הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

11.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51640

⸱

2 ביוני 2014

 ,  , 
1Monell Chemical Senses Center

במאמר זה

סיכום

דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.

תקציר

ניחוחות ליצור דפוסים ייחודיים וחופפים של הפעלה קולטני ריח, המאפשרים למשפחה של כ -1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים להכיר אלפי ניחוחי. ligands odorant פורסמו על פחות מ -6% של קולטנים אנושיים 1-11. זה חוסר הנתונים נובע בחלקו לקשיים תפקודי המבטאים קולטנים אלה במערכות Heterologous. כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי המכריע של משפחת חוש הריח קולטן בתאי Hana3A, ואחריו הערכת תפוקה גבוהה של הפעלה קולטני ריח באמצעות assay כתב בלוציפראז. assay זה יכול לשמש כדי (1) פנלי מסך של ניחוחי נגד פנלים של קולטני ריח; (2) לאשר אינטראקציה odorant / קולט באמצעות עקומות מינון תגובה; ו (3) להשוות את רמות הפעלת קולטן בין גרסאות הקולטן. בנתוני הדוגמא שלנו, 328 קולטני ריח הוקרנו נגד 26 הניחוח. זוגות odorant / קולטן עם ציוני תגובה שונים היו אין תמיכה בבחירהטד ונבדק בתגובה מינון. נתונים אלה מצביעים על כך שמסך הוא שיטה יעילה להעשרה לזוגות odorant / קולט שיעברו ניסוי תגובת מינון, כלומר הקולטנים שיש לי תגובה בתום לב לodorant. לכן, assay לוציפראז תפוקה גבוהה זו הוא שיטה יעילה לאפיון קולטנים צעד חיוני חוש הריח לכיוון מודל של קידוד ריח במערכת ההרחה של היונקים.

מבוא

מערכת חוש הריח של היונקים יש את היכולת להגיב למספר עצום של גירויים ריחניים, המאפשרים זיהוי ואפליה של אלפי ניחוחי. קולטני ריח (אס) הם החיישנים המולקולריים שהביעו עצב סנסורי חוש הריח באפיתל ההרחה 12. הכרת ריח יונקים מתרחשת באמצעות הפעלת ההפרש של חדרי ניתוח על ידי ניחוחי, ו-OR משפחת הגן היא נרחבת, עם בערך 1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים 12-16. הניתוחים תפקודיים קודמים של חדרי ניתוח בתאי עצב של חוש ריח ובתאי Heterologous הראו כי ניחוחי שונה מוכרים על ידי ייחודי, אבל חופף הרכבים של חדרי ניתוח 10,17-20. התאמת ligands לחדרי ניתוח היא קריטית להבנת הקוד וחיוני לבניית מודלים מעשי של חוש ריח חוש הריח. בשל קשיים להביע חדרי ניתוח במערכות Heterologous, כמו גם מספר רב של שניהם ניחוחי וחדרי ניתוח, הנתונים אלה נעדרו במידה רבה מfield; אכן, פחות מ -6% מחדרי ניתוח באדם יש ליגנד פורסם 1-11. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay לוציפראז לאפיין odorant / או אינטראקציות. assay זה מאפשר אפיון התפוקה גבוהה של או.אר. אס, משימה שהיא חיוני להבנת odorant / או אינטראקציות כמו גם בפיתוח מודל של קידוד ריח.

מחקרי תפוקה גבוהה של חדרי ניתוח בפני שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, או.אר. האס באו לידי ביטוי בתאי Heterologous נשמרו בחדר המיון ומושפל לאחר מכן בהפרוטאזום 21,22, מניעת חדרי הניתוח מאינטראקציה עם ניחוחי במערכת assay 23-25. בעיה זו טופלה על ידי הגילוי של חלבוני אבזר המאפשרים ביטוי על פני קרום התא יציב של מגוון רחב של חדרי הניתוח 19,26,27. קולטן חלבוני טרנספורטר-1 ו -2 (RTP1 ו2) לקדם או ביטוי על פני קרום תא והפעלה בתגובה לגירוי odorant 19. המבוסס על עבודה זו, תאי HEK293T היושונה כדי להביע את היציבות RTP1 ארוך (RTP1L) וRTP2, חלבון שיפור ביטוי הקולטן 1, וαolf G, וכתוצאה משורת תאי Hana3A 19,27. בנוסף, קולטן מסוג 3 מוסקריניים אצטילכולין (M3-R) אינטראקציה עם חדרי ניתוח על פני התא ומשפר הפעלה בתגובה לניחוחי 26. Co-transfection של OR עם RTP1S וM3-R לתוצאות תאי Hana3A בביטוי חזק, עקבי ופונקציונלי של מגוון רחב של חדרי ניתוח על פני תא 27. שנית, יונקים או רפרטוארים הם גדולים למדי. בבני אדם, למשל, רפרטואר OR הוא סדר גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט התעורר אצלם, ו -2 סדרי גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט החזותי. למרות שיבוט בודד או הוא פרוטוקול פשוט יחסית, נדרש מאמץ מעלה מול משמעותי כדי ליצור ספרייה מקיפה. שלישית, למרות שאנו יודעים כי בראייה, אורך גל מתורגם לצבע ובתדירות אודישן מיתרגם המגרש, והארגון של ריחות הוא הבין היטב, מה שהקשה על חוקרים ללשרבב ממדגם מייצג של ניחוחי. למרות שחלק מהתקדמות שנעשתה ב10,28 חזית זו, המפה של נוף חוש הריח נשארת שלמה. הקרנת עשרות אלפי מולקולות נגד מאות חדרים הניתוח היא משימה מרתיעה; מסכי תפוקה גבוהה בתחום זה דורשים קמפיינים שהוגדרו בזהירות. האתגרים הנותרים העיקריים הם אלה של לוגיסטיקה ועלות ולא בעיות הטמונות לטכניקה. למרות הקרנת Heterologous לא הייתה בשימוש נרחב כדי לזהות ligands ידי קבוצות אקדמיות, חברה פרטית שהשתמשה באותה הטכניקה כדי לזהות ligands ל100 חדרי ניתוח אנושיים 29. למרבה הצער, הנתונים האלה יישארו קניינית.

יש assay לוציפראז התפוקה גבוהה המתוארים כאן מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות המשמשות להערכה או הפעלה. למרות responses של עצב סנסורי חוש הריח האם נמדד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה סידן, יש טכניקות אלה מתקשים מתגרים מזה בו או גורם לתגובה של נוירון בשל החפיפה במאפייני תגובה לנוירונים חוש הריח. למרות דפיקות-בסוג הקולטן-GFP שכותרת 30,31, אספקת קולטנים ספציפיים באמצעות adenovirus לMurine נוירונים חוש הריח 32,33, או ביצוע RT-PCR אחרי הקלטות 17,24,33 יכולים לקשר הקלטות לסוגים בודדים קולט, שיטות אלו נמוכה תפוקה ואינה מתאים למסכים בקנה מידה גדולה. מערכות הקרנת Heterologous הן מדרגי יותר, ושתי צורות עיקריות נמצאות בספרות: כתבי מסלול cAMP ואדנוזין אינוזיטול כתבי מסלול (IP3). על גירוי ריח, או.אר. אס להפעיל מפל איתות התמרה αolf G כי תוצאות בייצור של AMP המחזורי (cAMP) 12. על ידי שיתוף transfecting גן כתב גחלילית בלוציפראז תחת שליטתו של acאלמנט התגובה AMP (CRE), ייצור לוציפראז ניתן למדוד כפונקציה של תגובת ריח, המאפשר כימות של או הפעלה. או הפעלה יכולה גם להיות קשורה למסלול IP3 על ידי שיתוף להביע G-חלבונים כגון G α15/16 או 24,25,34 הכימרה α15-OLF G. אנו בחרנו בassay המוצג כאן מבוסס על שלושה גורמים: (1) שיתוף הביטוי של RTP1 עם קולטני ריח מתויג-Rho משפר את הביטוי של קולטני ריח בתא השטח 19,27; (2) שימוש בגן ​​כתב cAMP מגיב מאפשר למדידה או ההפעלה דרך מסלול השליח השני הקנונית; ו (3) assay הוא מתאים היטב למסכי תפוקה גבוהה.

assay לוציפראז תפוקה גבוהה זה חל על מגוון רחב של מחקרים חשובים בתחום לחוש ריח. ראשית, מספר גדול של חדרי ניתוח יכול להיות מוקרן נגד odorant בודד על מנת לקבוע את דפוס הפעלת קולטן עבור spodorant ecific. סוג זה של מחקר זיהה OR7D4 כאו אחראי למתן מענה לandrostenone odorant סטרואידי 8. לעומת זאת, אחד או יכול להיות מוקרן נגד פנל של ניחוחי על מנת לקבוע את פרופיל תגובת קולט 10. כאשר odorant מועמד חוש הריח / או זוגות מזוהים באמצעות מסכי אלה, אינטראקציה יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע ניסוי תגובת מינון בוחן את התגובה של או לריכוזים הולך וגדל של odorant. עקומות מינון תגובה יכולות גם להעריך כיצד שונות גנטיות באו משפיעה בתגובה odorant מבחנה 8,9,11,35, וניתן להרחיב את הלימודים האלה לinterspecific או וריאציה, המאפשרים הבדיקה של אבולוציה קולטן על פני מינים ומוטציות סיבתי באבולוציה 36,37, לבסוף, assay זה יכול לשמש מסך ליריבי ריח כי הם מסוגלים להרגיז או תגובה לodorant במיוחד עבור זוג odorant / קולט ידוע 38,39. לסיכום, זה גבוהassay לוציפראז התפוקה הוא ישים למגוון רחב של מחקרים שיעזרו לאפיין או דפוסי הפעלה ולספק הבנה טובה יותר של קידוד ריח במערכת חוש הריח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות של תאי Hana3A

  1. הכן תקשורת M10 ידי להשלים בינוני מינימום הכרחי (MEM) עם 10% (v / v) FBS.
  2. תחזוקת תרבות
    1. שמור על תאים בתקשורת M10. הערה: וקטורי הביטוי לRTP1L, RTP2, REEP1, ו-G αolf להקנות עמידות puromycin לתאי Hana3A, אבל השמירה על התאים עם אנטיביוטיקה זה לא משפיע באופן משמעותי תוצאות assay.
    2. תת ביחס של 1:08 ב10 מנות סנטימטר כל 2-3 ימים.
    3. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2.

2. תאי ציפוי עבור transfection

  1. תקשורת לשאוב מ100% מחוברות 10 צלחת סנטימטר של תאי Hana3A.
  2. שטוף תאים על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS, מתערבל הצלחת, וaspirating PBS.
  3. הוסף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA ולחכות לתאים לנתק (כ 1 דק ').
  4. להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר M10 ולשבור את גושי תא על ידי triturating בערך 10x &# 160; עם טפטפת 10 מיליליטר. פיפטה בזהירות כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתקשורת.
  5. לכל צלחת 96 היטב, העברת 1 מיליליטר של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות, ולשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה.
  6. Resuspend התאים 6 מיליליטר M10 לכל 1 מיליליטר של תאים שהועברו בשלב 2.5.
  7. פיפטה 50 μl של תאים היטב בכל צלחת 96 היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.

3. Transfection של קולטני ריח

  1. הכנת פלסמיד דנ"א
    1. הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות פרוטוקול ללא רעלן פנימי. הערה: ערכות הכנה השתמש בפלסמיד דנ"א מיועד ", רעלן פנימי ללא תשלום," או להוסיף שלב חילוץ פנול, כלורופורם לפרוטוקול הכנת פלסמיד דנ"א.
    2. לדלל DNA לריכוז של 100 ng / μl בTE חיץ.
  2. שימו לב לתאים מצופים (שלב 2.7) כדי להבטיח confluency נכון של approximately 30-50% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: בעוד confluency זה לא אופטימלי למגיב transfection השומנים בדם, confluency של 30-50% בשלב זה הוא אופטימלי למדידת פעילות לוציפראז 24 שעות לאחר transfection.
  3. הכנת Transfection Mix
    1. פיפטה RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL פלסמידים לתוך מדיום MEM כל הכרכים מפורטים בטבלה המס '1 כדי להפוך את תמהיל פלסמיד (כרכים שצוין הם לכל צלחת 96 היטב).
      תערובת פלסמיד
      בכל טוב לכל צלחת 96 היטב
      MEM - 500 μl
      RTP1S-PCI 5 ng 480 ng
      M3-R-PCI 2.5 ng 240 ng
      PCRE לוק 10 ng 960 ng
      pSV40-RL 5 ng 480 ng

      טבלת 1. רכיבי פלסמיד תערובת. היטב ולכל כרכי 96 גם צלחת של RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL, וממ.
    2. לכל צלחת 96 היטב, לדלל 18 מגיב transfection שומנים μl ב450 בינוני MEM μl.
    3. פיפטה פלסמיד תערובת (משלב 3.3.1), קולטני ריח מתויג rhodopsin בפלסמיד PCI (Rho-OR-PCI), ותמהיל שומנים transfection (משלב 3.3.2) כדי להפוך מפורט מורכבים ב טבלה 2. מערבבים את הפתרון על ידי טחינה דקה ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת M10 לפי טבלה 2 הערה:. התגובה הזו היא זמן רגיש ולא צריך להיות מותר להמשיך ליותר מ 30 דקות. חישוב +10% גם הוא חשוב כדי להבטיח נפח מספיק לשלבים הבאים.
      מורכב
      בכל טוב לכל טוב +10%
      תערובת פלסמיד 4.2 μl 4.58 μl
      Rho-OR-PCI 0.05 ng 0.06 ng
      תערובת transfection שומנים בדם 4.2 μl 4.58 μl
      M10 41.7 μl 45.83 μl

      טבלה 2. רכיבים מורכבים. היטב ולכל כרכים + 10% גם של תערובת פלסמיד (טבלת 1), פלסמיד חוש הריח קולט (Rho-OR-PCI), ותערובת transfection שומנים בדם. M10 מתווסף כדי להרוות את התגובה הבאה דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  1. הקש את התקשורת על צלחות התא.
  2. פיפטה 50 μl של מורכב זה לזה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.

4. ריח גירוי

  1. שים לב לתאים transfected כדי להבטיח confluency נכון של 50-80% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: אם תאים הם פחות מ 50קריאות% ומחוברות, גחלילית לוציפראז ולוציפראז Renilla עלולות להיות נמוכות מדי למדידת הפעלת קולט. תשקול לבטל את הצלחת.
  2. הכן 1 פתרונות מניות M של כל ריח בDMSO.
  3. הכן את פתרונות גירוי ריח במדיום CD293.
    1. על ניסויי הקרנה, לדלל פתרון מניות של ריח ל100 מיקרומטר. כמו כן להכין שליטה ללא ריח (CD293 בלבד) על מנת לשלוט לאו הפעלה ברקע. הערה: לניסויי הקרנה, כל זוג או / ריח הוא נבדק רק פעם אחת בכל ניסוי. בגלל כמה דיפוזיה ריח פני בארות אפשרית, מומלץ לעורר עם odorant אחד לכל צלחת.
    2. לניסויי תגובת מינון, להכין שבעה דילולים סדרתי של פי 10 של פתרון מניות ריח בשלושה עותקים החל משעת 1 מ"מ לכל קולטן. כמו כן להכין את אותו ריח דילולים בשלושה עותקים לתאי transfected וקטור ריקים כדי לשלוט על הפעלת רקע ריח. הערה: לניסויי תגובת מינון, כל אחד oטיפול ריכוז dor צריך להתנהל בשלושה עותקים.
  4. הקש את התקשורת על צלחות התא.
  5. 25 μl פיפטה של ​​פתרון גירוי ריח לכל היטב דגירה במשך 4 שעות.

5. מדידה או לפעילות באמצעות בלוציפראז Assay

  1. Resuspend מצע גחלילית לוציפראז להוראות היצרן וחנות ב -80 ° C.
  2. להפשיר 1 מיליליטר של מצע גחלילית בלוציפראז לכל צלחת 96 היטב.
  3. הכן את תגובת גחלילית לוציפראז טרי מרווה ומגיב לוציפראז Renilla מצע (5 לוציפראז μl מרווה / מצע לוציפראז Renilla לכל 1 מיליליטר של חיץ). הערה: כ 1 מיליליטר של מגיב הוא זקוק לכל צלחת 96 היטב.
  4. הכן את קורא microplate זורח. פתח את תוכנת microplate קורא. בתוך סמל המערכת:
    1. תחת "טרום החימום" Tab, סמן את התיבה למצב "ON" ולהגדיר את הטמפרטורה של המכונה ל25 °; ג
    2. תחת הלשונית "Dispenser", ראש כל מתקן עם 1,000 μl של 70% אתנול ואחרי 1,000 μl של מים מזוקקים. הערה: השתמש aliquots נפרדים של אלכוהול ומים לכל מתקן. אתנול משמש לחיטוי מכשירי, ומים מסיר אתנול שיורית.
    3. ראש כל מתקן עם 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: תחול עם אוויר מבטיחה כי מצעי לוציפראז אינם מדוללים במים שיורית.
    4. מתקן ראש 1 עם 1,080 μl של מצע גחלילית לוציפראז (משלב 5.2). מתקן ראש 2 עם מצע Renilla לוציפראז (משלב 5.3). הערה: היזהר שלא לחצות לזהם-מצעי לוציפראז. תחול עם מצעי לוציפראז ממלא את השטח המת במכשירים מגיב.
  5. הגדר את הפרוטוקול הבא לקרוא גחלילית שתי והארת לוציפראז Renilla. בתוך התוכנה הקשורים לקורא microplate, בלתידער תפריט "קובץ", לחץ על "משימה החדשה". סמן "פרוטוקולים" ולחץ על "צור חדש". בחלון הבא, העיגול שליד "תקן פרוטוקול" צריך להיות נבחרים. לחץ על "אישור". לחץ לחיצה כפולה על "נוהל" בצד שמאל של המסך.
    1. לוותר 10 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לכל הבארות באמצעות מתקן 1. תחת תפריט "פעולות", לחץ על "לוותר". בחלון "לוותר על שלב", קבע: "Dispenser" 1, "לקרקע" לאף אחד ", כרך לוותר" ל10 μl ו" שיעור "ל225 μl / sec. לחץ על "אישור".
    2. לנער את הצלחת ל30 שניות. תחת תפריט "פעולות", לחץ על "Shake". בחלון "Shake שלב", להגדיר "עוצמה" לבינוני ו" משך "ל00:30 MM: SS. לחץ על "אישור".
    3. קראו את הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. תחת תפריט "פעולות", לחץ על "קראו";. בחלון "קראו שלב", קבע: "איתור שיטה" להארה ", קראו סוג" לנקודתי קצה ", אינטגרציה בזמן" ל00:00:50 MM: SS: ss, "סטי מסנן" 1, "פליטה" לחור, "מיקום אופטיקה" למעלה, "רווח" ל135, ו" קראו גובה "ל1.00 מ"מ. לחץ על "אישור".
    4. לוותר 10 μl של מצע לוציפראז Renilla לכל הבארות באמצעות מתקן 2. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.1, למעט קבוצה "Dispenser" 2.
    5. Shake צלחת ל30 שניות. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.2.
    6. קראו הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.3.
  6. הסר את המכסה מצלחת 96 היטב ומניח את הצלחת בקורא microplate. הפעל את התכנית להקים בשלב 5.5 לקרוא הארה צלחת.
  7. נקה את המשאבות מנפק מגיב. מאייקון המערכת תחת לשונית "Dispenser":
    1. טהר 1,000 μl של fמצע לוציפראז irefly ממתקן גחלילית בלוציפראז לתוך צינור התאוששות. הערה: לוציפראז Firefly ניתן לאחסן ב -80 ° C ושימוש חוזר.
    2. ראש כל מתקן עם 1,000 μl של מים מזוקקים, ואחריו 1,000 μl של 70% אתנול, ולבסוף 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: מים מסיר מצעי לוציפראז מהמשאבות מגיב, מחטא אתנול, ואוויר מתייבש כל אתנול שיורית.

6. ניתוח נתונים

  1. יצוא נתונים
    1. בתוכנת microplate קורא, לחץ לחיצה כפולה על "הבונים דווח / יצוא" בצד השמאל של המסך.
    2. לחץ על הכפתור "חדש היצוא לאקסל" ולחץ על "אישור".
    3. סמן Export1 ולחץ על "ערוך".
      1. על פי "נוהל" "תוכן" לבדוק "תיאור מערכת", "תיאור פלייט", וגם "מטריקס הפריסה פלייט". כולל "נתונים גולמיים"nd "מחושב נתונים".
      2. תחת "עבודה", סמן "Autoexecute על השלמת ההליך". תחת יצוא מצב, לבדוק "כל הצלחות באותה חוברת העבודה" ו "כגיליון עבודה חדש".
      3. תחת "קובץ" בוחר את שם קובץ בפורמט ומיקום קובץ, ולחץ על "אישור".
      4. סגור את החלון "דווח / יצוא הבונים".
  2. כדי להשיג ערכי לוציפראז מנורמלים, לחלק את קריאת גחלילית לוציפראז הארה לכל טוב (שלב 5.6.3) על ידי קריאת Renilla הארה לכל טוב (שלב 5.6.6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מסך ראשי נבדק 328 חדרי ניתוח נגד 26 ריחות בריכוז של 100 מיקרומטר. ריכוז ריח זה הוכח כדי להפעיל חלק גדול מחדרי ניתוח עם ligands הידוע 10 ביעילות. ראשית, פעילות לוציפראז המנורמלת הייתה מחושבת על ידי חלוקת קריאת גחלילית בלוציפראז ידי קריאת לוציפראז Renilla. בשלב בא, ערכי baselined היו מחושבים על ידי הפחתת קריאות לוציפראז המנורמלת לשליטה אין ריח מקריאות לוציפראז המנורמלת עבור כל היטב (איור 1). עקומות מינון תגובה בוצעו על 48 odorant / או זוגות מתפזר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זהות odorant מקודדת על ידי דפוסי הפעלה קולטני ריח, אבל דפוסי הפעלת קולטן, כולל שהקולטנים מופעלים ובאיזו מידה, ידועים פחות מ -6% מקולטניים ריח האנושי 1-11. מאמצים לאפיין קולטני ריח היו מוגבלים על ידי השיטות עתירות העבודה או תחולתם רק קבוצת משנה של 17,23,24,33,34 משפחה קולטני ריח. מערכת ביטוי Heterologous Hana3A תומכת בביטוי חזק של רוב קולטני ריח שנבדק, והוא יכול לשמש בשילוב עם מערכת כתב בלוציפראז cAMP מגיב כדי לפקח על הפעלה קולטני ריח 19,26,27. ביצו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי R01 DC013339, R03 DC011373, ורות ל 'Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס T32 DC000014. חלק מהעבודה בוצע באמצעות Monell chemosensory קולטן איתות הליבה, אשר נתמכה בחלקו על ידי מימון מDC011735 P30-NIH NIDCD Core גרנט. המחברים מודים ג Sezille לעזרה באיסוף הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי Hana3Aזמינים ממעבדת מטסונאמי על פי בקשה
RTP1S-pCIזמינים ממעבדת מטסונאמי על פי בקשה
M3-R-pCIזמינים ממעבדת מטסונאמי על פי בקשה
pCRE-lucAgilent219076LUC
pSV40-RLPromegaE2231RL
Minimum Essential Media, EagleSigma AldrichM4655MEM
FBSLife Technologies16000-044FBS
PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)Cellgro21-040-CVa href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS
טריפסין (0.05% טריפסין EDTA)Life Technologies25300Trypsin
CD293Life Technologies11913-019CD293
96-well PDL צלחת לבנה/שקופהBD BioCoat356693צלחות
מגיב טרנספקציה של שומנים: Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Lipofectamine
מצע לוציפראז גחלילית, מרווה לוציפראז גחלילית/Renilla מצע לוציפראז: Dual-Glo AssayPromegaE2980dual glo
Synergy S2 BioTekSLADa href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2
קורא Microplate: תוכנת ניתוח נתונים Gen5BioTekGen5Gen5
BIOSTACKBioTekBIOSTACK2WRBioStack
MultifloBioTekMFPMultiFlo
300 μ l GripTipsIntegra4433GripTips
12.5 μ l GripTipsIntegra4414GripTips
300 μ l GripTips ViaFlo96Integra6433XYZ tips
12.5 μ l GripTips 384 XYZIntegra6403XYZ tips
384ViaFloIntegra6030384ViaFlo
TE מאגרMacherey Nagel740797.1
DMSOSigma AldrichD2650-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& region=US">DMSO
ForskolinEnzo Life SciencesBML-CN100-0010FOR
<<תוכנת <

מקורות

  1. Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  2. Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
  3. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  4. Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
  5. Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
  6. Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
  7. Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
  8. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
  9. Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
  10. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
  11. Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
  12. DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
  13. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
  14. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
  15. Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87(2008).
  16. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
  17. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  18. Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
  19. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  20. Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
  21. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
  22. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
  23. Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  24. Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  25. Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
  26. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
  27. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
  28. Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
  29. Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
  30. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  31. Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  32. Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  33. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  34. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
  35. McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  36. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
  37. Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
  38. Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
  39. Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
  40. Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
  41. Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
  42. Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Hana3A
ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.