מאמר שיטה

טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

18.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51536

⸱

20 באפריל 2014

 ,  ,  , 
1Department of Food and Environmental Sciences, University of Helsinki, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki

במאמר זה

סיכום

שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

תקציר

טיהור זיקה של חלבוני היתוך סטרפטוקוקוס מתויגים על שרפים נושאים streptavidin מהונדס (סטרפטוקוקוס-Tactin) הפכה לשיטה נפוצה לבידוד של קומפלקסי חלבונים בתנאים פיסיולוגיים. יש חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועדים תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, היתרון של זיקה גבוהה יותר לסטרפטוקוקוס-Tactin בהשוואה לאלו המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, ובכך מאפשרים טיהור חלבון יעילה יותר. עם זאת, יתרון זה קוזז על ידי העובדה שelution של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס עם ביוטין עשוי להיות חלקי, מה שמוביל להחלמה חלבון נמוכה. ההתאוששות ניתן לשפר באופן דרמטי באמצעות elution denaturing עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS), אבל זה מוביל ללדגום זיהום עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו שיטה לפיה tetramer מצמידים שרף של סטרפטוקוקוס-Tactinהוא התייצב לראשונה על ידי קוולנטיים cross-linking עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3) והשרף צולבים וכתוצאה מכך לאחר מכן נעשה שימוש כדי לטהר מתחמי חלבון מטרה בשלב טיהור אצווה אחת. elution יעיל עם SDS מבטיח התאוששות חלבון טובה, ואילו היעדר זיהום סטרפטוקוקוס-Tactin מאפשר ניתוח חלבון במורד הזרם על ידי ספקטרומטריית מסה. כהוכחה של מושג, שאנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור של חלבון נגיפי SIII מתויג VPG-Pro מגרעינים של נ 'נגוע בנגיף צמחי benthamiana באמצעות שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים עם BS3. אותו הפרוטוקול יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין ולאפיין השותפים המחייבים הפיסיולוגיים שלו.

מבוא

בשנים האחרונות, טכנולוגית סטרפטוקוקוס התג הפכה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר ביו, כוללים פרוטאומיקה וביולוגיה מבנית. טכנולוגיה זו חלבון הטיהור, אשר מסתמכת על השילוב של חלבונים רקומביננטי לפפטיד סטרפטוקוקוס תג קצר, התבגרה עם כניסתו של מטריצות זיקה נשאו סטרפטוקוקוס-Tactin, גרסה מהונדסת גנטי של streptavidin עם קיבולת מחייב-peptide משופרת. 1, 2 חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועד תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, תערוכת זיקה גבוהה יותר עבור מטריצות סטרפטוקוקוס-Tactin מאלה המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, מה שמבטיח טיהור יעילה יותר של החלבונים רקומביננטיים ו שותפיהם הקשורים המחייבים. עם זאת, הזיקה גבוהה יותר של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס לסטרפטוקוקוס-Tactin יש גם החסרון שלה. elution התחרותי של כגון חלבונים עם ביוטין העודף עשוי להיות חלקי, מה שמוביל לירידה בתשואה של חלבון מטרה. מ 'חלופת עפרות יעילה היא elution עם SDS, אבל זה מוביל לזיהום מדגם לא רצוי עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic. מאמר זה מציג טכניקה כדי להתגבר על מגבלה זו על ידי הייצוב הראשון tetramer מצמידים השרף של סטרפטוקוקוס-Tactin ידי cross-linking הכימי ולאחר מכן באמצעות SDS לelute חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס ומתחמים הקשורים בם מהשרף צולבים וכתוצאה מכך. לפיכך, תשואת חלבון מספקת יכולה להיות מושגת ללא זיהום מדגם עם סטרפטוקוקוס-Tactin, ובכך לאפשר ניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה.

השיטה מתאימה לטיהור של כל חלבון היתוך רקומביננטי עם משטח חשוף SIII תג 3 או תאום סטרפטוקוקוס תג (WSHPQFEK רצף חומצות אמינו (GGGS) 3 WSHPQFEK וSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, בהתאמה). החלבון יכול להיות מ, חיה או צמח מקור חיידקים ויכול להיות מבודד משני תאים בסך הכלlysate או שבריר אברון מועשר. כדוגמא, אנו מתארים כאן הטיהור של חלבון SIII מתויג VPG-Pro של וירוס תפוחי אדמה (PVA) 4 מהחלק הגרעיני של צמחי benthamiana Nicotiana נגועים ב-PVA. שבריר הגרעיני היה מבודד כפי שתואר בעבר 5, בשינויים הבאים: תאים לא טופלו בפורמלין, בוטיראט נתרן הוחלף בכל המאגרים עם פלואוריד הנתרן 5 מ"מ, מעכבי פרוטאז שלמים הוחלף עם PMSF, בחילוץ טריטון X-100 ריכוז חיץ # 2 הונמך ל0.3% (v / v) והגלולה הגרעינית שהושגה על ידי צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז (# חיץ חילוץ 3) הייתה מושעה ב1.45 מיליליטר של חיץ מחייב טרום צונן ומסובב ל1.5 שעות ב 4 ° C. התמצית הגרעינית וכתוצאה מכך המכילה חלבון הפיתיון מתויג-SIII ומתחמים קשורים (מדגם חלבון פיתיון) הייתה מעובד על פי הפרוטוקול המפורט להלן (ראה סעיף 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Cross-linking של סטרפטוקוקוס-Tactin Polymethacrylate שרף עם Bis (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

  1. לאזן microtube אטום אחד המכיל 2 מ"ג BS3 צולב מקשר לטמפרטורת חדר. זהירות: BS3 הוא חומר מסוכן. יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן.
  2. שרף polymethacrylate resuspend סטרפטוקוקוס-Tactin (השעיה 50% ב100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) על ידי קצר נמרץ רועד ולהעביר 600 μl של ההשעיה באופן מיידי לעמודת ספין באמצעות פיפטה קצה עם הסוף נותק.
  3. צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך ולהוסיף 450 μl של בופר פוספט (PBS) לעמודה.
  4. חזור על השלב הקודם 2 יותר פעמים כדי להחליף לחלוטין את חיץ טריס עם PBS ולהשאיר את השרף ב430 μl של PBS מותאם pH 8.0 לאחר צנטריפוגה שעברה.
  5. לנקב את נייר הכסף של microtube עם BS3 עם קצה פיפטה מכיל 1001; ליטר של מים ultrapure. ממיסים את אבקת BS3 במים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהוסיף מייד 20 μl של הפתרון לעמודת הספין. הריכוז הסופי של BS3 בתגובת cross-linking הוא ~ 1.2 מ"מ.
  6. סובב את העמודה ל30 דקות בטמפרטורת חדר. בדוק שהשרף הוא מעורב כראוי עם פתרון BS3.
  7. כדי להרוות את התגובה, להוסיף 6 μl של 3M טריס-HCl, pH 7.5 ולסובב את העמודה במשך דקות 15 אחר בטמפרטורת חדר.
  8. צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך וresuspend השרף צולבים ב450 μl של טריס שנאגרו מלוח עם Tween 20 (TBST). חזור צנטריפוגה ולשטוף מדרגות שתי פעמים נוספות. בשלב האחרון, resuspend השרף ב450 μl של TBS.
  9. מעביר את ההשעיה השרף לצינור טרי באמצעות קצה פיפטה עם הסוף נותק. Resuspend השרף עזב בעמודה עם עוד 450 μl של TBS ולהעביר לאותו צינור. ה חזורדואר השלב אחרון פעם נוספת כדי להבטיח העברה מקסימלי של השרף מהעמודה לצינור.
  10. בואו הצינור לעמוד 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהתאים את עוצמת הקול ל600 μl ידי הסרת TBS העודף. השרף מוכן לשימוש מיידי (המומלץ) או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, ללא הקפאה.

2. עקידת חלבון הפיתיון מתויג-Twin-סטרפטוקוקוס וAssociated מכלולים לסטרפטוקוקוס-Tactin Polymethacrylate שרף הצולב

  1. צנטריפוגה 1 מיליליטר של מדגם חלבון פיתיון בחיץ מחייב ב17,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
  2. כדי למזער מחייב של חלבוני biotinylated אנדוגני לשרף סטרפטוקוקוס-Tactin, להוסיף avidin לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולסובב ל15 דקות ב 4 ° C.
    1. אם השרף צולבים משלב 1.10 היה מאוחסן במשך תקופה ארוכה של זמן ב 4 ° C, לאסוף את השרף על ידי צנטריפוגה ב XG 400 עבורדקות r 1 ב 4 ° C, להשליך supernatant ולשטוף את השרף עם 1 מיליליטר של TBST. חזור צנטריפוגה ולשטוף על שלבים עוד פעמיים, תחילה עם TBST ולאחר מכן עם TBS. צנטריפוגות הצינור ב XG 400 דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס ולהתאים את הנפח המקורי על ידי הסרת TBS העודף.
  3. Resuspend שרף סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים על ידי vortexing. מייד להוסיף 50 μl של ההשעיה השרף לצינור המכיל מדגם חלבון פיתיון באמצעות פיפטה קצה לחתוך ולסובב ל30 דקות אחרת ב 4 ° C.
  4. בזמן ההמתנה, להגדיר thermomixer ל55 ° C ומחמם 500 μl של חיץ elution לשימוש בשלב 3.1.
  5. צנטריפוגה ב XG 400 דקות 1 ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף את השרף על הכתף במשך 5 דקות ב 4 ° C עם 1 מיליליטר של חיץ לשטוף טרום צונן # 1. חזור צנטריפוגה ולשטוף מדרגות שלוש פעמים. בשלב האחרון, resuspend השרף ב250 μl של חיץ לשטוף # 2.
  6. Tr ansfer ההשעיה השרף לעמודת ספין טרי. Resuspend השרף שנותר בצינור בעוד 250 μl של חיץ לשטוף # 2 ותעביר לאותה העמודה.
  7. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך זרימת הדרך ולהעביר את העמודה לצינור מיליליטר טרי דולפין האף 2. פנה מייד לצעד elution להלן.

3. Elution של קומפלקסי חלבונים ספציפיים

  1. הוסף 150 μl של חיץ elution שחומם מראש מצעד 2.4 לעמודת הספין.
  2. דגירה בthermomixer 5 דקות ב55 ° C, רועד ב1,400 סל"ד.
  3. צנטריפוגה ב 1,500 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. מחק את העמודה ולאחסן את חלבוני היעד המטוהרים ב≤ -20 ° C.
שנאגרו מלוח פוספט (PBS)
Na 2 HPO 4 10 מ"מ
KH 2 PO 4 2 מ"מ
NaCl 137 מ"מ
KCl 2.7 מ"מ
pH מותאם 7.4 אלא אם צוין אחרת (pH 8.0 בסעיף 1.4)
טריס שנאגרו מלוח (TBS)
טריס-HCl, pH 7.4 50 מ"מ
ght = בסגנון "20" "גובה: 20px; רוחב: 299px;" => NaCl 150 מ"מ
טריס שנאגרו מלוח עם Tween 20 (TBST)
טריס-HCl, pH 7.4 50 מ"מ
NaCl 150 מ"מ
Tween 20 0.1% (v / v)
חיץ מחייב
טריס-HCl, pH 8.0 25 מ"מ
NaCl
NAF 5 מ"מ
EDTA 0.5 מ"מ
גליצרול 10% (v / v)
PMSF 0.1 מ"מ
לשטוף חיץ # 1
טריס-HCl, pH 8.0 25 מ"מ
NaCl 500 מ"מ
NAF td> 5 מ"מ
EDTA 0.4 מ"מ
Igepal CA-630 0.2% (v / v)
גליצרול 5% (v / v)
PMSF 0.1 מ"מ
לשטוף חיץ # 2
טריס-HCl, pH 8.0 25 מ"מ
NaCl 150 מ"מ
טריס-HCl, pH 8.0 25 מ"מ
SDS 1% (w / v)
0 "> x; "> 550 מ"מ "Style =" 2 "height =" 20 גובה: 20px; רוחב: 597px; "> חיץ Elution

טבלת 1. Buffers השתמש במחקר הנוכחי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הליך הטיהור מודגם באופן סכמטי באיור 1, יחד עם ייצוג של בעיות הקשורות לשיטות טיהור קיימות אחרות.

figure-results-1
איור 1. ייצוג סכמטי של הליך הטיהור. זרימת העבודה כוללת ייצוב של tetramer סטרפטוקוקוס-Tactin מצמידים השרף באמצעות קוולנטיים cross-linki...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול לעיל יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון פיתיון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין והמכלולים הקשורים אליו בכל חיץ מתאים שאינו מכיל ביוטין או denaturants החזק. בגרסה הנוכחית של הפרוטוקול, כריכה ושטיפה מבוצעת בתנאים מחמירים יחסית בנוכחות מלח גבוה וחומרי ניקוי שאינו יוניים. למרות שזה תוצאות פחות רקע, קומפלקסי חלבונים שבירים יכולים לנתק בתנאים אלה. כדי לשמר מתחמי זיקה נמוכים יותר כגון, ריכוז מלח עשוי להיות הוריד וחומר הניקוי nonionic עשוי להיות מופחת או הושמט ממחייב ולשטוף מאגרים. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

אנו בתודה להכיר תמיכה הטכנית של סיני Miettinen, מינה Pöllänen וטארו Rautavesi. אנו מודים הלקינו Nurkkala למתן HEK 293 תאים להביע GFP-tagged תאום סטרפטוקוקוס וPekka evijarvi לאספקת ציוד הקלטת קול. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, להעניק מספרים 138,329, 134,684 ו258,978.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), פורמט ללא שקילה, 8 x 2 מ"גPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com זהירות: חומר מסוכן. גורם לגירוי חמור בדרכי הנשימה, בעור ובעיניים. ללבוש כפפות מגן והגנה על העיניים.
שרף Strep-Tactin MacroPrep (50% השעיה)IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
מסנן צינור צנטריפוגה Spin-X, קרום אצטט תאית, גודל נקבוביות 0.45 μ m, לא סטריליCostar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
צינורות אף דולפיןCostar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
>Avidin רשות השידור2-0204www.iba-lifesciences.com

מקורות

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Twin Strep tagBS3SDSVPg ProN benthamiana

מאמרים קשורים