל -400 מ"ל של תמיסה של 0.25 מ '(pH 6.9): 30.24 גרם צינורות dH20 NaOH. ממיסים צינורות ב-300 מ"ל dH2O ולאחר מכן התאימו ל-pH 6.9 עם NaOH. הביאו את הנפח הכולל ל-400 מ"ל עם dH2O וחיטוי. אחסן ב-RT.
פורמלדהיד37% פורמלדהיד לפי משקל במתנול. אחסן ב-RT. אחסן תערובת פסולת פורמלדהיד, הפטן ומתנול בכלי אטום היטב במכסה אדים לפני השלכתו בהתאם להנחיות המוסד.
הפטןCAS 142-82-5n-הפטן. אחסן ב-RT. אחסן תערובת פסולת פורמלדהיד, הפטן ומתנול בכלי אטום היטב במכסה אדים לפני השלכתו בהתאם להנחיות המוסד.
מתנולCAS 67-56-1חנות ב-RT. אחסן תערובת פסולת פורמלדהיד, הפטן ומתנול במיכל אטום היטב במכסה אדים לפני השלכתו בהתאם להנחיות המוסד.
מאגר פוספט Tween (PBTw)להכנת 1 ליטר: 100 מ"ל PBS 10X, 890 מ"ל ddH2O, 10 מ"ל Tween 10%. מסנן לעקר לאחר הוספת כל הרכיבים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
טווין 10%עבור 50 מ"ל: 5 מ"ל טווין, 5 מ"ל PBS 10X, 40 מ"ל ddH2O. סלע לערבוב. אחסן ב-RT.
סרום בקר אלבומין/פוספט בופר Tween (BBTw)להכנת 1 ליטר: 100 מ"ל PBS 10X, 890 מ"ל ddH2O, 10 מ"ל טווין 10%, 1 גרם אלבומין סרום בקר (BSA). הוסף BSA ואז עקר באמצעות 0.2 μ M יחידת מסנן ואקום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
סרום עיזים רגיל (NGS)ackson ImmunoResearch Laboratories005-000-121להכנת 10 מ"ל: סרום עיזים רגיל 10 מ"ל ddH2O. הוסף ddH2O לבקבוקון של NGS ועיקר באמצעות 0.2 μ מסנן סירנינג. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
1,4-דיאזאביציקלו[2.2.2]אוקטן (DABCO)CAS: 281-57-9להכנת 100 מ"ל: 25 מ"ל ddH2O, 1 מ"ל Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 גרם מוצק DABCO, 3.5 מ"ל 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 מ"ל גליצרול. בכוס של 250 מ"ל עם מוט ערבוב, הוסיפו ddH2O, Tris HCl ו-DABCO. יש לערבב ולאחר מכן להוסיף 6N HCl, 10 N NaOH וגליצרול. לאחר מכן הוסף 10N NaOH טיפה עד שהתמיסה מגיעה ל-pH 7.5. אליקוט. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD)1.765 מ"ל NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 גרם PPD (CAS: 106-50-3). ממיסים PPD בתמיסת NaHCO3 ו-NaCO3. הוסף 60 μ l של תמיסת PPD ל-500 μ l של DABCO. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
צלחות מיץ תפוחיםלהכנת ~ 200 צלחות: 45 גרם אגר (CAS#9002-18-0), 45 גרם סוכר מגורען (נקנה בחנות), 500 מ"ל מיץ תפוחים (נקנה בחנות), 15 מ"ל Tegosept 10%, 1.5 מ"ל ddH2O. הוסף אגר ל-ddH2O בבקבוק של 4 ליטר ואז חיטוי למשך 30 דקות. מערבבים מיץ תפוחים וסוכר על צלחת ערבוב מחוממת. מוסיפים בהדרגה את תערובת מיץ התפוחים לאגר חיטוי. ערבבו על צלחת ערבוב מחוממת ולאחר מכן הוסיפו נפחים של 10 מ"ל לצלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ והניחו לעמוד ב-RT להתמצקות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Tegosept 10%להכנת 100 מ"ל: 10 גרם Tegosept, 100 מ"ל אתנול. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
משחת~ 50 גרם שמרים פעילים יבשים. מוסיפים בהדרגה ddH2O לכוס המכילה שמרים תוך כדי ערבוב עד לקבלת מרקם דמוי משחה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
טבלה 2: חומרי מכתים
DAPIInvitrogenD35711:1000, מלאי ב-5 מ"ג/מ"ל.
ארנב אנטי-ואסה1:250, מתנה מרות להמן.
עכבר אנטי-פאסיקלין IIIמחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)7G101:10
עכבר אנטי-1B1מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)1B11:4
חזיר גוניה נגד פקק1:2500, מתנה מדורתיאה גודט (Li et al, 2003).
עכבר אנטי-פרוספרומחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)פרוספרו MR1A1:10
עכברים נגד אילבמחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)7EBA101:30
עכבר אנטי-רפומחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)8D121:10
עיזים נגד ארנב Alexa546InvitrogenA110101:500
עז נגד עכבר Alexa488InvitrogenA110291:500
עז נגד חזיר גוניה Alexa633InvitrogenA211051:500
עז נגד חולדות Alexa488InvitrogenA110061:500
טבלה 3: חומרים וציוד
כלובי זבובבעבודת יד; Genesee Scientific Corporationלא ישים; בקבוקים: 32-130; כלוב מוכן מראש: 59-101מיוצר על ידי חיתוך צינורות אקריליק יצוקים שקופים (בקוטר 1 3/4 אינץ') למקטעים בגובה 4 אינץ' עם מסור מצנפת מורכב ב-400 סל"ד. הקרנת נירוסטה עדינה במיוחד (הוצמדה לקצה אחד של האמבטיה עם דבק קומפונד אקרילי. שיטה חלופית המשתמשת בבקבוק מזון זבובים ריק ניתן למצוא ב-Drosophila פרוטוקולים ISBN 0-87969-584-4. ניתן לרכוש כלובים גם מהתאגיד המדעי Genesee.
סוניקטור: ברנסון 250 סוניפיקטור דיגיטליברנסוןדגם: ברנסון סוניפיקטור דיגיטלי 250
סוניפיקטורברנסוןדגם #: 102C (CE)EDP: 101-135-066; S/N: מסנן
מזרקNalgene190-25-200.2 μ m תאית, מסנן ממברנה אצטט
מערכת הדמיה: מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מקור אור מולטיכרומטי, מצלמת CCD דיגיטלית ותוכנת הדמיהמיקרוסקופ: אולימפוס, מקור אור: Lumen Dynamics, מצלמה: Q-Imaging, תוכנת הדמיה: Intelligent Imaging Inc.מיקרוסקופ: BX51 מצויד בדיסק מסתובב DSU, מקור אור: X-Cite 120Q, מצלמה: RETIGA-SRV, תוכנת הדמיה: Slidebook 5.0
יחידת מסנן ואקוםNalgene450-00200.2 μ מסנן ממברנה חנקתית תאית
תמיסת שמרים תנועה OBU06064658 M

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202(2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים