מאמר שיטה

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

DOI:

10.3791/51581

⸱

4 בפברואר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר שיטה מפורטת לבידוד ואפיון של תאי סרטן שחלות ראשוניים מדגימות קליניות מוצקות. דגימות קליניות בסרטן השחלות חשופים לעיכול אנזימטי לקבל סרטן קיימא, ללא פיברובלסטים אפיתל השחלות תאים (EOC) מתאים במיוחד עבור יישומים במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלים אמינים לחקירת ייזום סרטן השחלות ואת ההתקדמות נחוצים בדחיפות. בעוד שהשימוש בשורות תאי סרטן השחלות נשאר כלי רב ערך להבנת סרטן השחלות, יש השימוש בם מגבלות רבות. אלה כוללים את חוסר ההטרוגניות והשפע של שינויים גנטיים הקשורים passaging הממושך במבחנה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת להקמה מהירה של תאי סרטן שחלות ראשוניים ליצור דגימות קליניות מוצקות שנאספו בזמן הניתוח. השיטה מורכבת מהכפפת דגימות קליניות לעיכול אנזימטי ל30 דקות. ההשעיה התא בודדת מותרת לגדול ויכולה לשמש ליישומים במורד הזרם, כולל הקרנת סמים. היתרון של שורות תאי סרטן השחלות עיקריות על שורות תאי סרטן השחלות הוקמו הוא שהם מייצגים את הדגימות הקליניות הספציפיות המקוריות הם נגזרים וניתן להפיק מן האתרים שונים אם פרימהסרטן השחלות ר"י או גרורתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות השכיחות הנמוכה יחסית שלה, סרטן השחלות הוא הקטלני ביותר של מחלות גינקולוגיות והגורם המובילים החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים 1,2. זאת, בעיקר בשל המחסור בכלים אמינים ומודלים שנאמנו לסכם ייזום והתקדמות המחלה 3. רוב הידע שלנו היום על סרטן השחלות היה אפשרי באמצעות השימוש בתאים הונצחו השחלות אפיתל פני השטח (IOSEs), שורות תאי סרטן השחלות וסרטן השחלות תאים ראשוניים התאוששו מ4-7 הנוזלים הרעיל. למרבה הצער, יש לו השימוש בם מספר מגבלות, כולל מספר השינויים הגנטיים ופנוטיפי הקשורים בתהליך הנצחה או במעברי מבחנה וההטרוגניות של האוכלוסייה כתוצאה מהכנת נוזלים רעילה.

לכן, תאי סרטן השחלות עיקריים הנגזרים מדגימות מוצקות לזיהוי והספציפיים של סרטן השחלות מייצגים uniquכלי דואר לחקר התפתחות סרטן השחלות.

הקשיים העיקריים המעורבים בתאים הממאירים אלה קבלת הם תוצאה של צמיחת יתר של תאי סטרומה או fibroblasts יחד עם הפסד של כדאיות וחוסר המוקדם של יכולת שגשוג בתרבות של תאי EOC אלה. כמה שיטות ליצירת תא בודד השעיות מגידולים מוצקים קיימות כיום, באמצעים מכאניים או ניתוק האנזימטית, לעומת זאת טכניקות מסוימות להניב כמות גדולה יותר של התוצאה המועדפת 8. כאן, אנו מראים כי עיכול אנזימטי עם dispase השני תוצאות בהתאוששות יעילה של תאי EOC קיימא, ללא פיברובלסטים. תרבויות EOC מה שהושגו הן רגישות מאוד למניפולציה גנטית ושימושיות גם בבדיקות סמים, מצביעים על כך שתרבויות EOC אלה מתאימות ליישומים רבים במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה
דגימות מוצקות של סרטן השחלות התקבלו ממתקן אוניברסיטת מינסוטה רכש רקמות (TPF) לאחר מוסדי מועצה לביקורת הוועדה: אישור דירקטוריון הסובייקט אנושי (IRB).

1. התקנה מגיב

  1. להכין מדיום DMEM שלם על ידי השלמת DMEM עם 10% FBS, ו100 יחידות פניצילין, סטרפטומיצין. אחסן את המדיום על 4 מעלות צלזיוס וחמה 37 מעלות צלזיוס לפני שימוש.
  2. dispase aliquot השני באמצעי אחסון נפרד של 5-10 מיליליטר, כדי למנוע הקפאה מרובה מפשיר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במקפיא ללא nonfrost.

2. אוסף רקמות

  1. לאסוף דגימות מוצקות של סרטן השחלות (~ 5 גרם בגודל) בזמן הניתוח מאזורי macroscopically זוהו כסרטן על ידי פתולוג. דגימות הקליניות מזוהה דה ונרשמו על פי פרוטוקולים מוסדיים.
  2. הנח דגימות בסטרילי, scהמכסה REW, פוליפרופילן דגימות מיכל מלא ב30 מיליליטר של PBS קר כקרח. להעביר את הדגימות מהמעבדה לפתולוגיה כירורגית למעבדת המחקר לעיבוד על קרח, ובתוך 30 דקות מאיסוף דגימה (איור 1).

3. עיבוד רקמות

  1. עבודה בתנאים סטריליים, להעביר את הדגימות על צלחת פטרי (60 מ"מ x 60 מ"מ) המכיל 10 מיליליטר של PBS הטרי קר כקרח, ובאמצעות סכין סטרילי גילוח, לחתוך יותר לתוך החתיכות אפשריות (2 מ"מ או פחות) הקטנות ביותר ( 2A דמויות ו2 ב ').
  2. העבר את הרקמות טחונות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל 10 מיליליטר של prewarmed (37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות) dispase השני (2.4 U / ml) בDMEM ולדגור על 5% CO 2 ו37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי להבטיח עיכול מיטבי של הדגימות, להתסיס ידני תרחיף התא כל 5 דקות.
  3. לאחר 30 דגירה דקות, העברה (באמצעותפיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר) תרחיף התאים על גבי מסננת תא (70 רשת מיקרומטר) ממוקם על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהחיל לחץ עדין נגד הרשת באמצעות בוכנת מזרק. לבטל את כל רקמת undissociated (שנותרה בחלק העליון של הרשת) ולאסוף את ההשעיה התא שהושגה בצינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב320 XG במשך 7 דקות ב 4 ° C (איור 3).
  4. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS.
  5. דגירה ההשעיה התא בצלחת פטרי ב 5% CO 2 ו37 ° C (איור 4).
  6. שינוי הבינוני לאחר 24 שעות מהציפוי הראשוני. זה מאפשר להסרת פסולת הסלולר ורוב אריתרוציטים הווה בתרבות.
  7. לשנות את המדיום כל שלושה ימים בשבועיים שלאחר מכן, לאחר שהתרבויות של EOC העיקרי מוכנות ליישומים במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות קליניות טריות של סרטן השחלות נאספות לאחר הניתוח (איור 1) וחותכים לחתיכות קטנות (2A דמויות ו2B) המהוות את תרחיף התא. זה מאפשר חשיפה אופטימלית של הדגימות לטיפול אנזימטי. תרחיף תא חשוף לעיכול אנזימטי וטופחו על C ° 37 ל30 דקות. במהלך זמן הדגירה slurry הופך עכור יותר ויותר (במיוחד לאחר כל תסיסה) וזה סימן של disaggregation רקמות. בסוף זמן הדגירה, התרחיף מועבר על גבי מסננת תא להפריד תאי EOC מכל רקמת undissociated (איור 3). ההשעיה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנה טובה יותר של האטיולוגיה סרטן השחלות ופיתוח היא חיונית לשיפור התוצאות של נשים מושפעות מהמחלה ההרסנית הזאת. בהקשר זה, השימוש בהוקם ו" זמין מסחרי "שורת תאי סרטן השחלות הייתה ללא ספק שימושית מאוד. עם זאת, היום אנחנו יודעים ששורות תאי הסרטן אינן נציג של הגידול האנושי הם מקורם בהיבטים רבים, כולל חוסר ההטרוגניות 9,10.

כאן אנו מדווחים שיטה מהירה ואמינה לבידוד ותרבית של תאי סרטן שחלות ראשוניים יש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לצוות של מתקן רכש רקמות של אוניברסיטת מינסוטה לקבלת סיוע באיסוף דגימות רקמת מטופל. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית משרד ההגנה חקר סרטן השחלות (OCRP) OC093424 לMB, על ידי מחקר רנדי מכונת גילוח למלחמה בסרטן והקרן הקהילתית לMB, על ידי השחלות הברית למלחמה בסרטן מינסוטה לMB ועל ידי הקרן לגינקולוגיה אונקולוגיה המחלקתית לייט. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBS, סטרילי Invitrogen14190-144
מכסה בורג, מיכל דגימת פוליפרופילן, סטריליThermo Scientific02 1090
DMEM בינוני, סטרילי Invitrogen11995-065
סרום בקר עוברי,Thermo Scientific HycloneSH30396.03
100x פניצילין-סטרפטומיצין, נוזליInvitrogen15140-122
Dispase II, סטריליRoche04942 078 001
מלקחיים קטנים בעלי קצה דק ולהב אזמל,של פישר סיינטיפיק08-953E, להבים: 08-927-5D
מספריים קטנות לניתוח, סטריליפישר סיינטיפיק08-945
15 מ"ל צינורות עם מכסה חרוטי , בז BD סטרילי352097
50 מ"ל צינורות עם מכסה חרוטי סטריליFalcon352027
10 מ"ל פיפטה סרולוגית, סטרילי קורנינג13-678-11E
בוכנת מזרק 6 מ"ל, סטרילית מסנן ניילון Tyco Healthcare8881516911
(70 μ m ) מסננת תאים, סטריליתBD Falcon352350
5 ס"מ צלחת פטרי, סטרילית קורנינג430166
צלחת פטרי 10 ס"מ, סטרילית קורנינג430167
סטרילי מלקחיים סטריליים : BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים