מאמר שיטה

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

DOI:

10.3791/51595

⸱

17 ביוני 2014

 , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה הוא מודל חשוב להבין את התא וביולוגיה מולקולרית של איבר והתחדשות סרח. עם זאת, אסטרטגיות מולקולריות להעסיק גנטיקה הפוכה עדיין לא פותחו במידה מספקת כדי להעריך את תפקוד גן בהתחדשות או הומאוסטזיס רקמות בשלבי זחל אחרי עובר דג הזברה, וכמה רקמות בתוך זחל דג הזברה הן קשות להתמקד. זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי להציע שיטה חלופית לחוסר היכולת הנוכחית למקד genomically גנים דג הזברה באופן temporally מבוקר בשלבים האלה. שיטה זו מאפשרת לפיזור מלא ושילוב הבא של morpholino לרקמות שונות בגוף, כוללים מבנים שהיו בעבר בלתי אפשריים להגיע כגון אלה בסנפיר הזנב הזחל, מבנה המשמש לעתים קרובות כדי לחקור התחדשות רקמות noninvasively. מספר גנים מופעלים במהלך רגנרציה finfold זחל גם presenלא בהתחדשות רקמות חוליות מבוגרים, ולכן הזחל הוא מודל שימושי כדי להבין התחדשות במבוגרים. שיטת פיזור morpholino זה מאפשרת זיהוי קל ומהיר של גנים הנדרשים להתחדשות של רקמות זחל כמו גם תופעות פיסיולוגיות אחרות המסדירות הומאוסטזיס רקמות אחרי העובר. לכן, שיטת מסירה זו מספקת אסטרטגיה דרושה כעת לשליטה זמנית להערכה של תפקוד גן אחרי העובר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחדשות של איברים ואיברים חשובה ביסודו להישרדות ולכושר; עם זאת, כמה בעלי חוליות, כולל אדם יש יכולת מוגבלת רגנרטיבית. בעוד כמה מודלים של בעלי החיים קיימים שיש להם יכולת התחדשות נרחבת, להפוך טכניקות גנטיות על מנת להעריך את תפקוד גן באיברים והתחדשות סרח יישאר מוגבל מאוד או לא קיימים. לכן, גישות חדשות נדרשות כדי לנתח את הביולוגיה המולקולרית של התחדשות באורגניזמים המודל הבאים.

דג הזברה היא מודל מבוסס היטב להבנת התא וביולוגיה מולקולרית של איבר ואיבר התחדשות 1, לא רק בגלל היכולת שלו המשמעותית להתחדש איברים מרובים, רקמות ואיברים, אלא גם משום שכמה קווי דגים מהונדסים קיימים כדי לעקוב אחר תאים ו לביטוי יתר גן בונה 2, 3. עם זאת, עיכוב גן בדג זברת זחל מוגבל בעיקר לoverexpression של מבנים דומיננטיים שליליים, שאינם זמינים לכל הגנים של עניין או transgene שהמוצר יכול לרכוש השפעות לזכות-of-פונקציה שאינו משקפות את פעילות אנדוגני של הגן. לפיכך, יש צורך בשיטה חלופית כדי להסיר ביטוי גנים ספציפי בנוקאאוט או מציאה כדי להתגבר על בעיות אלה.

גן ספציפי מיקוד באמצעות TALENS קיים כאמצעי גנטי הפוך למפסיד יוצא, תפקוד גן; עם זאת, אסטרטגית נוקאאוט הזה היא לעתים קרובות מאוד מוגבל להערכות תפקודיות בעובר מוקדם, כי דרישות ראשוניות של הגן למנוע התקדמות נוספת של התפתחות עוברית. לפיכך, חקר תופעות מאוחר יותר כגון התחדשות או הומאוסטזיס איברים לאחר פיתוח באמצעות TALENS מנועה 4, 5. לכן, יש צורך באסטרטגית הסרת גן חלופית, כי מטרות תפקוד גן אחרי התפתחות מוקדמת להעריך את הדרישות של גנים באיברים ומבנים שהוקמו באופן מלא.

Morpholino הזרקה הוכח כיעילה במיקוד גנים בכמה איברים בוגרים והמבוגרים התחדשות 6-8 סנפיר, אך שיטות אלו דורשות electroporation ורבים איברים פנימיים קשים electroporate או בשל מיקומם או בשל רגישותם לחשמלית הפרעה. יתר על כן, כמה רקמות בזחל קשות להזריק ישירות, כי הזרקה ישירה עלולה לשבש את השלמות המבנית שלהם או בגלל הגודל שלהם הוא מגבילה. סנפיר הזנב של הזחל הוא מבנה אחד כזה, כי הזרקה ישירה לתוך finfold אינה אפשרית. לפיכך, חלופה לelectroporation והזרקה ישירה הייתה צורך למקד גנים ברקמות שגם הם קטנים מדי כדי להזריק או שלא ניתן electroporated.

על מנת למקד ומעכבים את הפונקציה של גנים ספציפיים במהלך ההתחדשות של סנפיר הזנב הזחל, יש לנו שונה בטכנולוגיות קיימות מאפשר morpholinossessment של תפקוד הגן במהלך רגנרציה של סנפיר הזנב בזחל מבוים המאוחר. שיטה זו מעסיקה משלוח תוך חדרי 9 של morpholinos העמסה-מתויג יחד עם מגיב transfection Endo-פורטר 10. פעם אחת בחדר, את תערובת morpholino-Endo-פורטר מתפשטת במהירות ברחבי הזחל דרך כלי הדם ונכנסה רקמות שהיו בלתי אפשרי בעבר להתמקד. שיטת הזרקה זו עשויה להיות שונה כדי למקד גנים ברקמות ספציפיות וייתכן בהחלט ניתן ליישם במודלים של בעלי חיים אחרים, כי כרגע אין לי שיטות גנטיות הפוכה כדי לעכב את תפקוד גן. לכן, היא מציעה שיטה מהירה וקלה עם הפוטנציאל לשימוש מגוון רחב ללמוד באופן מיידי את תפקוד גן במהלך הומאוסטזיס כללי איבר והתחדשות בשלבי זחל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מחטי הזכוכית (איור 1)

  1. השתמש בנימי זכוכית בקוטר 0.75 מ"מ להכין מחטי הזרקה (איור 1 א).
  2. הנח את נימי הזכוכית לתוך חולץ מחט ולמשוך את המחט עם הפרמטר הבא: ערך מחזור חימום: 463; משיכת ערך מחזור: 230; מהירות: 150 אלפיות השניים; זמן: 150 אלפיות שני (איור 1).
  3. לשבור את זכוכית משך נימים עם פינצטה שען כדי לייצר מחט בקוטר 20 מיקרומטר תחת stereoscope עם עינית מיקרומטר.
  4. השתמש מחרטה עם גלגל מסתובב גומי רטוב כדי לחדד את המחט ולייצר 20 מיקרומטר הטיה (1C דמויות ו1D). הערה: שארפ, מחטים משופעות לשפר את הקלות של כניסה לתוך החדר ובכך למזער את הנזק לרקמות ולאפשר לשרירים המחוררים כדי לחתום מחדש לאחר הסרת המחט (איורים 1E-G).

2. Preparע פתרון morpholino

  1. הכן את מניית morpholino ידי המסת morpholino lyophilized ב1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) לריכוז סופי של 7.5 מ"מ. [ראה את הוראות יצרן לפרטים (טבלת חומרים)].
  2. הכן את פתרון הזרקת morpholino על ידי ערבוב של פתרון מניות morpholino 2.5 μl (7.5 מ"מ) עם פתרון 2.8 μl Endo-פורטר המניה (1 מ"מ) (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 3.5 morpholino מ"מ ו0.5 מ"מ Endo-פורטר.

3. הכנת הזרקת morpholino (איור 2)

  1. טען את מחט זכוכית המשופעת עם 5 μl של פתרון זה באמצעות micropipette עם קצה פיפטה microloader 10 μl.
  2. הכנס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק המחט של micromanipulator מחובר למשאבת פיק פנאומטי (איורים 2A-C).
  3. הנח את בעל המחט ליד מיקרוסקופ כך מחט הצרכים רקכדי להתרגש בכיוון מישוריים אחד להכניס אותו לתוך חדר הלב של הזחל (איור 2 א).
  4. כוון את הזווית לזריקות ב-45 °.
  5. הגדר את ערכי microinjector כדלקמן: לחץ אחיזה: 20 פאונד לאינץ' המרובע (psi); לחץ פליטה: 15 psi; 100 מגוון אלפיות של gating, ערך תקופה של 1.9 (מתאים ל10.9 אלפית שני).
  6. להמס agarose ב 1x PBS באמצעות מיקרוגל סטנדרטי לייצר 20 מיליליטר של 1.5% (w / v) ג'ל. יוצקים ג'ל נמס לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר. הנח צורת הזרקת מחורץ לagarose החם, כך שפעם אחת קשוח, agarose יהיה תלמים שבזחל המסוממים יוצב 11 (2D דמויות ו2E).

4. זריקות (איור 3)

  1. הרדימי זחל במי אקווריום 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ"ג / ליטר (sulfonate L-אתיל-M-אמינו-נזואט מתאן), עד שהם יפסיקו להגיב למגע.
  2. השתמש pipett פסטר מפלסטיקדואר להעביר בזהירות את הזחל מסומם לתוך חריץ של עובש agarose הרטוב, כך שהצד הגחוני פונה אל קיר agarose האנכי של הגרוב (איור 3 א).
  3. מניחים את צלחת agarose תחת סטראו כך שהחדר הוא מול מן מחט הזריקה (איור 3 א).
  4. מנמיכים את המחט להכניס אותו לתוך חדר הלב. הכנס את המחט רק 1-2 מיקרומטר לתוך החדר נזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי (3B דמויות ו3 ג).
  5. ברגע שהמחט מוחדרת, להזריק את פתרון morpholino לתוך החדר עם 4-6 קטניות, כל 3 NL אספקת של הפתרון, עם מחכה מרווחים כדי לאפשר סליקה של הלב (3D דמויות ו3E).
  6. לאחר הזרקה, להוציא את המחט (במקביל למישור של הכנסה) ולאחר מכן להעביר בזהירות את הזחל בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק מלא בbac הבינוני E3k לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני E3 טרי.
  7. מניחים את המחט לתוך צלחת פטרי המכילה 1x PBS כדי למנוע הייבוש של המחט בעת העברת הזחל המוזרק.
  8. חזור על שלבים 4.1-4.6 כל שעה 12-24 לתקופת הניסוי. הערה: חזרה על הזריקות מבטיחה הספיגה ותחזוקה של morpholino בתאים.

5. ניתוח של זריקות (איור 4)

  1. להרדים את הדגים באקווריום של מים 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ"ג / ליטר עד שהם יפסיקו להגיב למגע.
  2. מניחים את הזחל רוחבי על 1.5% רטובים שטוחים (w / v) agarose צלחת מכוסה במדיום E3.
  3. זחלי תמונה באמצעות סטראו עם brightfield ודימות פלואורסצנטי. הערה: כפי שהזחלים הם שקופים, morpholino מתויג והעמסת צריך להיות גלוי כמו ירוק ניאון בכלי דם בכל בעלי החיים באופן ישיר לאחר הזרקה. הקרינה זו תתפזר יותר לתוך רקמות vascularized ידי15 דקות (איורים 4 א-4C).

6. הערכת הרגנרציה תולדה

  1. להעריך תמונות שנתפסו באמצעות תוכנת פיג'י תמונת J בחינם (http://fiji.sc/Fiji). לחקירת התחדשות, השתמש בכלי מעקב אונליין כדי לקבוע את הכמות של צמיחת התחדשות שחלה על שליטה וזחל הזריק morpholino.
  2. לכייל תמונות, פתח את אחד קבצי תמונה המקוריים בפיג'י על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון פיג'י הראשי.
  3. כדי להגדיר את קנה המידה לכל התמונות הבאות, ללכת על "נתח" בתפריט הראשי.
  4. בנפתח לחץ על תפריט "סולם הגדר".
  5. בחלון זה, להפעיל את האפשרות "הגלובלית" על ידי לחיצה על תיבת הסימון.
  6. עכשיו לפתוח את התמונה כדי למדוד את הכמות של צמיחת משובי שוב על ידי גרירה ושחרור (ראה שלב 6.1).
  7. בחר באפשרות "בחירות חופשי" בסרגל הכלים.
  8. מקיף את האזור כדי להימדד (Figures 4J-4L).
  9. לחץ על Ctrl + M. הפעולה זו תפתח חלון חדש "תוצאות" המציג את ערכו של השטח מוקף בפיקסלים מרובעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחט החדה, משופעת ההזרקה ממוקמת בקלות בחדר הלב של זחל דג הזברה כאשר ניגש dorsally (איור 3 א). הלב ממשיך לשאוב ונשמרת זרימת דם למרות נוכחותם של המחט (3B דמויות ו3 ג). זריקות להיזהר לא לשבש את המורפולוגיה של החדר או התכווצויות לב (איור 3D) למרות הזרקה של morpholino ללב (איור 3E).

בתוך דקות, פתרון morpholino-Endo-פורטר מפיץ בכל הגוף באמצעות כלי הדם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההזרקה תוך חדרי מספקת שיטת הערכה מהירה ואמינה לבדיקת תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או של הומאוסטזיס גוף מבלי להשפיע על תפקוד הגן בעובר. כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, אחד צריכה להיות מודע לארבע נקודות קריטיות: 1) גודל מחט,) ייבוש 2 מ המחט, 3) צמצום נפח, ו4) זמן חשיפה מינימאלית בפתרון הרגעה. מחטים כי הם קטנים מדי תסתומנה לעתים קרובות, בעוד מחטים כי הם גדולים מדי יפגעו בחדר ולגרום לדימום יתר. בעוד 20 מיקרומטר מומלץ, המחט אף פעם לא צריכה להיות יותר מחמישית בגודל של החדר ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי (DFG), ברצוננו להודות Ayele Tsedeke Taddese לקבלת תמיכה טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מורפולינו עם 3&אקוטי; תג פלואורסצאיןGene Tools Inc.מותאם אישיתמידע נוסף בכתובת www.gene-tools.com
Endo-PorterGene Tools Inc.מידע נוסף ב-www.gene-tools.com
AgaroseServa120623למזיגת צלחות להנחת הדגים במהלך הזרקות והדמיה
טריקאין (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)Applichemלהרדמה
מדיום E3 (5 מ"מ NaCl; 0.17 מ"מ KCl; 0.33 מ"מ CaCl<תת>2; 0.33 מ"מ MgSO4)לגידול זחלים
צלחות פטריSarstedt821.472להצבת הדגים במהלך הזרקות והדמיה
נימי זכוכית דקים שלPrecision Instruments, Inc.TW100F-3להכנת מחטי הזרקה
קצות פיפטות מיקרו-מעמיסאפנדורף5,242,956,003להעמסת המחט
פיפטות פסטר (3 מ"ל/1 מ"ל)מותג747760/74775להעברת
זחל חולץ מחט בוער/חוםסאטרמידע נוסף ב-www.sutter.com
שען (דומונט) פינצטה (מידה 5)דיוק עולמי אינסטרומנטס בע"מ501985כדי לבלום את המחט לפני השחזה
ניתוח מיקרוסקופאולימפוס, לייקה, זייסמשתנה עם היצרןחלק מכל מערך ההזרקה
מצלמת פלואורסצנטיאולימפוס, לייקה, זייסמשתנה עם היצרןכדי לדמות את הקרינה לאחר ההתקנה
ערכת PicoNozzle (מחזיק מיקרו-מזרק)World Precision Instruments5430-12עבור מיקרו-הזרקות
פנאומטיות PicoPump (מיקרו-מזרק)World Precision InstrumentsSYS-PV820למיקרו-הזרקות
קיר World

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  2. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
  3. Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
  4. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
  5. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
  6. Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
  7. Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
  8. Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
  9. Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
  10. Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
  11. Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  13. Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
  15. Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
  16. Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
  17. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  18. Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
  19. Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
  20. Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
  21. McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
  22. Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Morpholino InjectionFin RegenerationGene KnockdownTissue TargetingFiji ImageJAnesthesia ProtocolCapillary NeedleRegeneration Assessment

מאמרים קשורים