הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

DNA-RNA בשילוב פלורסנט

27.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

14 ביוני 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

במאמר זה

סיכום

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

תקציר

ניאון הכלאה באתרו (FISH) הוא טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בתאים. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה ואבחון הסרטן, ויכול לזהות סטיות של הגנום, שלעתים קרובות יש השלכות קליניות חשובות. RNA FISH ניתן להשתמש בם כדי לזהות מולקולות RNA בתאים וספק תובנות חשובות בויסות של ביטוי גנים. שילוב של ה-DNA ודגי RNA בתוך אותו התא הוא מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לDNA FISH עלולים להיות קשים מדי עבור מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א. אנחנו כאן להציג את הפרוטוקול ישים בקלות המאפשר זיהוי המשולב, בו זמני של Xist RNA ו-DNA מקודד על ידי כרומוזומי ה-X. פרוטוקול FISH זה בשילוב ה-DNA-RNA סביר יכול להיות מיושם על מערכות אחרות שבו שניהם RNA ו-DNA צריכים להיות מזוהים.

מבוא

לומדים תאים ורקמות באמצעות ניאון הכלאה באתרו (FISH) יש, מאז השקתו בסוף 1970s 1, אפשר לחוקרים ללמוד הגנים, ארגון הכרומטין וביטוי גנים ברמת subcellular. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה, karyotyping 2, אבחון הסרטן 3 וסינון גנטי טרום השרשה 4, ויש לו תפקיד חשוב במחקר מולקולרי 5-6 שכן היא מאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בסביבה המקומית שלהם. ניתוח ביטוי תא בודד על ידי RNA FISH יכול לזהות תעתיקים עיקריים יליד וRNAs noncoding להיות עיבד מכרומוזומים, ומציע יתרונות לטכניקות אחרות שלהעריך ביטוי גנים ברמת אוכלוסייה, כולל למשל כמותית RT-PCR, ניתוח הגנום רחב ביטוי או סופג צפון . על ידי הדמיה תעתיקי רנ"א שמקורם ישירות מהאתרים שלהם ממוצא, זה למשל היהשם לב שביטוי גנים הוא סטוכסטיים 7, ולפעמים יכול להיות אלל מסוים 8. שיפורים בטכניקה שאפילו הרשו לאיתור וכימות של מולקולות ה-mRNA יחיד בתוך התאים 9-11.

העיקרון הבסיסי של דגים מורכב מהכלאה של חומצות גרעין בתוך התא לבדיקת חומצות גרעין באמצעות בסיס זיווג ווטסון וקריק מאוד ספציפי. הבדיקה יכולה להיות במישרין או בעקיפין מזוהה, וכתוצאה מכך אות שניתן דמיינו מיקרוסקופי. ניסיונות ראשוניים היו מורכבים מבדיקות שכותרתו רדיואקטיבית, שחסרונות המבוססים על נושאי בטיחות, ברזולוציה מרחבית מוגבלת והיכולת לזהות רק אחד יעד בכל פעם 12-14. הפיתוח הבא של תוויות nonradioactive, כוללים fluorochromes, haptens, ואנזימים, אפשר שימוש התפשטות הרחב של דגים כטכניקת ביולוגיה מולקולרית שבשגרה. הבדיקה FISH גם יכולה להיות מתויגת באופן ישיר עם fluorochשל רומא על ידי קישור כימי של מולקולות ניאון לחומצות גרעין רצפי 15 ואינטגרציה של נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently 16-19, או הבדיקה ניתן דמיינו בעקיפין לאחר אינטגרציה של haptens (כולל ביוטין וdigoxigenin) וזיהוי חיסוני של haptens ידי נוגדנים ספציפיים hapten מצומדת ל כתב ניאון מולקולות 20-21. הגישה השנייה מאפשרת הגברה אות על ידי שימוש במספר שכבות של נוגדנים שכותרתו fluorescently אשר נמצא בשימוש כדי לשפר את האות המקורי, ומאפשרת זיהוי של מיני RNA אשר באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. על ידי שילוב של טכניקות תיוג ישירות ועקיפות וhaptens השונים, כמה מטרות יכולות להיות דמיינו בו זמנית באותו התא.

אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקולי דגים הוא ההכלאה של החללית ליעד שלו. למרות שבתאוריה, בדיקה תהיה ספציפית להיקשר רק ליעד שלה, הלכה למעשה, הייחוד הזהלא תמיד מושגת, כמו בדיקות עלולות להיקשר לאזורים הומולוגיים, ותנאי הכלאה לא תמיד יהיו אידיאליים למיני אזור DNA או RNA מסוימים. שוטף פוסט הכלאה לכן הם בעלי חשיבות מיוחדת, שכן הם יכולים להגדיל את ההחמרה של הליך הדגים, ויכולים למנוע ספציפי מחייב של בדיקות FISH, אשר יביאו ברמה גבוהה של רעשי רקע. כמולקולות RNA הן חד גדילים הם יכולים בקלות להיות הכלאה לבדיקת FISH. לעומת זאת, מולקולת DNA גדילים הכפולה צריכה ראשונה צעד denaturation, לאחר שבדיקה יכולה להכליא. זו מושגת בדרך כלל על ידי חימום של הדגימה, שתוצאתה denaturation של ה-DNA. עם זאת, בתנאים קשים אלה, מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א עלולות ללכת לאיבוד. לפיכך, ה-DNA-RNA בשילוב הדגים דורש אופטימיזציה משמעותית של התנאים, ויותר מאתגר מבחינה טכנית בהשוואה לזיהוי הנפרד של RNA בלבד או ה-DNA.

כאן אנו presenפרוטוקול מפורט של ת"א בשילוב דגי DNA-RNA, בו זמנית אשר אפשרו לנו ללמוד איון כרומוזום X (xci) בתאי גזע עוברי בעכבר נקבת 22-24. Xci הוא מנגנון חיוני להתפתחות עוברית אפיגנטיים נשית 25, ותוצאות בheterochromatinization ומכאן השתקה של אחד משני כרומוזומי X ביחידים נקבת 26-27. חיוני לתהליך זה הוא RNA Xist noncoding 28-30, אשר מוסדר על ידי RNF12 22-23 וREX1 24 החלבונים. ביטוי Xist הופך שהוגברו על כרומוזום העתיד לא פעיל X (Xi) במהלך התפתחות עוברית או על התמיינות תאי גזע עובריים במבחנה , ויכול להתפשט לאורך כרומוזום X ובכך למשוך אנזימי הכרומטין שיפוץ אשר תוצאת כיבוי תעתיק של כרומוזום X ביום 31. זו הפצת Xist RNA ניתן דמיינו ידי RNA FISH כמו ציפוי של כרומו Xמסוים, המכונה גם ענן Xist. מאחר ותאי גזע עובריים נקבה יכולים לאבד את אחד מכרומוזומי X שלהם בשל חוסר יציבות גנומית, אנו ואחרים מועסקים בשילוב ה-DNA-RNA FISH ללמוד xci, כדי לוודא שתאים רק יציבים karyotypically מוערכים בניתוח של תהליך חשוב זה 22,32 -34. כמו עם כל טכניקה מולקולרית ביולוגיה, כמה פרוטוקולים מעולים שונים כבר פורסמו 35-38. כאן אנו מציגים השיטה שלנו, החל מהגיוס של התמיינות בתאי עכבר גזע עובריים, קיבעון של תאים, תיוג של בדיקות FISH על ידי ניק-תרגום, שלפני טיפול בתאים קבועים כדי לאפשר permeabilization וספיגת בדיקה שלאחר מכן, הכלאה של החללית כדי יעד, ולבסוף זיהוי של הבדיקה על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול במסמך שהוצג מאפשר גילוי נאמן של Xist RNA וכרומוזום X בתוך תקופה של יומיים, ואת היסודות של טכניקה זו יכול ככל הנראה להיות מותאם לotמערכותיה ותחומי המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. אינדוקציה של התמיינות בתאי גזע עוברי נקבה כדי לגרום איון כרומוזום X

הערה: תאי גזע עובריים בעכבר נקבה (על פי בקשה) גדלים בתנאים בתאי גזע עובריים רגילים על תרבות מנות gelatinized המצופה fibroblasts העכבר העוברי (MEFs). אנחנו כאן להניח שהקורא מכיר את טכניקות תרבית תאים סטנדרטיות 39-41. כדי לגרום להתמיינות, תאי גזע עובריים גדלו במנות T25 יופרדו מMEFs, ויהיו מצופים במדיום בידול.

  1. הסר בינוני ES מתרבית תאי הגזע העובריים, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS.
  2. הוסף 1.5 מיליליטר טריפסין-EDTA (לפני לחמם 37 מעלות צלזיוס), ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר 3.5 דקות, לנער את הצלחת בעדינות כדי לשבור את המושבות.
  3. להשבית טריפסין-EDTA על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום התמיינות לתאים. תאי פיפטה מעלה ומטה כדי להשיג פתרון תא בודד, ולאסוףבצינור 15 מיליליטר. ספין 5 דקות ב200 XG, ולאסוף תאים ב10 מיליליטר של מדיום בידול.
  4. הוסף השעיה תא למנת תרבות שאינה gelatinized, ודגירה עבור שעה 1 בחממה תרבות תא. הערה: MEFs יוכל לדבוק בצלחת התרבות שאינה gelatinized, ואילו תאי גזע עובריים יישארו בהשעיה.
  5. בינתיים, להוסיף coverslips מעוקר זכוכית (24 x 24 מ"מ) ל6 צלחות היטב, להוסיף ג'לטין 0.2%, ו דגירה במשך 5 דקות מינימליות בטמפרטורת חדר.
  6. לאחר 1 שעות, לאסוף את supernatant של תרבית תאי ES מצופה מראש, אשר כוללת בעיקר תאי גזע עובריים שאינו דבקים. פלייט תאי גזע עובריים ל6 גם צלחות המכילות coverslips. הערה: השתמש ב⅙ ה של צלחת T25 מחוברות ל6 בארות של צלחת 6 באר. זה יאפשר בידול מחוברות גם לאחר 3 ימים של בידול. שנה בינונית על בסיס יומי. לקורסים ארוכים יותר זמן התמיינות, תאי גזע עובריים מראש מצופים צלחת במדיום התמיינות בחיידקי מנות, וincubאכלתי על שייקר סלולרי משולב בחממת תרבות תא. זה יאפשר לתאים ליצירת גופי embryoid, אשר יכול להיות מצופה לcoverslips 1-2 ימים לפני הקיבעון.

2. קיבוע של התאים מובחנים ES לניתוח FISH DNA-RNA לאחר

  1. הסר בינוני בידול מתרבויות בידול, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS. הערה: הוסף PBS בזהירות כדי למנוע את התאים שנשטפו.
  2. הסר תרבית תאי PBS ולתקן את התאים על ידי הוספת paraformaldehyde 4% (PFA) / PBS, ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: PFA הוא רעיל ויכול לגרום לסיכון בריאותי משמעותי כאשר להיות בשאיפה או בעת מגע על עור או בעיניים. יתר על כן, PFA הוא מסרטנת.
  3. הסר PFA 4% / PBS, ולשטוף coverslips 3x עם 70% אתנול. הערה: השטיפה נכונה היא חשובה, כמו כל זכר של PFA יפריע לצעדי דגים שלאחר מכן. ניתן לאחסן coverslips ב70% אתנול ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים לפני Fניתוח ISH.

3. תיוג של בדיקות DNA לניסויים בדגים

הערה: קבל קטע DNA של הגן של עניין (אורך מינימאלי> 2 KB לRNA FISH, או> 20 kb לדגי DNA), או BAC מכסה את הגן של עניין. לגילוי RNA, חללית קטנה יותר יכולה להיות מספיק בהשוואה לגילוי ה-DNA, שכן סביר להניח שעתוק יגרום תמלילים מרובים, אשר ניתן לאתרם בו זמנית. לאיתות חזקה על גדיל עותק דנ"א היחיד, נדרשת בדיקה ארוכה יותר, כדי להיות מסוגל לזהות מספר מספיק של haptens המשולב. רצוי, אזור גנומי שאינו עיבד נבחר לעיצוב הבדיקה ה-DNA. בנוסף, בעת שימוש בחללית קטנה יותר כדי לזהות RNA, זה יהיה למנוע שהלוקוסים הגנומי שממנו RNA הוא עיבד הוא שיראו בגישת FISH DNA-RNA בשילוב, אם כי לא ניתן לשלול את זה באופן מלא. כדי לזהות עכבר Xist, שימשה בדיקה cDNA 5.5 kb. לDetection של כרומוזום X, ניתן להשתמש במספר בדיקות BAC. תוצאות טובות הושגו בתערובת של BAC RP23-100E1 וBAC CT7-474E4, אשר ממוקמים בסמיכות למוקד Xist. בהתאם לגן או כרומוזום של עניין, כמה בדיקות שונות ייתכן שתידרשנה כדי להשיג תוצאות אופטימליות. בכל פעם שעובד עם חומרים אשר ישמש לRNA-FISH, השתמשו טיפים סטריליים מסנן, H RNase ללא 2 O, ולעבוד בסביבה נקייה.

  1. קח 1 מיקרוגרם של ה-DNA ולדלל בH 2 O בנפח כולל של 16 μl. הוסף 4 μl של digoxigenin או פתרון תיוג ביוטין (ראה חומרים כימיים), מערבב על ידי vortexing ולדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. הערה: ביוטין או נוקלאוטידים שכותרת digoxigenin עכשיו יהיה משולב על ידי nick-תרגום.
  2. בינתיים, להכין את עמודות G50 להסיר נוקלאוטידים שאינם משולבים. קח מזרק 2 מיליליטר, להסיר את סטמפר, ולהוסיף כותנה מעוקרת לתוך המזרק. להוסיף כדורי G50 בt הפתרוןo למלא את המזרק, במקום מזרק בצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 642 דקות 1. הערה: בסביבות 80% מהמזרק צריכים עכשיו להיות מלאים עם G50. חזור כאשר פחות G50 הוא הווה.
  3. לאחר 90 דקות, להוסיף 40 μl של H 2 O לתערובת תגובת nick-התרגום, ולהוסיף התגובה לטור G50. הוספת צינור ריק תחת העמודה, ו צנטריפוגות ב XG 642 למשך 2 דקות. לאסוף את הזרימה דרך בצינור תגובה.
  4. מדוד את עוצמת הקול של הזרימה דרך עם טפטפת, ולהוסיף H 2 O להגיע להיקף כולל של 200 μl. לזרז את הזרימה דרך ה-DNA על ידי הוספת 13.3 μl זרע סלמון (10 מ"ג / מיליליטר), 13.3 tRNA שמרי μl (10 מ"ג / מיליליטר), ה-DNA 26.7 עכבר μl Cot-1 (1 מ"ג / מיליליטר) ו28 μl 2 M NaAc, pH 5.6. מערבבים על ידי vortexing, ולהוסיף 533 קרח μl אתנול 100% קרים. לנער את הצינור, ו צנטריפוגות ב XG 16,200 למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant ולשטוף גלולה פעמיים עם 70% אתנול. צנטריפוגה ב XG 16,200 במשך 5 דקות ב4 ° C, ואוויר יבש גלולה. הוסף 50 μl של פתרון +50 הכלאה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להקל על ההמסה. הערה: בדיקה תווית יכולה להיות מאוחסנת במשך מספר שנים ב -20 ° C. זהירות: 50 + פתרון הכלאה מכיל פוראמיד, שהוא רעיל, עלול לגרום לגירוי במערכת הנשימה עור, עיניים ו, ​​והוא גם teratogen.

4. Permeabilization, טרום טיפול וכלאה של תאים קבועים לCombined DNA-RNA FISH

  1. רעננות תאים קבועים על coverslips, על ידי הסרת 70% אתנול והתוספת של תרבית תאי PBS ל6 גם הצלחות. דגירה במשך 5 דקות. חזור על פעולה שלוש פעמים בסך הכל.
  2. הסר תרבית תאי PBS, ולהוסיף פפסין 0.2% עד 6 הצלחות היטב, לpermeabilize התאים. דגירה 6 צלחות היטב באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. הסר פפסין, ולהשבית עם H RNase ללא 2 O.
  3. תאים שלאחר תיקון על ידי דוגרים עם PFA 4% / PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר fixatiב, לשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS במשך 5 דקות.
  4. מייבש את התאים על ידי דוגרים עם אתנול 70% במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. העברת coverslips מתוך 6 צלחות היטב, וcoverslips האוויר יבש במשך כמה דקות.
  5. תאי גיל על ידי דוגרים coverslips על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על צלחת חום.
  6. טרום להכליא בדיקה FISH עם DNA Cot-1 עכבר על ידי הוספה יחד במשך כל coverslip להיות מנותחים, 25 μl של פתרון +50 הכלאה, DNA Cot-1 0.5 עכבר μl, μl 1 של הבדיקה Xist כותרת ביוטין וμl 1 של digoxigenin הבדיקה BAC שכותרתו גילוי כרומוזום X. מערבבים על ידי vortexing, ולפגל על ​​C ° 99 למשך 5 דקות. דגירה באופן מיידי ב-C ° 37 45 דקות, כדי לאפשר DNA Cot-1 כדי להכליא לחזור על רצפים הנמצאים בבדיקות.
  7. לאחר ההזדקנות, במקום 50 μl של חיץ denaturation (בהיקף של 70% formamide/2x חיץ פוספט SSC/10 מ"מ) בשקופית זכוכית, ולשים את coverslips על גבי עם תאים מול towards חיץ denaturation. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  8. הוספת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ותאים שלאחר תיקון, על ידי דוגרים באתנול 70% קרח קר למשך 5 דקות.
  9. מייבש את התאים על ידי דגירה לאחר מכן ב70% אתנול במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. הסר את coverslips מ6 צלחות היטב, ולתת אוויר יבש במשך כמה דקות.
  10. ספוט חללית הכלאה מראש בשקופית זכוכית, ודגירת coverslip על גבי. מגלשות מקום בתא humidified מלא 50 מיליליטר 50% formamide/2x SSC, ודגירת הלילה בשעה 37 ° C.

5. רוחצת פוסט כלאה ונוגדן מתווך איתור של בדיקה

  1. מלא 6 צלחות היטב עם 2x SSC, וטרום חם עד 42 ° C. הוספת coverslips לאחר דגירה הלילה, ודגירה על C ° 42 למשך 5 דקות.
  2. הסר SSC 2x, ודגירת coverslips עם SSC formamide/2x 50% עבור 10 דקות ב42 ° C. חזור על פעולה 3 פעמים בסך הכל (30 דקות של כביסה בסך הכל).
  3. הסר 50% formamide/2x SSC, ולשטוף שקופיות עם טריס-מלוחים Tween (TST) עבור 2 x 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. ספוט 50 μl טריס-מלוח-BSA (TSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לחסימה ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified.
  5. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  6. ספוט 50 μl של נוגדן כבשים נגד חפירות (1:500 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips הפוכה לשלב הדגירה הראשון ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified.
  7. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  8. ספוט 50 μl של נוגדן ארנב נגד כבשים מצומד עם FITC (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השנייה במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified .
  9. טרנסfer coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  10. ספוט 50 μl של נוגדן העז נגד ארנב מצומד עם FITC (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השלישית במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified .
  11. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  12. ספוט 50 μl של עכבר אנטי ביוטין נוגדנים (1:200 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה הרביעית ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified.
  13. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  14. ספוט 50 μl של נוגדן חמור אנטי עכבר מצומד עם Rhodamine (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה החמישית ב30 דקות בטמפרטורת החדר בchamb כהה humidified-TSTאה.
  15. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  16. ספוט 50 μl של נוגדן העז נגד סוס מצומד עם Rhodamine (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השישי ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified . הערה: הנוגדן העז נגד הסוס יזהה את הנוגדנים החמורים אנטי עכבר; כאשר עומדים לרשות החוקרת, נוגדן עז נגד חמור יעבוד גם כן.
  17. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. שטוף 5 דקות נוספות עם טריס-מלוח (TS).
  18. מייבש את התאים על ידי דגירה לאחר מכן ב70% אתנול במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. הסר את coverslips מ6 צלחות היטב, ולתת אוויר יבש במשך כמה דקות.
  19. לזהות ירידה של הרכבה בינונית עם DAPI (ראה חומרים כימיים) בשקופית זכוכית, ולהוסיף coverslip במהופך על גבי. לאטום שקופיות עם מסמר לכה ולהעריך את תוצאות דגים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל לשילוב דגי DNA-RNA, היינו מסוגל לדמיין איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים ממין נקבה. איור 1 מציג דוגמא מייצגת של ניסוי FISH DNA-RNA, שבו זיהינו את שני Xist (שהוא גלוי כXist RNA ענן שנקרא על כרומוזום X פעיל ולהצביע שעתוק בסיסי על כרומוזום X הפעיל), ואזור של כרומוזום X, המופיע כאות ממוקדת. שים לב שאחד מהאותות להצביע ממוקם בתוך ענן Xist, ובכך מראה כי ענן Xist אכן לוקליזציה לאורך, וציפוי כרומוזום X. בלמעלה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שילוב ה-DNA-RNA FISH יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לדנ"א דגים יכולים להיות קשים מדי עבור מולקולות RNA פחות יציבה. כמה גישות יושמו ללמוד שני DNA ו-RNA באותו התא, לעקוף את הצורך בדגירה בו זמנית עם בדיקות לזיהוי שני DNA ו-RNA. לדוגמא, בגישת חפיפה, דגי RNA הראשונים מתבצע, ותאים הם צילמו, וקואורדינטות נלקחות. בהמשך לכך, אותו השקופיות המשמשות לדגי ה-DNA, שבמהלכו האות של RNA FISH הולכת לאיבוד. לאחר FISH-DNA, התאים הם צילמו שוב, והתמונות שהתקבלו משני RNA ודגי DNA ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים לכל חברי המחלקה לשעתוק ופיתוח של ארסמוס MC בעבר ובהווה על דיונים מועילים ומעוררים במהלך השנים האחרונות. אנו רוצים גם להודות לשלושת הסוקרים האנונימיים על מתן משוב מועיל. העבודה במעבדת גריבנאו נתמכת על ידי מימון ממועצת המחקר ההולנדית (NWO-VICI) ומענק התחלתי של ERC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גזע עובריים של עכברים נקבותיהיו זמינים על פי בקשה
פיברובלסטיםמעוברי E13.5, או באמצעות מקורות מסחריים למשל
מדיוםתרבית תאי ES MilliporeDMEM, 15% סרום עגל עוברי, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1 מ"מ γ-מרקפטואתנול, ו-1,000 U/ml LIF. מסננים, מעקרים ומאחסנים ב-4 & #176; C למשך שבועיים לכל היותר.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
סרום עגל עובריInvitrogen10099141
פניצילין– סטרפטומיצין (100x)Invitrogen15140-122
חומצות אמינו לא חיוניותInvitrogen11140-050
γ-mercaptoethanolSigma-AldrichM7522
מדיום התמיינות תאי ES, 15% סרום עגל עוברי מומת בחום, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, חומצות אמינו לא חיוניות, 37.8 μ l/L monothioglycerol ו-50 μ גרם/מ"ל חומצה אסקורבית
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
חומצה אסקורבית (50 מ"ג/מ"ל)Sigma-AldrichA4403
מונותיוגליצרולSigma-AldrichM6145
T25 כלי תרבית תאיםגריינר ביו-וואן690160
כלי תרבית תאים 6 בארותגריינר ביו-וואן662160
PBSSigma-AldrichD8537
Trypsin-EDTA בדרגת תרבית תאים 0.25% (v/v) טריפסין/0.2% (w/v) EDTA ב-PBSGibco25200-056
צינורות פלקוןFalcon352196
24 x 24 מ"מ כיסוייםMenzle780882
Sigma-AldrichG1890-100Gמכינים תמיסת PBS של 0.2% ג'לטין/תרבית תאים, וחיטוי
פפסיןסיגמא-אולדריץ'P7000מדולל ל-0.2% ב-0.01 M HCl (pH 2.0)
מוחלט 100% אתנולSigma-Aldrich32221-2.5Lהשתמש ב-100% אתנול מוחלט ו-RNAse מים ללא אתנול כדי לייצר 70% ו-90% תמיסות אתנול
בקסטרTKF7114
קצות מסנן סטרילייםRainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
ערכת תיוג דיגוקסיגנין (תרגום DIG-Nick)ביוטין
(תרגום ביוטין ניק)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
מזרק 2 מ"לBD Plastipak300013
כותנה
שפופרות אפנדורףEppendorf
שמרים tRNA 10 מ"ג/מ"לInvitrogen15401-029
DNA זרע סלמון 10 מ"ג/מ"לInvitrogen15632-011
מיטת עכבר-1 DNA 1 מ"ג/מ"לInvitrogen18440-016
Eppendorf ספסל עליון מיקרוצנטריפוגהEppendorfדגם 5417R
צנטריפוגה מקוררת EppendorfEppendorfדגם 5810R
2 M NaAc, pH 5.6Sigma-AldrichS7670
50+ תמיסת50% פורממיד, 2x SSC, 50 מ"מ מאגר פוספט pH 7, 10% דקסטרן סולפט pH 7
פורממידאקרוס אורגניים3272350000
דקסטרן סולפטFluka31403
10 מ"מ מאגר פוספט, pH 7הוסף 57.7 מ"ל של 1 M Na2HPO4 ו-42.3 מ"ל 1 M NaH2PO4; השתמש במים מטופלים DEPC
ובמאגר70% פורממיד/2x SSC/10 מ"מ מאגר פוספט pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7.5 תמיסת
כביסה Tris-saltine-Tween (TST)100 מ"ל 10x מי מלח, 50 מ"ל 2M Tris, 500 & #956; l Tween-20, להוסיף מים ללא RNAse עד 1 ליטר
תמיסתלהמיס 85 גרם NaCl ב-1 ליטר H2O ללא RNAse, וחיטוי
Tris-מלח-BSA (TSBSA)500 μ l 10x מי מלח, 250 & #956; l 2 M Tris, 1 מ"ל 100x BSA, 3.25 מ"ל ללא RNAse H2O
BSA, מטוהר, 100xNew England BiolabsB9001S
נוגדן נגד חפירה כבשיםאבחוןשימוש 1:500 מדולל
בנוגדנים נגד כבשים TSBSA מצומד עם FITCג'קסוןשימוש 1:250 מדולל בנוגדנים נגד ארנב TSBSA
מצומד עם FITCJackson מעבדות משתמשות ב-1:250 מדולל
בנוגדנים נגד ביוטיןאבחוןמשתמש ב-1:200 מדולל
בנוגדנים נגד עכבר TSBSA מצומד עם רודמיןג'קסון מעבדותשימוש ב-1:250 מדולל בנוגדנים נגד סוס עזים TSBSA
מצומד עם רודמיןג'קסון מעבדותמשתמשות ב-1:250 מדולל בתמיסת כביסה TSBSA
Tris-מלח (TS)10 מ"ל 10x מי מלח, 5 מ"ל 2 M Tris, 85 מ"ל ללא RNAse H2O
מדיום הרכבה Vectashield עם DAPIVectorlabsH-1200
לכה
לציפורניים מיסקרוסקופ פלואורסצנטי
תאי ניתן להפיק עובריים של עכברים IMDM-Glutamaxערכת תיוג 11745816910 Rocheמעוקרת30120086 הכלאה דנטורציה חיטוי מלח 10x רוש מעבדות TSBSA רוש

מקורות

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FISH משולב של DNA ו-RNAזיהוי RNA של Xistסימון גשושי DNAתרגום חריצים (Nick Translation)מיקרוסקופיה אימונופלורסצנטיתקיבוע בפראלדהידתמיסת היברידיזציהנוגדנים פלואורסצנטיים
DNA-RNA בשילוב פלורסנט
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.