מאמר שיטה

הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס)

DOI:

10.3791/51648

⸱

6 ביוני 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Fisheries & Wildlife, Michigan State University, 2Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמד ים הים לאבד את כיס מרה ודרכי מרה במטמורפוזה, תהליך דומה לatresia מרה האנושי. קיבעון חדש ושיטת הבהרה (CLARITY) שונה כדי להמחיש את עץ המרה כולו באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור ניוון מרה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

atresia מרה הוא מחלה נדירה של ינקות, עם 1 ב15,000 תדירות מוערכת בארצות הברית דרום מזרח, אך נפוצה יותר במדינות מזרח אסיה, עם תדירות מדווחת של 1 ב5,000 בטייוואן. למרות שהרבה ידוע על ניהול atresia מרה, פתוגנזה שלה היא עדיין חמקמקה. צמד ים הים (מרינוס Petromyzon) מספק הזדמנות ייחודית לבחון את המנגנון והתקדמות של ניוון מרה. צמד ים הים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים: זחל, טפיל, ומבוגרים. במהלך המעבר מזחלים לנוער טפיל, צמד ים הים עובר מטמורפוזה עם ארגון מחדש דרמטי ושיפוץ במורפולוגיה חיצונית ואיברים פנימיים. בכבד, מערכת המרה כולו הולכת לאיבוד, ובם כיס המרה ועץ המרה. שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" שונה כדי להבהיר את כל הכבד והצומת עם המעי בצמד ים ים מותמרים.התהליך של ניוון מרה היה דמיינו ולהבחין במטמורפוזה צמד ים ים באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור atresia מרה במודל של בעלי חיים ייחודיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמד ים ים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים 1,2. צמד ים הזחל ים (L) מבלה את רוב הזמן במחילות כמו מתקני האכלת מסנן של קרקעית ים. לאחר שעובר שבעה שלבים מותמרים של שינויים דרמטיים במורפולוגיה וארגון מחדש באיברים פנימיים 3 חיצוניים, וכתוצאה מכך בני הנוער (JV) להיכנס לשלב טפיל שבמהלכו הם ניזונים דם ונוזלי רקמה מדג מארח, להגדיל את מסת הגוף יותר מ 100 פעמים . לאחר 1.0-1.5 שנות האכלה על דגי המארח בים או אגמים גדולים, מבוגרים להפסיק האכלה בתחילת האביב ונודדים לתוך נהרות כדי להשריץ ואז למות 1,2.

במהלך המטמורפוזה, כבד צמד ים הים מאבד את כיס מרה ועץ המרה כולו, פנוטיפ מוטנטי אבולוציוני המחקה את atresia המרה מחלת תינוק האנושי. atresia מרה תינוקות הוא מחלת כבד נדירה בילדים עם סיבוכים רפואיים קשים 4,5,6,7, 8,9,10, לעומת זאת פתוגנזה ואטיולוגיה של atresia המרה אינן ידועות ברוב 4. חולים עם אטרזיה המרה למות בתוך שנתיים לאחר לידה, אלא אם כן התערבות כירורגית (הליך קסאי) מתבצעת 5. כתוצאה מכך, חולים אלה מחייבים ניהול נרחב קליני ולעתים קרובות השתלה כבד 6. תאוריות של etiopathogenesis atresia מרה רבות הוצעו, כגון זיהום ויראלי, מומים מולדים, מחלות אוטואימוניות, ועלבון רעיל. עם זאת, תרומתו של כל לפיתוחה של atresia המרה נשארת חד משמעית 7,8,9,10.

בניגוד לתינוקות שסובלים atresia המרה פתולוגי, צמד ים הים לעבור בחינה התפתחותית מתוכנת atresia מרה ללא necroinflammation נרחב, סיסטיק או שחמת 10. בעלי החיים עלולים לסבול cholestasis חולפת במהלך תהליך זה 10, אבל להסתגל למצב ההתפתחותי הזהבאמצעות דה נובו סינתזה והפרשה של מלחי מרה במעי לאחר atresia מרה התפתחותי, בנוסף למנגנונים ידועים כגון הפחתה של סינתזת מלח מרה בכבד 11. תהליך התפתחותי זה בצמד ים ים מספק את ההזדמנות היחידה הידועה כדי לבחון את ההתקדמות של atresia מרה.

שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה במערכות עצבים של יונקים מורכבים על ידי הפיכת רקמות שלמות להידרוג'ל nanoporous השקוף אופטי 12. שימוש בכבד צמד ים ים ופרוטוקול CLARITY שונה, הדמיה בשלמות רקמות של ניוון מרה יכולה להיות מתועדת לאורך המטמורפוזה כבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרון הכנה

  1. הפוך L 1 10x 0.1 M חיץ מלוח פוספט (PBS, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic), 115 פוספט נתרן g (dibasic), ו87.66 NaCl גרם. ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
    1. הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר 10x PBS, ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O.
    2. הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 מיליליטר 10x PBS, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
  2. הפוך חיץ L 1 0.1M 10x פוספט (PB, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic) ו115 פוספט נתרן g (dibasic). ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
    1. הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר PB 10x,ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O.
    2. הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 PB 10x מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
  3. הפוך פתרון מונומר הידרוג'ל 400 מיליליטר (acrylamide 4%, 0.25% bis-acrylamide, paraformaldehyde 4%, 0.0075% persulfate אמוניום, saponin 0.0005% ב0.1 M PBS): לשקול 0.3 persulfate אמוניום גרם ו0.2 saponin גרם. הוספת 210 מיליליטר מזוקק H 2 O, acrylamide 40 מיליליטר 40%, 10 מיליליטר 2% bis-acrylamide, 40 מיליליטר 10x PBS (pH 7.4), 100 מיליליטר paraformaldehyde 16%, ומערבבים היטב.
  4. הפוך פתרון 4 L סליקה (4% SDS בחומצה בור 0.2 ז): לשקול 49.464 חומצה בור גרם ו160 גרם SDS. ממיסים בH על 3.5 L מזוקק 2 O, כדי להתאים את pH 8.5 עם NaOH, ולהביא את הנפח עד 4 L.
  5. הפוך פתרון גליצרול 80% L 1: מדוד גליצרול 800 מיליליטר, להוסיף 200 מיליליטר מזוקק H 2 O, ומערבבים היטב.

2. הכנת רקמה

  1. הכן פתרון הידרוג'ל מונומר וaliquot 10 מיליליטר לכל צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
  2. לנתח את כל הרקמות ולתקן בהידרוג'ל ל2 ימים ב 4 ° C. ודא כי פתרון הידרוג'ל הוא לפחות 10x הנפח של הרקמה.
  3. תביא את רקמות הידרוג'ל הקבועים (בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר) למכסת מנוע קטר.
  4. פלמר הרקמות קבועות הידרוג'ל ידי הוספת 5 μl TEMED, לערבב היטב, ולתת לשבת במנדף בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שעות.
  5. הסר את הג'ל העודף ביסודיות. הערה: ג'ל במיוחד יהיה לעכב את תהליך הסליקה וחדירת הנוגדנים במהלך מכתים.
  6. דגירה הרקמות קבועות ב10 מיליליטר ניקוי פתרון שבייקר אינקובטור נקבעו על 70 סל"ד ו50 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד שהרקמה הופכת שקופה. שינוי פתרון ניקוי לפחות פעם ביום ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון הסליקה.
  7. יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר 0.1 M PB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 rבערב, ו37 ° C במשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
  8. דגירה הרקמה הבהירה בפתרון הנוגדן הראשוני בPB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. שים לב: להפוך את פתרון נוגדן ראשוני מספיק כדי להטביע את כל הרקמות.
  9. יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
  10. בצע את השלבים הבאים בחדר חשוך או תחת אור עמום. כסה את הדגימות עם נייר כסף כדי למנוע הלבנת צילום.
  11. דגירה הרקמה הבהירה עם פתרון הניאון המשני נוגדנים בPB עם 0.1% טריטון X-100 וסרום החסימה ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס במשך יום 1.
  12. יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את f ג'ל העודפתrom הרקמה בעת שינוי פתרון החיץ.
  13. יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר PBS ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
  14. דגירה הרקמה הבהירה בגליצרול 80% ב70 סל"ד ו37 לילה מעלות צלזיוס.
  15. אחסן את הרקמה הצבעונית הניאון על 4 מעלות צלזיוס לפני מיקרוסקופיה confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אירועים התפתחותיים חשובים כמה להתרחש במערכת של כיס המרה במהלך המטמורפוזה צמד ים לים. צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס ומנוון (איור 1). שילוב של שיטת ההבהרה שונה וצביעה עם cytokeratin כבד סמן תא 19 (CK19, בהווה בשני cholangiocytes וhepatocytes לפני ואחרי מטמורפוזה 13) וBCL2 סמן אנטי אפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal, מערכת המרה כולו נתפסה לאורך ציר ה-Z ( איור 2) והמבנה 3 ממדים שוחזר (איור 3). מיקרוסקופיה confo...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא שונה משיטה חדשה הנקראת "בהירות" 12, שCrosslinks רקמות שלמות עם polyacrylamide כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous, ולאחר מכן רצועות מן קרום הפלזמה של הרקמה כדי להשיג שקיפות אופטית וחדירות macromolecular. "בהירות" מאפשרת הדמיה בשלמות רקמות של השלכה ארוך טווח וחיווט במעגל מקומי במערכת העצבים. שיטה חדשה זו יכולה לשמש גם כדי להמחיש את מערכת המרה כולו בכבד צמד ים הים במהלך מטמורפוזה. זהו אתגר בביולוגיה כדי להשיג מידע ברזולוציה גבוהה ולשמור ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לתרומה של מפרץ המונד ביולוגי תחנה, אגמי מרכז מדע גדול, גיאולוגי אמריקאי. אנו מודים גם למסגרת ד"ר מלינדה במרכז למיקרוסקופי מתקדם באוניברסיטת מדינת מישיגן לתמיכה הטכנית שלה במיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת דיג האגמים הגדולים לYWCD ו-WML.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
40% אקרילאמיד ביו-ראד161-0140
2% ביס-אקרילאמיד Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
אמוניום פרסולפט סיגמאA3678-25G
חומצה בוריתסיגמאB7901-1KG
ספונין סיגמא47036
נתרן דודציל סולפט SigmaL337-500G
נתרן פוספט (מונובסיסי)Sigma04269-1KG
נתרן פוספט (דו-בסיסי)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
גליצרול סיגמאG9012-500 מ"ל
16% פרפורמלדהיד מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710-S
כדורי NaOH EMDSX0590-3
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לכל מותג
כלי ניתוח כל מותג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Biliary DegenerationSea LampreyCLARITY MethodLaser Scanning Confocal MicroscopyImmunofluorescent StainingTissue ClearingHydrogel PolymerizationCytokeratin 19BCL TwoMetamorphic Stages

מאמרים קשורים