ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניאון הכלאה באתרו (FISH) הוא טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בתאים. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה ואבחון הסרטן, ויכול לזהות סטיות של הגנום, שלעתים קרובות יש השלכות קליניות חשובות. RNA FISH ניתן להשתמש בם כדי לזהות מולקולות RNA בתאים וספק תובנות חשובות בויסות של ביטוי גנים. שילוב של ה-DNA ודגי RNA בתוך אותו התא הוא מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לDNA FISH עלולים להיות קשים מדי עבור מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א. אנחנו כאן להציג את הפרוטוקול ישים בקלות המאפשר זיהוי המשולב, בו זמני של Xist RNA ו-DNA מקודד על ידי כרומוזומי ה-X. פרוטוקול FISH זה בשילוב ה-DNA-RNA סביר יכול להיות מיושם על מערכות אחרות שבו שניהם RNA ו-DNA צריכים להיות מזוהים.
מבוא
לומדים תאים ורקמות באמצעות ניאון הכלאה באתרו (FISH) יש, מאז השקתו בסוף 1970s 1, אפשר לחוקרים ללמוד הגנים, ארגון הכרומטין וביטוי גנים ברמת subcellular. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה, karyotyping 2, אבחון הסרטן 3 וסינון גנטי טרום השרשה 4, ויש לו תפקיד חשוב במחקר מולקולרי 5-6 שכן היא מאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בסביבה המקומית שלהם. ניתוח ביטוי תא בודד על ידי RNA FISH יכול לזהות תעתיקים עיקריים יליד וRNAs noncoding להיות עיבד מכרומוזומים, ומציע יתרונות לטכניקות אחרות שלהעריך ביטוי גנים ברמת אוכלוסייה, כולל למשל כמותית RT-PCR, ניתוח הגנום רחב ביטוי או סופג צפו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אינדוקציה של התמיינות בתאי גזע עוברי נקבה כדי לגרום איון כרומוזום X
הערה: תאי גזע עובריים בעכבר נקבה (על פי בקשה) גדלים בתנאים בתאי גזע עובריים רגילים על תרבות מנות gelatinized המצופה fibroblasts העכבר העוברי (MEFs). אנחנו כאן להניח שהקורא מכיר את טכניקות תרבית תאים סטנדרטיות 39-41. כדי לגרום להתמיינות, תאי גזע עובריים גדלו במנות T25 יופרדו מMEFs, ויהיו מצופים במדיום בידול.
- הסר בינוני ES מתרבית תאי הגזע העובריים, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול הנ"ל לשילוב דגי DNA-RNA, היינו מסוגל לדמיין איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים ממין נקבה. איור 1 מציג דוגמא מייצגת של ניסוי FISH DNA-RNA, שבו זיהינו את שני Xist (שהוא גלוי כXist RNA ענן שנקרא על כרומוזום X פעיל ולהצביע שעתוק בסיסי על כרומוזום X הפעיל), ואזור של כרומוזום X, המופיע כאות ממוקדת. שים לב שאחד מהאותות להצביע ממוקם בתוך ענן Xist, ובכך מראה כי ענן Xist אכן לוקליזציה לאורך, וציפוי כרומוזום X. בלמעלה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שילוב ה-DNA-RNA FISH יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לדנ"א דגים יכולים להיות קשים מדי עבור מולקולות RNA פחות יציבה. כמה גישות יושמו ללמוד שני DNA ו-RNA באותו התא, לעקוף את הצורך בדגירה בו זמנית עם בדיקות לזיהוי שני DNA ו-RNA. לדוגמא, בגישת חפיפה, דגי RNA הראשונים מתבצע, ותאים הם צילמו, וקואורדינטות נלקחות. בהמשך לכך, אותו השקופיות המשמשות לדגי ה-DNA, שבמהלכו האות של RNA FISH הולכת לאיבוד. לאחר FISH-DNA, התאים הם צילמו שוב, והתמונות שהתקבלו משני RNA ודגי DNA ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים לכל חברי המחלקה לשעתוק ופיתוח של ארסמוס MC בעבר ובהווה על דיונים מועילים ומעוררים במהלך השנים האחרונות. אנו רוצים גם להודות לשלושת הסוקרים האנונימיים על מתן משוב מועיל. העבודה במעבדת גריבנאו נתמכת על ידי מימון ממועצת המחקר ההולנדית (NWO-VICI) ומענק התחלתי של ERC.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| גזע עובריים של עכברים נקבות | יהיו זמינים על פי בקשה | ||
| פיברובלסטים | מעוברי E13.5, או באמצעות מקורות מסחריים למשל | ||
| מדיום | תרבית תאי ES MilliporeDMEM, 15% סרום עגל עוברי, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1 מ"מ γ-מרקפטואתנול, ו-1,000 U/ml LIF. מסננים, מעקרים ומאחסנים ב-4 & #176; C למשך שבועיים לכל היותר. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| סרום עגל עוברי | Invitrogen | 10099141 | |
| פניצילין– סטרפטומיצין (100x) | Invitrogen | 15140-122 | |
| חומצות אמינו לא חיוניות | Invitrogen | 11140-050 | |
| γ-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| מדיום התמיינות תאי ES | , 15% סרום עגל עוברי מומת בחום, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, חומצות אמינו לא חיוניות, 37.8 μ l/L monothioglycerol ו-50 μ גרם/מ"ל חומצה אסקורבית | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| חומצה אסקורבית (50 מ"ג/מ"ל) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| מונותיוגליצרול | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 כלי תרבית תאים | גריינר ביו-וואן | 690160 | |
| כלי תרבית תאים 6 בארות | גריינר ביו-וואן | 662160 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA בדרגת תרבית תאים 0.25% (v/v) טריפסין/0.2% (w/v) EDTA ב-PBS | Gibco | 25200-056 | |
| צינורות פלקון | Falcon | 352196 | |
| 24 x 24 מ"מ כיסויים | Menzle | 780882 | |
| Sigma-Aldrich | G1890-100G | מכינים תמיסת PBS של 0.2% ג'לטין/תרבית תאים, וחיטוי | |
| פפסין | סיגמא-אולדריץ' | P7000 | מדולל ל-0.2% ב-0.01 M HCl (pH 2.0) |
| מוחלט 100% אתנול | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | השתמש ב-100% אתנול מוחלט ו-RNAse מים ללא אתנול כדי לייצר 70% ו-90% תמיסות אתנול |
| בקסטר | TKF7114 | ||
| קצות מסנן סטריליים | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| ערכת תיוג דיגוקסיגנין (תרגום DIG-Nick) | ביוטין | ||
| (תרגום ביוטין ניק) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| מזרק 2 מ"ל | BD Plastipak | 300013 | |
| כותנה | |||
| שפופרות אפנדורף | Eppendorf | ||
| שמרים tRNA 10 מ"ג/מ"ל | Invitrogen | 15401-029 | |
| DNA זרע סלמון 10 מ"ג/מ"ל | Invitrogen | 15632-011 | |
| מיטת עכבר-1 DNA 1 מ"ג/מ"ל | Invitrogen | 18440-016 | |
| Eppendorf ספסל עליון מיקרוצנטריפוגה | Eppendorf | דגם 5417R | |
| צנטריפוגה מקוררת Eppendorf | Eppendorf | דגם 5810R | |
| 2 M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ תמיסת | 50% פורממיד, 2x SSC, 50 מ"מ מאגר פוספט pH 7, 10% דקסטרן סולפט pH 7 | ||
| פורממיד | אקרוס אורגניים | 3272350000 | |
| דקסטרן סולפט | Fluka | 31403 | |
| 10 מ"מ מאגר פוספט, pH 7 | הוסף 57.7 מ"ל של 1 M Na2HPO4 ו-42.3 מ"ל 1 M NaH2PO4; השתמש במים מטופלים DEPC | ||
| ובמאגר | 70% פורממיד/2x SSC/10 מ"מ מאגר פוספט pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2 M Tris pH 7.5 תמיסת | |||
| כביסה Tris-saltine-Tween (TST) | 100 מ"ל 10x מי מלח, 50 מ"ל 2M Tris, 500 & #956; l Tween-20, להוסיף מים ללא RNAse עד 1 ליטר | ||
| תמיסת | להמיס 85 גרם NaCl ב-1 ליטר H2O ללא RNAse, וחיטוי | ||
| Tris-מלח-BSA (TSBSA) | 500 μ l 10x מי מלח, 250 & #956; l 2 M Tris, 1 מ"ל 100x BSA, 3.25 מ"ל ללא RNAse H2O | ||
| BSA, מטוהר, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| נוגדן נגד חפירה כבשים | אבחון | שימוש 1:500 מדולל | |
| בנוגדנים נגד כבשים TSBSA מצומד עם FITC | ג'קסון | שימוש 1:250 מדולל בנוגדנים נגד ארנב TSBSA | |
| מצומד עם FITC | Jackson | מעבדות משתמשות ב-1:250 מדולל | |
| בנוגדנים נגד ביוטין | אבחון | משתמש ב-1:200 מדולל | |
| בנוגדנים נגד עכבר TSBSA מצומד עם רודמין | ג'קסון מעבדות | שימוש ב-1:250 מדולל בנוגדנים נגד סוס עזים TSBSA | |
| מצומד עם רודמין | ג'קסון מעבדות | משתמשות ב-1:250 מדולל בתמיסת כביסה TSBSA | |
| Tris-מלח (TS) | 10 מ"ל 10x מי מלח, 5 מ"ל 2 M Tris, 85 מ"ל ללא RNAse H2O | ||
| מדיום הרכבה Vectashield עם DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| לכה | |||
| לציפורניים מיסקרוסקופ פלואורסצנטי |
מקורות
- Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
- Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
