מאמר שיטה

שיטות כדי לאפיין ספונטניות ומושרות רתיעת תנועה במודל של מחלת פרקינסון מושרה Rotenone של

DOI:

10.3791/51625

⸱

17 באוגוסט 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Colby College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון היא הפרעה ניוונית של מערכת עצבים, הנובעת מהניוון של נוירונים דופאמין במערכת העצבים המרכזית, גורמים לליקויי תנועה. מודלים Rotenone מחלת פרקינסון בדרוזופילה. מאמר זה מתאר שני מבחני המאפיינים את ליקויי תנועה הן ספונטניים ולהבהיל מושרים נגרמים על ידי rotenone.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון היא הפרעה ניוונית של מערכת עצבים, הנובעת מהניוון של נוירונים דופאמין במערכת העצבים המרכזית, בעיקר בnigra substantia. המחלה גורמת לליקויים מוטוריים, המציגים כנוקשות, רעד ודמנציה בבני אדם. Rotenone הוא קוטל חרקים הגורמים לניזק חמצוני על ידי עיכוב הפונקציה של שרשרת העברת האלקטרונים במיטוכונדריה. כמו כן הוא משמש מודל למחלת פרקינסון בדרוזופילה. יש לי זבובים תגובה טבועה שלילית geotactic, שמחייבת אותם לטפס כלפי מעלה על שנבהל. זה כבר נקבע, כי rotenone גורם לפגמי תמותה ותנועה מוקדמים שמשבשים את יכולתם של הזבובים לטפס לאחר שהם כבר טפח כלפי מטה. עם זאת, ההשפעה של rotenone בתנועה ספונטנית אינה מתועדת היטב. מחקר זה מתאר שני מבחני תפוקה רגישים, לשחזור, וגבוהים לאפיין ליקויים הנגרם על ידי rotenone בלטווח קצר בהלה-induced תנועה ותנועה ספונטנית לטווח ארוך בדרוזופילה. מבחני אלה יכולים להיות מותאמים בנוחות לאפיין מודלים דרוזופילה אחרים של ליקויי תנועה ויעילות של סוכנים טיפוליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליקויי תנועה הם סימפטום עיקרי של מחלת פרקינסון ונגרמים בעיקר על ידי הידרדרות של נוירונים דופאמין של nigra substantia 1. Rotenone הוא קוטל חרקים ketonic שנחקר בהרחבה למודל גירעונות מנוע פרקינסון בדרוזופילה 2-6. Rotenone גורם לניזק חמצוני על ידי חסימת נתיב זרחון חמצוני, אשר בסופו גורם לתא מוות 7. נוירונים דופאמין נוטים יותר לרעילות rotenone, מה שהופך את ההשפעות של הכימיקלים בעיקר מנוע מבוסס 2,7. על ידי גרימת תסמיני מחלת פרקינסון בזבובים, אנו יכולים להבין טובים יותר את המחלה ולתקן הסימפטומים שלה 6,8-11. דרוזופילה מספקת מודל טוב ללימוד השפעה זו משום שהם גנטיים צייתנים, קלים לתחזוקה, ויש לי מחזור חיים מהיר.

מספר מחקרים הראו כי rotenone גורם מושרה בהלה לטווח קצרליקויי תנועה בזבובי דרוזופילה -כאשר נשמרים על מזון בתוספת rotenone, הם מראים תגובת geotactic שלילית איטי יותר לאחר 2-6 בהלה. כישלונם לטפס כלפי מעלה במנגנון בקבוקון מהר ככל ניסויי שליטה מעיד על פגמי תנועה מושרה בהלה.

ההשפעה של rotenone בטווח ארוך, תנועה ספונטנית אינה מתוארת היטב. צגי פעילות דרוזופילה (סכרים) שימשו בהצלחה כדי לפקח על תנועה בקצב היממה דרוזופילה לומדת 12,13. זבובים ממוקמים בצינורות בודדים, אשר נטענים לתוך DAM. מנגנון זה מצויד בחיישן אינפרא אדום, שסופר את מספר הפעמים לטוס שובר את קרן אינפרא האדומה. ספירה אלה יכול לשמש כמדד לתנועה ופעילות 12,13 באין מפריע. על ידי הצבת זבובים בDAM, ההשפעה של rotenone על תנועתם לטווח ארוך יכולה להיות מאופיינת. מחקר זה מתאר שיטות לשקילת המשקל הגלטווח קצר יור בהלה-induced תנועה ותנועה ספונטנית לטווח ארוך על מנת להבין טוב יותר את ההשפעות של ליקויים מוטוריים rotenone בתיווך. אפיון של ליקויי תנועה מחקה מחלת פרקינסון הוא חשובים משום שהם מאפשרים לחקר תרכובות אחרות אשר עשוי להפוך ליקויי תנועה אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 Assay תנועה מושרה רתיעת דרוזופילה

  1. טיפול תרופתי
    1. שקט ורגוע כדי לשתק מספר הרצוי הזכר (כ 8-12) של 1-3 בן יומו טס באמצעות CO 2 ולהעביר אותם לבקבוקונים המכילים מזון בתוספת התרופה. הערה: עוד חומר הרדמה לדוגמא, אתר או קרח יכול לשמש כדי להרדים את הזבובים כדי לאפשר ספירה וטיפול.
    2. לאפשר זבובים להתאושש מהרדמה ל20 דקות (או עד להחלמה) עם הבקבוקון במצב אופקי (כדי למנוע זבובים להיתקע על מזון) ולאחר מכן למקם את הבקבוקון זקוף בחושך שעה 12, חממת אור 12 שעות ב25 ° C לשארית של הניסוי.
  2. ניסויית על הגדר
    1. לחלק התקנת בקבוקון הכפולה הזה לשלושה חלקים שווים של 6.33 סנטימטר על ידי סימון במעגלים סביב צלוחיות עם סמן קבוע.
    2. לאחר 3 ימים של חשיפה לסמים, העברת זבובים בלי הרדמה לתוך הבקבוקון התחתון ומניחה את הבקבוקון העליון במהירותמעל הפתח. קלטת שני בקבוקונים יחד עם קלטת ברורה.
    3. לאפשר זבובים להסתגל לסביבה החדשה ל15 דקות.
    4. בקבוקוני מקום על רקע לבן ולהגדיר את מצלמה דיגיטלית במרחק מתאים מהמנגנון הכפול בקבוקון עם טיימר לאור. ודא כל המנגנון גלוי לעין במסגרת תמונה אחת ושכל הזבובים הם בפוקוס. כדי לשמור על מסגרות עקביות בין ניסויים, לסמן את המיקום של מצלמה ובקבוקון.
  3. Assay ניידות
    1. ברור שיציג את מספר המשפט, טיפול תרופתי, וטיימר בתצוגת מצלמה.
    2. בתקיפות ברז המנגנון הכפול הבקבוקון נגד השיש 3 פעמים ולהבטיח שכל הזבובים נופלים לתחתית של הבקבוקון. במקביל להפעיל את הטיימר.
    3. כל 5 שניות 1 דקות, לצלם תמונה של המנגנון. הערה: לחלופין, וידאו יכול לנפול בפח ונעצר במרווחים מתאימים למדידות.
    4. לאפשר זבובים להתאושש באין מפריע במשך דקות 1.
    5. חזור על 2 יותר פעמים עם 1 דקות זמן התאוששות בין כל ניסוי. הערה: כל מנגנון צריך לקחת 5 דקות כדי להשלים את איסוף הנתונים. לשמור על כוח דומה של הקשה בין ניסויים. מנגנון מרובה (לפחות 3) ניתן לטפל בקלות בו זמנית.
  4. ניתוח נתונים
    1. סקירת תמונות ולרשום את המספר של זבובים בכל מקטע לאורך זמן. חישוב אחוזי הזבובים בכל מקטע לאורך זמן. הערות: חזרו על תהליך זה כל עם אותו הזבובים ב2 או 3 נקודות עניין זמן, למשל, יום 3, 5, ו -7 אם זבובים רבים מדי למות לאורך הניסוי זה אפשרי בהיקף של עד מספר המשפט המקורי כדי לפצות לתמותה. משתמש בניתוח סטטיסטי מתאים כדי להשוות נתונים.

Assay 2 דרוזופילה הספונטנית התנועה

  1. הכנת מזון
    1. מחדש 3 גרם של מדיום דרוזופילה מיידי עם 15 מ"ל של מים דה המיונן וrotenone הרצוימינון (או תרופה אחרת של עניין).
    2. ברגע שתערובת המזון הפכה חברה (כ -5 דקות), לטעון בזהירות את האוכל להיות כ 1 סנטימטר ליצרן סיפק צינורות שקופים (5 מ"מ X 65 מ"מ). מוסיף את התרופה חדורה מזון לצינורות על ידי הצבת בזהירות את הצינורות אנכי במזון וסובב אותם עד שהם יכולים להסיר עם האוכל בתוך הצינור. הערה: זה מועיל למקום אצבע על הפתיחה של הצינור כדי ליצור ואקום. מזון לא יכיל את כל בועות אוויר או שיש לי משטח אחיד כמו הזבובים יכולים להיות תקועים.
  2. התקנה ניסיונית
    1. הנח כובע פלסטיק בקצה של צינור הקרוב ביותר מזון. דחוף את מכסה הפלסטיק על הצינור הקטן ככל האפשר, כפי שהוא יכול ליצור בועת אוויר בבקבוקון אם דחף לכוח.
    2. זכר 1 בן יום שקט ורגוע זבובים באמצעות CO 2 ולהכניס בזהירות זכר 1 לטוס לתוך צינור אחד עם מכחול. חזור תלוי במספר של ניסויים רצויים.
    3. חבר אתסוף הרחוק ביותר צינור מהמזון עם כדור צמר גפן קטן, שיכול להיות מגולגל ביד מחנות גדולה קנה כדורי צמר גפן.
    4. לאפשר זבובים להתאושש עם הצינורות במצב אופקי במשך 15 דקות ולוודא שכל הזבובים בחיים ופעילים. הכנס את הצינורות לתוך DAM ולוודא שכל הצינורות נמצאים באותו יחסי עמדה לסכר. הערה: ניתן למקם אותם עם השטח של ניטור באמצע הבקבוקון, או כדי לדחוף את כל הבקבוקונים לצד, כך שקצה הצינורית נמצא במעקב. הערה: ראה דיון לוריאציות על שיטה זו.
  3. איסוף נתונים
    1. הנח את DAM בחושך שעה 12, חממת אור 12 שעות מוגדרת 25 ° C. חבר את הסכר למערכת איסוף נתונים. פתח את תוכנת DAM ותחת אורך בן בחר העדפות ל10 דקות. התחל איסוף נתונים ולאפשר לתכנית כדי לאסוף נתונים למשך 7 ימים. הערה: אורך סל יכול להיות מותאם במידת צורך.
    2. ניתוח נתונים
      הערה: תהליךנתונים כדי להשיג ספירה לדקה כאמצעי לתנועה ספונטנית לטווח ארוך.
      1. נתוני קובץ DAM פתוח סריקת תכנית וגישת צג על ידי לחיצה נתוני קלט בחרו.
      2. בחר טווח צג מתאים ובחר אורך בן 10 מרווחים דק '.
      3. בסוג קובץ פלט לבחור קבצי ערוץ. להשאיר את כל אפשרויות אחרות כברירת מחדל.
      4. לחץ נתוני סריקה ולשמור לתיקייה ייעודית.
      5. נתוני יבוא בתוכנת ניתוח נתונים היממה כדי להשיג ספירה לדקה. הערה: תוכנת Clocklab ניתוח נתונים היא נפוץ. אפשרויות אחרות הן גם זמינות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay תנועה מושרה רתיעת דרוזופילה

Wildtype, קנטון-S, זבובים הראו תגובת geotactic שלילית חזקה עם רק כ 88% ו -5% מזבובים בסעיפים העליונים ותחתונים בהתאמה, של המנגנון הכפול בקבוקון לאחר 30 שניות (איור 1). זבובים נחשפו ל125 מיקרומטר וrotenone מיקרומטר 250 במשך 3 ימים הראו ירידה קלה במספר הזבובים בחלק העליון ועלייה קלה במספר הזבובים בחלק התחתון. זבובים נחשפו ל500 rot...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מתארים שני תהליכים למדידת שתי תנועה ספונטנית לטווח ארוך ותנועה מושרה בהלה לטווח קצר במודל דרוזופילה מושרה rotenone של מחלת פרקינסון. אפשר גם למדוד את מאפייני תנועה אלה בזבובים נחשפו לסוכנים אחרים תרופתיים הידועים למודל לדוגמא מחלת פרקינסון, Paraquat 14, מודלים גנטיים של למשל מחלת פרקינסון, מוטציות סינוקלאין אלפא 15, ומודלי זבוב אחרים של מחלות התוקפות תנועה. בשתי השיטות, שיטות ושינויים אלטרנטיביות יכול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לQiuli וואנג, שפת מרכז משאבים, קולבי מכללה, לקבלת סיוע טכני בעיבוד וידאו ואריק תומאס, מחלקה למוסיקה, קולבי מכללה, למתן המוזיקה הרקע. פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מהמרכז הלאומי למחקר משאבים, INBRE (P20RR016463-12), המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (GM103423-12 P20), אזרחי מכוני בריאות ומדע האגף גרנט, קולבי המכללה (STA). JL וLWM נתמכו על ידי מענקים מהקיץ Scholar קרן, קולבי מכללה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקונים צרים סטנדרטייםGenesee Scientific32-120
RotenoneSigmaR8875יש לאחסן במקפיא, להכין טרי לכל ניסוי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SigmaD8418ממס לרוטנון
מיידי דרוזופילה בינוניקרולינה ביולוגית פורמולה 4-24
מוניטור פעילות דרוזופילה (DAM)TrikineticsDAM2trikinetics.com
צינורות DAM צינורותטריקינטיקה5 X 65 מ"מ
מתכון לרוטנון + מזון (מינון 125 מ"מ)הכינו תמיסת מלאי רוטנון של 62.5 מ"מ ב-DMSO על ידי המסת 25 מ"ג רוטנון ב-1 מ"ל DMSO; למינון של 125 מ"מ, הוסיפו 10 מ"מ רוטנון ב-DMSO ל-5 מ"ל מים.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
  2. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
  3. Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
  4. Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
  5. Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
  6. St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  7. Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
  8. Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640(2011).
  9. Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  10. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  11. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
  12. Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
  13. Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
  14. Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
  15. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  16. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
  17. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  19. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים