פרוטוקול זה נועד להדגים שיטת חשיפה של תרביות תאים לכימיקלים רעילים בשאיפה. חשיפה של ממשק אוויר נוזלי מובחן תרבויות (עלי) של תאי אפיתל דרכי הנשימה מספקת מודל ייחודי של חשיפת דרכי הנשימה לגזים רעילים כגון כלור. בכתב יד זה אנו מתארים השפעה של חשיפת כלור בתרבויות ממשק אוויר הנוזלי של תאי האפיתל ותרבות שקועה של שריר לב. במבחנה מערכות חשיפה לאפשר מחקרים מכניסטית חשובים להעריך מסלולים כי אז יכול להיות מנוצל כדי לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרביות תאים הן הכרחיות כדי לפתח ולחקור את היעילות של סוכנים טיפוליים, לפני השימוש בם במודלים של בעלי חיים. יש לנו את היכולת הייחודית למודל תאי אפיתל דרכי הנשימה האנושית ושריר לב מובחנים היטב. זה יכול להיות כלי רב ערך כדי לחקור את ההשפעות המזיקות של כימיקלים רעילים בשאיפה, כגון כלור, שיכולים בדרך כלל אינטראקציה עם משטחי התאים, ויוצרים תוצרי לוואי שונים על מגיב עם מים, ולהגביל את ההשפעות שלהם בתרבויות מתחת למים. המודל שלנו באמצעות תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות היטב בממשק אוויר liqiuid עוקף מגבלה זו, כמו גם מספק הזדמנות להעריך מנגנונים קריטיים של רעילות של כימיקלים בשאיפה רעילים פוטנציאליים. אנו מתארים אובדן משופר של שלמות קרום, שחרור caspase ומוות על כימי בשאיפה רעילה כגון חשיפת כלור. במאמר זה, אנו מציעים שיטות למודל חשיפת כלור בלב של יונקים ודרכי הנשימה אפיתל גאמות בתרבות ובבדיקות פשוטות כדי להעריך את השפעתה על אלו סוגי תאים.
מבוא
חשיפה לכימיקלים בשאיפה רעילה (טיקים) / גזים כגון כלור (Cl 2) נשארה דאגה לבריאות מתמשכת בחשיפה מקרית, כמו גם בשימוש בם פוטנציאל כסוכן איום כימי. למרות הריאות הן היעד העיקרי, איברים כמו לב ומוח מושפעים גם 1-3. בvivo מודלים משמשים בדרך כלל לבדיקת רעילות מטיקים, אבל במבחני חוץ גופית להערכת רעילות הם פשוט יותר, מהיר יותר וחסכוניים יותר. ב מבחנה מודלים גם לאפשר חקירה מקיפה של אינטראקציות סוכן תאים שעלולות להיות קשה להעריך in vivo. במבחנה מערכות חשיפה כזו הן נדירות ויותר מכך, בחלק מהדגמים קונבנציונליים שבו חומרים רעילים נוספים למדיום התרבות שבו תאים שקועים, את המאפיינים של הסוכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבויות העכברוש Cardiomyocyte
- כל הניסויים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, IACUC.
- השג שריר לב חולדה מהלב (חדרים) של חולדות זכרים (240-260 ז) תוך שימוש בשיטות שתוארו קודם לכן 4. בקצרה, להרדים בעלי חיים באמצעות זריקת intraperitoneal של pentobarbital (100 מ"ג / קילוגרם; לאשר הרדמה בשיטת קמצוץ הבוהן) ולאחר מכן להסיר את לב ל10.0 מיליליטר, 1 מ"מ Ca המכיל חיץ קרבס רינגר, pH 7.4 2 +.
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שריר לב בצורת מוט עיקרי לצרף במטריצות laminin והתפשט ולהתמיין לתרבויות מחוברות (איור 1 א והבלעתה). תאים אלה מתאפיינים נוספים על הבסיס אקטין sarcomeric וביטוי SERCA2 (איורים 1B ו 1C). שריר לב חולדה הוא רגיש מאוד להרעלת כלור כ15 חשיפת דקות ל100 כלור עמודים לדקה נגרם עיגול תא נרחב ומוות בתרבויות שקועות ושיבוש שכבות מחוברות על תאים שגודל בקרומי laminin מצופים (1D איור). גם שם היה משופר מוות של תאים אפופטוטיים כפי שצוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הסוג הנפוץ ביותר של חשיפות רעילות אקוטיות מתרחש כאשר אחד נושם כימי רעילה לריאות. כימיקלים אלו יכולים גם להיות שנלקחו במהירות במחזור הדם ועלולים להשפיע על איברים אחרים כגון מוח ולב. רעילות שאיפה של סוכנים שונים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים נלמדות ודווחה בהרחבה, לעומת זאת המנגנונים הם הבינו פחות טובים. זהו מכשול מרכזי בפיתוח טיפולים יעילים. היעדר במבחנה מערכות חשיפה הוא סיבה העיקרית מאחורי חוסר תובנות מכניסטית. כאן אנו מתארים מודלים תרבית תאים של שריר לב ודרכי נשימה כדי ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי התכנית לנטרל, המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), משרדו של המנהל, והמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) גרנט מספר U54 ES015678 (CWW). SA נתמך גם על ידי בית החולים לילדים בית הספר למכרות שיתוף הפעולה G0100394 # טייס פרס ו# G0100471 החולים קולורדו "מכון מחקר פיילוט פרס לילדים קולורדו / קולורדו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברושים | מעבדות הרלן | ספראג-דולי | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| כלור | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| ערכת Caspase 3/7 | Promega | G8091 | |
| אלקטרודה וולטוהוממטר אפיתל וצ'ופסטיק | מדויקים בעולם | EVOM ו- STX2 | |
| Snapwell מוסיף | קורנינג | 07-200-708 | |
| מסננת תאי ניילון 70 מיקרון | קורנינג | #352360 | |
| תאי הכלה ביולוגית של פוליסולפון | BCU, ציוד כלוב אלנטאון | BCU | |
| DMEM | Life טכנולוגיות | 12491-015 | |
| נוגדן אקטין סרקומרי | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| נוגדן SERCA2 | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 | נוגדן Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| נוגדן משני מצומד Alexa 488 | Invitrogen, גרנד איילנד, ניו יורק | A11029 | |
| BSA | סיגמא-אולדריץ' | A9418 | |
| קרניטין | סיגמא-אולדריץ' | C0283 | |
| טאורין | סיגמא-אולדריץ' | T8691 | |
| קריאטינין | סיגמא-אולדריץ' | C6257 | |
| קרבס רינגר מאגר | סיגמא-אולדריץ' | K4002 | |
| פרוטאז | סיגמא-אולדריץ' | P5147 | |
| קולגנאז | סיגמא-אולדריץ' | C6885 | |
| DNAase | סיגמא-אולדריץ' | DN-25 | |
| תמיסת רינגר לקט | Abott Laboratories | 7953 | |
| סרום חמור | פישר סיינטיפיק | 017-000-001 | |
| PBS, מי מלח חוצץ פוספט | סיגמא-אולדריץ' | D1408 | |
| 4-15% ג'ל SDS-PAGE | Bio-Rad | 456-1083 | |
| ממברנת ניטרוצלולוזה | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | ערכת זיהוי פרוקסידאז Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Pierce | 3402 | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| מדיית הרכבה, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| נתרן ציטראט | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| קולגן | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | סיגמא-אולדריץ' | M8028 | |
| למינין | BD מדעי הביולוגיה | 354259 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | טכנולוגיות חיים | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
מקורות
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
