סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

Summary

assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שוטף סדרתי.

Abstract

הידבקות הלימפוציטים T נדרש עבור פונקציות מרובות תא T, כולל הגירה לאתרים של דלקת והיווצרות של סינפסות החיסונית עם תאי המציגים אנטיגנים. תאי T להשיג הידבקות מוסדרת על ידי שליטה על מאפייני ההדבקה של integrins, ברמה של מולקולות הידבקות תא מורכבות מזוגות heterodimeric של חלבונים הטרנסממברני כי אינטראקציה עם מולקולות מטרה בתאי שותף או מטריקס. Integrin תא T הבולט ביותר היא פונקצית הלימפוציטים אנטיגן קשור (LFA) -1, שהורכב מיחידות המשנה αL וβ2, היעד שלו היא המולקולה תאית ההידבקות (ICAM) -1. יכולתו של תא T כדי לשלוט בהדבקה נובעת מהיכולת לווסת מצבי הזיקה של integrins בודדת. איתות מבפנים החוצה מתארת ​​את התהליך שבו אותות בתוך תא יגרמו לתחומים החיצוניים של integrins להניח מצב מופעל. הרבה מהידע של תופעות מורכבות אלה שלנו מבוסס על מכניסטיתמחקרים שבוצעו בפשוט במערכות מודל חוץ גופית. Assay הידבקות הלימפוציטים T שתואר כאן הוא כלי מצוין שמאפשר לתאי T לדבוק ביעד מולקולות, בתנאים סטטיים, ולאחר מכן משתמש בקורא צלחת ניאון לכמת דביקות. assay זה כבר שימושי בהגדרת חומרי הדבקת גירוי או מעכבת הפועלים על לימפוציטים, כמו גם המאפיינים את אירועי האיתות מעורבים. למרות שתואר כאן לLFA-1 - ICAM-1 הידבקות בתיווך; assay זה ניתן להתאים בקלות כדי לאפשר לחקר אינטראקציות אחרות דבק (למשל VLA-4 - פיברונקטין).

Introduction

הידבקות הלימפוציטים T היא תהליך יסודי בתגובה החיסונית ^1. היא נדרשת לאינטראקציה תא T עם תאי אנדותל לקשט את קירות נימים, לאנטיגן סריקת הצגת תאים (APC) בבלוטות הלימפה, ולהיווצרות של סינפסות החיסונית (IS) עם תאי המטרה ^2. דרישות אלה הן מבחינה פונקציונלית וkinetically מובחן. התהליך של extravasation ימפוציטים מורכב מchemoattraction, הדבקה מתגלגלת, מוצקה, וגלגול. המעבר מהגלגול למיצוק הידבקות דורש תאי T להגיב לאות קולטן מצמידים חלבון G במהירות. תגובה זו מניבה אינטראקציה יגנד integrin שמאטה ומעצרי התא מתגלגל ^3. שינוי מיידי בלהיטות integrin מתווך את התהליך הזה. הגירה דורשת betweenTcells אינטראקציות דינמית ותאי האנדותל עם היווצרות של הידבקויות ב'הקדמי 'ושבירה של הידבקויות ב'האחורי'עם מרווח של כדקה בין יוצרים ושבירת ^4. הוא צורות inminutes, אבל צריך להישאר ללא פגע במשך שעות ^6.

מעניין לציין, כי מולקולת הידבקות אחד, פונקצית משפחת integrin הלימפוציטים חבר אנטיגן קשור (LFA) - 1, היא חיונית לכל התהליכים הללו ^5. LFA-1 מתווך הידבקות דרך אינטראקציות עם כמה מחברי superfamily אימונוגלובולינים. ליגנד למד נרחב ביותר בזיקה הגבוהה ביותר לLFA-1 הוא מולקולת ההידבקות אינטר (ICAM) -1. ללא הפעילו לימפוציטים במחזור להביע את הזיקה נמוכה LFA-1 על פני התא, ולכן אינם מסוגל לדבוק מצופה ICAM-1-משטחים. זיקת LFA-1 היא משתנה ומוסדר על ידי מספר אירועי איתות כגון הפעלת חלבון G בשילוב קולטן, גירוי ציטוקינים, ואותות מתווכים על ידי קולטנים תא T (TCR). צורת זיקה גבוהה וכתוצאה מכך של LFA-1 מעביר הפעלה תאית למרחב תאי לאאינטראקציות hrough עם ICAM-1. מסלול זה נקרא מבפנים החוצה איתות ^7. כמו כן, איתות דרך LFA-1 מהמרחב תאי נקראת מחוץ-באיתות.

איתות תאית מפלים מעורבים במבפנים החוצה ומחוץ-איתות הוא מוקד עיקרי של מחקר הנוכחי. GTPase Rap1 הקטן התפתחה לאחרונה כמרכיב המרכזי של מבפנים החוצה מאותת כי משותף לשתי קשירת TCR וציטוקינים איתות ^8. התפקיד הקריטי של Rap1 בהפעלת integrin מודגש על ידי הגילוי כי ביטוי יתר של Rap1 מגרה הידבקות integrin תלויה בתאי T, ואילו הדבקת תא T חסומה על ידי ביטוי של Rap1 השלילי הדומיננטי ^9. מקדמות אלה בהבנה של הרגולציה integrin ידי Rap1 שלנו היו להשיג באמצעות כלים במבחנה. אחד מהם הוא assay ההידבקות סטטית שתואר כאן.

המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד Tדביקות תא לICAM-1 משטחים מצופים. באופן ספציפי יותר, הוא משמש כדי למדוד באופן אובייקטיבי ולכמת זיקת LFA-1 לכיוון ligands הנגד שלה בתאים חיים בזמן אמת, בתנאים שונים. טכניקה זו משתמשת בארות קלקר מצופים ICAM-1 כדי לחקות את המשטחים התאיים שתאי T אינטראקציה עם. מבחני הידבקות תא T סטטי שתוארו קודם לכן רבים מהם היו בניסוי מורכבים. מבחני אלה לעתים קרובות נדרשים לתאי T שכותרתו רדיואקטיבית, מנוצלים תאים קרני שור בתרבית כדי ליצור מטריצה ​​תאית כמצע להידבקות תא T, או שנקראים לגירוי תאים לא פיסיולוגי T על הארכת משך לקדם הידבקות תא T ^10. השימוש במדידת fluorometric לכמת תאי T הבאים הדגירה ההידבקות היא שיטה רגישה יותר ומדויקת של כימות בהשוואה לזרימת cytometry ומיקרוסקופיה, כמנוצלים במערכות רבות assay אחרים ^11. בנוסף, microscop תא בודדניתוח ic של לוקליזציה integrin אינו מאפשר ניתוח באותו אופן כמו מדידת fluorometric הרחב, האוכלוסייה מבוססת. בעוד נוגדני מדינה ספציפית הפעלת LFA-1 זמינים באופן מסחרי, נוגדנים אלה מציעים רגישות נמוכה יחסית לשיטה שתוארה כאן. היתרון העיקרי על פני שיטות חלופיות הוא בפשטותו והיכולת לבחון תנאי ניסוי מרובים בו זמנית. כאשר שוקלים בשיטה זו עבור יישום מסוים, יש לקחת בחשבון שתאי T צריכים להיות נבחרו באופן שלילי, מבודדים טרי, ושסומנו בסמן פלואורסצנטי.

Protocol

1. ציפוי ולס Microplate

הערה: המטרה של שלב זה היא למשטחי קלקר מעיל עם ICAM-1 לשמש ligands לתא T LFA-1.

1. הכן את הפתרונות הבאים:
   1. הכן את פתרון הציפוי על ידי resuspending רקומביננטי ICAM-1 עם פוספט שנאגרו מלוח פתרון (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 2 מ"מ KH ₂ PO _4, pH 7.4) מועשר בסידן (1 מ"מ CaCl ₂₎ ומגנזיום (2 ננומטר MgCl _2). ודא שהריכוז הסופי של ICAM-1 הוא 10 מיקרוגרם / מיליליטר, עשוי מפתרון מניות 0.7 מ"ג / מיליליטר ושמר במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
   2. הכן את פתרון ההידבקות על ידי העשרת PBS עם אדם 0.5% (או שור) אלבומין בסרום (HSA / BSA), 2 מ"מ MgCl _2, ו 1 מ"מ CaCl _2.
   3. הכן את הפתרון לשטוף על ידי הוספת 2 מ"מ MgCl ₂ ו 1 מ"מ CaCl ₂ לPBS. לחמם את כל הפתרונות ל37° C לפני השימוש.
2. שטוף 24 בארות עם 50 μl של פתרון לשטוף. זה יכלול בארות רחוצות, (תאים שטופל PMA) חיוביים, ו( בארות ללא ציפוי) שליליות שולטת. עבור כל תנאי שנקבע לפחות שלוש בארות (בשלושה עותקים).
3. הוסף 50 μl של פתרון ציפוי היטב כל אחד. אל תוסיף לבארות שליטה ללא ציפוי. דגירה במשך שעה אחת בתוך 37 חממת מעלות צלזיוס.
4. לשאוב את פתרון הציפוי בעדינות, מבלי לאפשר את הקצה לגעת בחלקו התחתון של הבארות. שטפי פעם עם 50 μl של פתרון לשטוף.
5. הוסף 50 μl של פתרון הידבקות ודגירת microplate במשך שעה אחת בתוך 37 חממת מעלות צלזיוס.
6. לשאוב בעדינות ולשטוף פעם עם 50 פתרון לשטוף μl. השתמש בצלחת באותו היום, אך ניתן לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה, ולהשתמש בו ביום שלמחרת.

2. בידוד תא T מהדם

1. הוסף קוקטייל העשרת תא אנושי T ב50 μl / מיליליטר of כל דם (למשל עבור 3 מיליליטר של תרופה נוגדת קרישה (הפרין, EDTA, או ציטראט) כל דם, להוסיף 150 μl של קוקטייל). מערבבים היטב.
2. דגירה 20 דקות בטמפרטורת חדר.
3. לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להוסיף 3 מיליליטר של דם שטופל ונפח שווה של PBS (ללא סידן ומגנזיום) מועשר ב1% D-גלוקוז בטמפרטורת חדר. מערבבים בעדינות עם פיפטה פסטר.
4. הוסף 15 מיליליטר PLUS Ficoll-Paque לצינור צנטריפוגות.
5. שכבת זהירות מיליליטר 6 בדילול דגימת דם על מדיום הבידוד לימפוציטים.
6. צנטריפוגה ב XG 400 עבור 20 דקות ב20 ° C עם הפסקה משם.
7. לצייר את השכבה העליונה בעזרת פיפטה פסטר נקייה, ומשאיר את שכבת הלימפוציטים באין מפריע בממשק. השכבה העליונה של פלזמה ניתן לשמור לשימוש מאוחר יותר. בעזרת פיפטה פסטר נקייה להעביר את שכבת הלימפוציטים לצינור צנטריפוגות נקייה.
8. הוסף 3 כרכים (9 מיליליטר) של PBS לימפוציטים. להשעות את התאים בעדינות על ידי DRAכנפם פנימה וחוצה של פיפטה פסטר.
9. צנטריפוגה ב XG 400 5 דקות ב20 ° C.
10. הסר את supernatant. לימפוציטים עכשיו צריכים להיות מושעים במדיום המתאים לבקשה. להעביר את תאי בקבוק תרבות T-75 ב20 מיליליטר RPMI 1640 מדיה מכילה 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין.

3. הכנת התאים

הערה: תנאי הכרחי הוא לתאים להיות מתויגים עם מגיב ניאון. בפרוטוקול זה משתמש באסתר carboxy העמסת succinimidyl (CFSE), חלבון ירוק לעומת זאת ניאון (GFP) תאי מבטאים הם חלופה מקובלת.

1. רוזן 2.4 x 10 ⁶ תאי T (1 x 10 ⁵ לכל גם) באמצעות hemocytometer.
2. Resuspend התאים בתקשורת התרבות חסר סרום (נסיוב רעב). דגירה התאים עבור שעה 2 בחממת 37 מעלות צלזיוס.
3. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות (400 XG). לשאוב את התקשורת וresuspend ב 1 מיליליטר PBS.
4. להוסיף CFSE ב1:1,000 דילול (מניות שנעשו עד 5 מ"מ). כסה מאור ודגירה במשך 8 דקות בטמפרטורת חדר.
5. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS ולסובב ב XG 400 למשך 5 דקות.
6. Re-להשעות תא גלולה עם 1.2 מיליליטר של תמיסה מחוממת מראש הידבקות (1 x 10 ⁵ תאים לכל 50 μl).

4. גירוי של התאים

הערה: על מנת ליזום הידבקות, יש לגרות את התאים. בניסוי הבא תאי מגורה דרך TCR באמצעות נוגדנים אנטי CD3 crosslinking, לעומת זאת מסיס SDF-1 יכול לשמש כחלופה. בהתאם למטרת הניסויים, ניתן להוסיף חומרים כימיים תרופתיים שונים לפני או במהלך הגירוי ללמוד את ההשפעה על הידבקות הסלולר. אצטט Myristate phorbol (PMA) היא אסתר phorbol כי הוא דומה מבחינה מבנית לגליצרול השני diacyl השליח (DAG) ולכן מפעיל קינאז מרובהזה במורד הזרם TCR (בעיקר חלבון קינאז C); כאן הוא משמש כביקורת חיובית.

1. לחמם את microplate 37 ° C.
2. מחלקים את התאים לתוך 8 1.5 מיליליטר צינורות ריקים (150 μl בצינור אחד), צינור אחד לכל מצב.
3. פנק את התאים בהתאם:
   1. לעורר צינור אחד עם PMA ב10 ng / ml כדי לשרת את השליטה חיובית. שמור על שלושה צינורות שלא טופל, כדי שישמש כבקרה לגירוי ("אין גירוי"), בקרת טעינה רחוצה ("לא לשטוף"), ובקרה לציפוי ICAM-1 ("ללא ציפוי").
   2. לעורר ארבעה צינורות עם ריכוזים שונים של נוגדנים אנטי CD3 (0.1, 1, 5, ו 10 מיקרוגרם / מיליליטר). המשך לשלב הבא ללא עיכובים.
4. Aliquot 50 μl תמהיל תא מגורה לכל ריק היטב. המספר הסופי של תאים לכל גם הוא 1 x 10 ^5.
5. הנח את microplate ב37 ° C החממה במשך 15 דקות.
   הערה: שורות תאי T מסוימות דורשות Stimula קצר יותר זמן tion. במהלך תקופה זו, התאים יירגעו לתחתית הבארות ולדבוק ligands היעד.

5. שטיפת תאים שאינם חסיד

הערה: המטרה של שלב זה היא להסיר תאים שלא היו מסוגל ליצור קשר הדוק עם המשטחים מצופים ליגנד. השתמש פיפטה רבה לצעד זה על מנת להבטיח כי אותם הכוחות פיזיים חלים על כל הבארות. זה חשוב כדי לשמור על בארות שליטה המצוינות המלוכלכות כדי לסייע בחישוב של אחוז מתאים חסיד.

1. הוסף 150 μl של פתרון הידבקות חם לכל בארות. לנער את הצלחת בעדינות במשך כמה שניות לפני הסרת המדיום מהבארות. אל תיגע בחלק התחתון של הבארות עם הטיפים.
2. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. שינוי הכיוון של פיפטה כאשר pipetting החיץ פנימה והחוצה.

6. קביעת אחוז התאים חסידים

_content "> הערה: בשלב זה קורא צלחת ניאון משמש למדידת עוצמת הניאון בתוך כל גם בעוצמה היא בקורלציה ישירה עם מספר התאים חסיד..

1. הפעל את קורא הצלחת. פתח את תוכנת צלחת קורא על ידי לחיצה על סמל קיצור דרך על שולחן העבודה.
   1. מתפריט "המשימות" לחץ על "חדש" כדי להגדיר את פרוטוקול חדש.
   2. מתפריט "פעולות" בחר באפשרות "קרא". לחץ על "עוצמת פלורסנט" ופגעתי בכרטיסייה "אישור".
   3. מתפריט הנפתח בחר "גל עירור 485" ו "פליטת גל 528". הכה את הכרטיסייה "אישור".
   4. בתפריט האפשרות "אופטיק" בחר "תחתון" ופגע "אישור" הכרטיסייה. חזור לתפריט "פעולות" ולהגדיר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולחץ על "אישור".
   5. הכנס את microplate לקורא הצלחת ולחץ על "הפעלה". התוצאה ניתן לייצא לגיליון אלקטרוני Excel.
2. לחשב את אחוז התאים חסיד באמצעות הנוסחה הבאה: אחוז התאים חסיד = (עוצמת ניאון ממוצעת לקרוא בבארות שטפו) / (עוצמת ניאון ממוצעת קוראת בתאים רחוצים) x 100%.

Results

להלן דוגמא של assay הידבקות תוך שימוש בתאי T עיקריים מגורה עם ריכוזים שונים של נוגדנים אנטי CD3. זה שימושי לדעת את הקרינה של תאים רחוצים (כלומר טעינת סך הכל). תאי unstimulated לשמש כביקורת שלילית ותאים שטופלו PMA הם הבקרה החיובית לנוגדנים אנטי CD3. תאים מצופים בבארות ללא ציפוי לשמש כביקורת לICAM-1. בניסוי טיפוסי אחוז תאי PMA טופל חסיד הוא בין 40% 50% ואילו אחוז תאי unstimulated הוא בין 5% ל 10%. שיטה חלופית לכמת דביקות סלולרית היא על ידי העלייה של פי חישוב של עוצמת ניאון ...

Discussion

ישנם מספר מבחני כדי ללמוד אותות להפעלת LFA-1 והידבקות תא T ^12. Cytometry זרימה משמשת למדידת מדינות זיקה LFA-1 בתאים חיים באמצעות נוגדנים חד שבטיים אשר נקלטות באופן סלקטיבי לאו bended או מורחב LFA-1. אחת המגבלות של שיטה זו היא שהיא אינה לוקחת בחשבון הלהיטות 'integrins. מבחני הגירה הם כלים שימושיים, אבל הם מודדים הגירה, ולא הידבקות עלובה בנקודת זמן ספציפית. מודלים עכבר ללמוד הגירת T לימפוציטים (למשל מודל רגישות יתר עורית) הם רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, עם זא...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
קורא צלחות	BioTek	Synergy H1 פיפטה רב-ערוצית היברידית
	פישר	21-377-829
מיקרופלייט 96 בארות עם תחתית אופטית	קורנינג קוסטאר	3603
רקומביננטי ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
נוגדנים נגד CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	בדיקות מולקולריות	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS המכילים סידן ומגנזיום	Gibco
לימפוציטים היקפיים	למשל עכבר או
	סיגמא-אולדריץ'	M8266
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	499609
תוכנת Open Gen 5 BioTek		גרסה 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
צינורות צנטריפוגה 15 ו-50 מ"ל	פישר	352099, 352070
פיפטות פסטר חד פעמיות מפלסטיק	פישר	13-711-7M
צלוחיות תרבית T-75	פישר	50-754-1366
RosetteSep T ערכת אריקת תאים	StemCell Technologies	15061