לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

הבנת התכונות מכאניות של dsDNA היא בעל חשיבות עליונה במדעים בסיסיים ויישומים הנדסיים. המבנה של dsDNA הוא מסובך יותר מאשר סולם סליל ישר בגלל זוויות גלגול, הטיה ופיתול בין זוגות בסיסים רצופים יכולות להשתנות עם רצף. תנודות תרמיות יכולות לגרום dsDNA לעבור מצבים שונים של תנודות קונפורמציה כגון כיפוף, פיתול ומתיחות. מעברים כגון היתוך ומסתלסל יכולים להתרחש גם בתנאים קיצוניים.

בין תנועות אלה, יש כיפוף dsDNA ההשפעה הביולוגית הבולטת ביותר ^1. כיפוף dsDNA קשור לדיכוי גן או הפעלה על ידי הבאת שני אתרים מרוחקים קרובים אחד לשני. זה גם משחק תפקיד חשוב באריזת ה-DNA בתוך גרעין התא או הקופסית נגיפית. עיוות כיפוף של dsDNA ניתן דמיינו באופן ניסיוני על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה (AFM ² וTEM ^3), וthermodynamics וקינטיקה ניתן ללמוד על ידי מבחני לולאות, אשר כימי קישור אתרים זה לצד זה של dsDNA.

assay אחד כזה הוא cyclization האנזים תלוי ^4. ב assay זה, מולקולות dsDNA עם קצוות "דביקים" (מגובש) הן circularized או dimerized ידי האנזים ה-DNA. על ידי השוואת המחירים של המעגל והיווצרות דימר, ניתן לקבל ריכוז טוחנת יעיל של קצה אחד של ה-DNA בקרבת הקצה השני, אשר ידוע כגורם J. גורם J זה ממדי שווה לצפיפות הסתברות למציאת קצה אחד של ה-DNA במרחק קצר מהקצה השני, ובכך משקף את הגמישות של ה-DNA. מדידת גורם J כפונקציה של אורך ה-DNA מגלה מאפיינים רבים על מכניקת DNA כולל ^4,5 אורך ההתמדה.

השרשרת דמוית תולעת המודל (WLC) כבר נחשב למודל הפולימר הקנונית למכניקת dsDNA מבוססת על הצלחתה בexplaining עקומות כוח ההארכה שהושגו ב-DNA מושך ניסויי ^6, ובצורה נכונה לניבוי גורמי J של dsDNAs זמן רב יותר מאשר 200 נ"ב ^7. עם זאת, באמצעות assay cyclization על מולקולות dsDNA קצרות ככל 100 נ"ב, קלוטייה וWidom מדדו את גורמי J להיות בכמה סדרי גודל גבוהים יותר מהתחזית של מודל WLC ^8. שנה לאחר מכן, דו et al. מיוצר גורמי J בהסכם עם מודל WLC באמצעות assay cyclization עם ריכוזים נמוכים יותר של האנזים וייחס את התוצאה החריגה מקבוצת Widom לריכוזי האנזים גבוהים בשימוש ^9. מחלוקת זו מדגימה את ההשפעה הבלתי נמנעת של האנזים ה-DNA על קינטיקה cyclization בעת שימוש assay הקונבנציונלי ^9. יתר על כן, האנזים DNA יכול להשפיע גם על מבנה ה-DNA ונוקשות דרך ^10,11 מחייב ספציפי.

כדי למנוע חששות הטכניים של מבחני לולאות חלבון תלוי, לאחרונה הפגינו protassay לולאות עין בחינם מבוסס על פלואורסצנטי התהודה העברת אנרגיה (סריג) ^12. בשיטה זו, תצורות כרך מזוהות על ידי סריג בין תורם acceptor המצורף ליד הקצוות הדביקים של מולקולת ה-DNA. מיקרוסקופ אובייקטיבי מסוג הקרינה השתקפות הכל הפנימית (TIRFM) משמש להקלטת מסלולים של לולאות הפיכים ואירועי unlooping ממולקולות דנ"א חד משותק פני השטח לתקופה ממושכת של זמן. שיטה זו כוללת הרכבה של מולקולות ה-DNA המבוססת על ה-PCR לייצור מולקולות ה-DNA ללא חוסר התאמה, שהוא שיפור מכריע על שיטה דומה על ידי Vafabakhsh ^ו13 הא. היבט המולקולה בודדת של פרוטוקול זה מאפשר מדידה של הפצות בנוסף לאנסמבל ממוצע ואילו היבט סריג מאפשר למדוד דינמיקת לולאות DNA שוב ושוב מאותה המולקולה, גם במצבים שעלולים לפגוע בפעילות האנזים.

התקנת TIRFM מוצגת באיור 1. מותאמת אישיתשלב דגימה מעוצבת ממוקם מעל גוף מיקרוסקופ אולימפוס IX61. 532 ננומטר ו640 לייזרי ננומטר הם הציגו מהצד ובאים לידי הביטוי במראות סגלגלות זעירות ¹⁴ למטרת NA הגבוהה כדי להשיג זווית קריטית של שכיחות בממשק coverslip המים. נציין כי נפוץ יותר TIR דרך אובייקטיבי באמצעות מראות dichroic או setups TIR מבוסס פריזמה יכול לשמש גם עבור יישום סריג הזה. תמונת הקרינה שהוקמה על ידי מיקרוסקופ מחולקת לתמונות תורם acceptor ידי מראה dichroic. הם לאחר מכן מחדש הדמיה על שני חצאים של EMCCD. מסנני פליטה ארוך לעבור נוספים נמצאים בשימוש כדי להפחית את אות רקע.

בקרת טמפרטורה היא חיונית לרכישת נתונים הקינטית לשחזור. לבקרת טמפרטורה, המטרה היא להפריד את מזנקים של גוף מיקרוסקופ כדי למזער העברת חום, ומים מנשלט ילר / תנור בטמפרטורה מופצת דרך צווארון פליז שחוזקה התקפיםסביב מתכת הפנים מתחת למעייל האובייקטיבי. התקנה זו היא מסוגלת להשיג שליטה בטמפרטורה יציבה על פני השטח coverslip בין 15 50 ° C (איור 2). בעבודה זו, מדגם הטמפרטורה נשמרה ב24 ° C.

הפרוטוקול שלהלן מציג את הליך צעד אחר צעד לבניית ה-DNA, הערכה של צורת ה-DNA, ניסוי מולקולה בודדת, ונחישות גורם J.

1. לדוגמא הכנה dsDNA

1. עיצוב DNAs מעוקל ברחבי העולם על ידי חזרה על רצף 10-Mer. לדוגמא, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 "הוא ה-DNA 186-bp מעוקלת כאשר X הוא בסיס נוסף אקראי ורצף איגוף רצף 10-mer החוזר הם רצפי מתאם.
   הערה:. בדוגמא זו שני 10 מרס עם העדפות הפוכות להיווצרות הנוקלאוזום מבוססות על מחקר תפוסת הנוקלאוזום בקנה מידה גדולה על ידי קפלן ואח' ¹⁵ נבחרו. מאז חוזר הסליל של dsDNA הוא קרוב ל10 נ"ב, כל סטיה נקי של ציר הסליל של 10-mer תצטבר לייצר צורה כמו קשת עגולה (איור 3 א). מאחר שתקופת הסליל היא קרובה יותר ל10.5 נ"ב, בסיס נוסף מוכנס אחרי כל שתי חזרות כדי לשמור על המבנה המעוגל כמישוריים ככל האפשר. ניתן להזמין ברצפים אלה קצרים יותר מאשר 200 נ"ב מcompanieים ששירות סינתזת גן ההצעה. זה נוח לאגף רצפים אלה עם רצפי מתאם משותפים לשלבים הבאים. הליך schematized באיור 3.
2. לבצע PCR עם 1 פריימר (GTGCCAGCAACAGATAGC) ופריימר 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). הערה: פריימר 2 מתויג עם Cy3 תורם סריג בסוף "5. מתכון PCR טיפוסי ופרוטוקול רכיבה על אופניים מוצגים בלוחות 1 ו -2.
3. לבצע PCR עם פריימר 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) ו -4 פריימר (CAACAACGAGCTCGAATG). הערה: פריימר 3 מתויג עם Cy5 acceptor סריג דרך עמוד השדרה וביוטין-מקשר בסוף "5. מתכון PCR ופרוטוקול רכיבה על אופניים הם כאמור לעיל.
4. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי ה-PCR.
5. מערבבים את המוצר שכותרתו Cy3 ומוצר שכותרתו Cy5 בחיץ להחלפת גדיל (100 mM NaCl, 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA) בריכוזים סופיים של 0.4 &181 #; M ו0.1 מיקרומטר, בהתאמה. הערה: Cy3-DNA העודף מגביר את הריכוז של דופלקס ביצוע שני Cy3 וCy5 כתוצאה מחילופי גדיל.
6. קווצות שערי על ידי דוגרים על 98.5 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, קירור בהדרגה עד 5 מעלות צלזיוס עם שיעור רמפה של 0.1 ° C / sec, ודוגר על 5   ° C למשך 2 שעות.

2. ג'ל אלקטרופורזה לזיהוי dsDNA עקמומיות

1. יוצקים את הג'ל polyacrylamide ^16,17 על ידי ערבוב acrylamide ופתרונות bis-acrylamide ב29.2:0.8 יחס, 5% (w / v) במאגר 1X טריס / Borate / EDTA (TBE) ב-pH 8.0. הערה: 10 מיליליטר של תמיסת ג'ל מכיל: 1.217 acrylamide מיליליטר 40%, 0.667 מיליליטר 2% bis-acrylamide, 1 מיליליטר TBE 10X, 100 persulfate אמוניום L (APS) 10%, 10 L TEMED, וכל השאר הוא DH ₂ O. התמצקות מלאה של הג'ל לוקחת בערך 30 דקות.
2. טען את ג'ל polyacrylamide עם דגימות DNA וסולם ה-DNA בחיץ טעינת 1X (5% גליצרול, 0.03% (w / v bl bromophenol)UE) ולהפעיל את הג'ל על 5-8 V / סנטימטר ב-C ° 4 דקות 45 או עד שצבען הקדמי מתקרב לסוף של הג'ל.
3. כתם ג'ל באמצעות חיץ 1X TBE המכיל 0.5 גר '/ מיליליטר ethidium ברומיד ל30 דקות. זהה את להקות ה-DNA תחת תאורת UV. שקלו את עמדות להקה עם סמן הגודל (100 סולם DNA נ"ב) כדי לחשב את הגדלים, לכאורה, של מולקולות ה-DNA. הערה: DNAs המעוקל בדרך כלל איטי יותר מאשר להעביר DNAs הישר.

3. זרימת הכנת תא

1. מקדחה 6-7 זוגות של חורים בשני קצוות מנוגדים של שקופיות זכוכית (3'' x 1'') באמצעות מקדחה ומקדחי יהלום. לאחר קידוח, לשפשף את השקופית במים זורמים כדי להסיר אבקת זכוכית גלויה. הערה: החורים משמשים כפתחי כניסת זלוף ושקעים. במהלך קידוח, קירור השקופית עם מים חשוב כדי למנוע פיצוח.
2. מניחים את השקופיות זקופות בצנצנת זכוכית ולמלא אותו במים. Sonicate במשך 15 דקות ולהעביר אותם לעוד דה צנצנת זכוכיתdicated לניקוי אצטון. מלא אותו עם אצטון sonicate במשך 15 דקות. יש לשטוף את השקופיות עם אתנול באמצעות בקבוק תרסיס ולאחר מכן עם מים. למקם אותם בצנצנת פוליפרופילן, למלא אותו עם 5 הידרוקסיד M אשלגן, sonicate במשך 15 דקות. לבסוף, sonicate השקופיות במים במשך 15 דקות. נקה את coverslips (מס '1, 24 x 40 מ"מ) משתמש באותו פרוטוקול. הערה: שקופיות וcoverslips ניקה יכולים להיות מאוחסנים ב DH ₂ O לשימוש לטווח ארוך.
3. מערבבים 1 מ"ג של ביוטין-PEG-silane (MW 3400) עם 80 מ"ג של MPEG-silane (MW 2000) ב340 L של 0.1 פתרון ביקרבונט M נתרן. מערבבים היטב וצנטריפוגות התערובת בקצרה להיפטר מבועות. הערה: functionalization של פני השטח עם פוליאתילן גליקול (PEG) מסייע להפחית ספציפי מחייב של הדנ"א אל פני השטח.
4. שים 80 L של פתרון PEG בכל שקופית ועדינות להוריד את coverslip על זה. חכה 45 דקות. הפרד את coverslip מהשקופית עם פינצטה, לשטוף אותם עם כמות העצומה של DH ₂ O ולתת tיבש מכפלת באוויר פתוח.
5. מניחים רצועות דקות של קלטת דו מקל על פני השקופית כדי ליצור ערוצים. יישר coverslip על זה ולחץ בחוזקה נגד coverslip לשקופית כדי ליצור ערוצים נוזל הדוקה. השתמש אפוקסי 5 דקות כדי לאטום את הקצוות של הערוצים.

4. הכנת Trolox הפתרון

1. שים ~ 30 מ"ג Trolox ו10 מיליליטר DH ₂ O בבקבוק ולהשתמש בבר ומערבב מגנט לעורר את הפתרון באוויר פתוח במשך 18 שעה.
2. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ולהתאים את ה-pH ל 7 על ידי הוספה ~ 6 μl של 1 בסיס M טריס (pH 11). הערה: Trolox הוא מגיב אנטי מהבהב המשמש בדרך כלל במולקולה בודדת לומד ^18. פעולת antifading של Trolox מגיעה מנגזרת חמצון שלה, אשר נמצא בפתרון Trolox המושפל באופן חלקי ^19. מהירות המסת Trolox במתנול או פתרון ה-pH טריס גבוה יש להימנע בגלל חמצון יעיל.

5. Single-molהדמיה ecule

1. הזרק 15 μl של פתרון NeutrAvidin (0.5 מ"ג / מיליליטר) לתוך הערוץ ולחכות 2 דקות לפני השטיפה עם של חיץ T50 100 μl (10 מ"מ טריס-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0).
2. הזרק 50 μl של דגימת DNA (50-100 PM) לתוך התעלה. מתן 5 דקות ולשטוף את ה-DNA מאוגד משם עם של חיץ T50 100 L. הערה: מולקולות דנ"א ספציפיות תהיה לאגד את פני השטח באמצעות האינטראקציה NeutrAvidin-ביוטין.
3. מלא ערוץ עם חיץ ההדמיה המכיל מערכת הדחה חמצן ²⁰ (100 מ"מ PCD, 5 מ"מ PCA, 1 מ"מ Trolox, ו500 מ"מ NaCl).
4. הגדר את EMCCD במצב מסגרת העברה להזרים 2 x 2 תמונות זרקת לפח (256 x 256) למחשב ב25 מסגרות לשנייה.
5. שים שמן טבילה במטרת מיקרוסקופ, ולתקן את תא הזרימה על הבמה מיקרוסקופ באמצעות קליפים דגימה. גס להתאים את הפוקוס ע"י הסתכלות בדפוס השתקפות לייזר על הקיר. עדין להתאים את הפוקוס באמצעות התצוגה החיה של im הקרינהגילים על המסך.
6. בגין רכישת נתונים עם לייזר 532 ננומטר ב. בדוק את התצוגה החיה ולהתאים את הפוקוס במידת צורך. תפסיק רכישת נתונים כאשר רוב המולקולות photobleached.
   הערה: במתקן זה, משמשת תכנית C-נכתב מעבדה כדי לשלוט במיקרוסקופ ולהציג תמונות חיות על המסך כפי שהם נשמרים לדיסק הקשיח.

6. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

הערה: סדרת זמן של 256 x 256 תמונות מעובדות על ידי קוד MATLAB ליצור עקבות זמן מולקולה בודדת של עוצמות Cy3 וCy5. כדי לשייך פיקסלים בין ערוץ התורם וערוץ acceptor של התמונה מפוצלת נוף, 6-7 זוגות של כתמי Cy3 וCy5, כל זוג מאותו המולקולה המפוזרת באופן שווה על פני שדה הראייה, הם הרימו ידני, ושינוי affine מחושב באמצעות הקואורדינטות של נקודות אלה כנקודות עיגון.

1. באמצעות תסריט MATLAB, להסתכל דרך כל זמן המולקולה בודדת עקבות tמעברים מרובים מופע כובע בין אותות סריג נמוכים וגבוהים. זהה את מדינות כרך וunlooped.
   הערה: אות סריג מוגדרת כעוצמת Cy5 (אני), מחולק בסכום של עוצמות Cy3 וCy5 (אני + אני _D). יש מדינה בלולאה ערך סריג גבוה תוך מדינת unlooped יש ערך סריג נמוך. היסטוגרמה של אותות סריג ממולקולה בודדת מופצת bimodally בגלל לולאות וunlooping הפיכים.
2. מצא את הסף המפריד בין שתי הפצות על ידי קביעת הצומת שבין שתי עקומות גאוס מצוידים.
3. לחשב את יעילות סריג כמו ולהקצות את המדינות בלולאה עם ערכים גבוה סריג ומדינות unlooped עם ערכי סריג נמוכים.
4. באמצעות תסריט MATLAB, לנתח את המספר המצטבר של מולקולות (N (t)) שכרך (אוהגיע למצב סריג הגבוה) בפערי זמן שונים מאז תחילת רכישת נתונים. הערה: מאחר שמולקולת dsDNA יכולה להתחיל בכל קונפורמציה של מדינת unlooped בתחילת רכישת נתונים, שיעור הגידול באוכלוסיית הכרך משקף את שיעור הלולאה הממוצע בממוצע לכל תצורות ראשוניות. לחלץ את k שיעור _לולאת לולאה על ידי התאמת N (t) עם פונקציה מעריכית: אם עליות biphasically, זה יכול להיות מצויד עם פונקציה כפולה מעריכי: במקרה זה, k _לולאה מתקבלת: הערה: באופן תיאורטי, את הסתברות ההישרדות שפולימר לא בלולאה בזמן t היא לא פונקציה מעריכית יחידה או כפולה ^12. Fitt מעריכיing משמש כאמצעים מעשיים כדי לחלץ את זמן לולאות הממוצע.

7. קביעת פקטור J

הערה: גורם J מייצג איך מרוכז קצה אחד של dsDNA הוא מעבר לקצה השני. זה יכול להיקבע על ידי ביון הריכוז של קטע קצה אחד של ה-DNA שמייצר את אותו קצב התגובה עם מגזר הקצה השני כשיעור לולאות שנמדד. בניסוי, קטע קצה אחד הוא משותק על פני השטח, ומגזר הקצה השני הוא הציג בריכוז ג מסוים. אם שיעור חישול נמדד בין שני הקצוות הוא _לחשל k, אז גורם J ²¹ ניתן על ידי . השיעור הקבוע חישול _(לחשל k = _לחשל k / C) אינו תלוי בריכוז הבדיקה.

1. לזרום 20 μl של אוליגו ביוטין-Cy5 30-50 PM (פריימר 3) in כדי ערוץ מצופה NeutrAvidin. יש לשטוף את הערוץ עם 100 T50 μl לשטוף oligos מאוגד.
2. הכן את חיץ ההדמיה כפי שמתואר בחלק 5 עם התוספת של אוליגו Cy3 (פריימר 2) בריכוז סופי של 50 ננומטר. לזרום חיץ הדמיה זו לתוך התעלה.
3. תוך שמירה על לייזר 532 ננומטר ב, פונה בקצרה לייזר 640 ננומטר למקומות של oligos Cy5 מאוגד משטח לזהות. כבה את לייזר 640 ננומטר ולהתחיל ניטור אות סריג.
   הערה: עם הכלאה של אוליגו Cy3 לאוליגו Cy5 מאוגד פני השטח, הקרינה Cy5 תנבע מסריג.
4. באמצעות תסריט MATLAB, לנתח את מספר המולקולות שתתחלנה במדינה מאוגדת (עוצמת Cy5 נמוכה), אך מאוחר יותר יהפכו למדינה (בעצימות גבוהה Cy5) annealed כפונקציה של זמן מעקבות עוצמת Cy5.
5. מגרש מספר זה של מולקולות לעומת זמן annealed. להתאים עקומה זו עם פונקציה מעריכית יחידה ( _(לחשל k).
6. חזור על הניסוי הזה בריכוזים שונים Cy3 אוליגו (60, 100, ו180 ננומטר) כדי לאשר את הליניאריות בין שיעור חישול והריכוז מגיב. חלץ את שיעור קבוע חישול מסדר השנייה _(לחשל k ) מהמדרון.
7. חשב את גורם J מ , כאשר k _לולאה היא שיעור הלולאות שנמדד באותו מצב החיץ.

מולקולות ה-DNA משמשות למחקר הלולאה מורכבת של אזור דופלקס של רצף משתנה ובאורך וסככות חד גדילים שהם משלימים אחד את השני. הסככות, שהן ארוכות 7 בסיס, יכולות לחשל זה לזה כדי ללכוד את מצב הכרך. כל הסככה מכילה גם Cy3 או Cy5 כי הוא מקושר בעמוד שדרת ה-DNA באמצעות הכימיה amidite. Cy5-הסככה קשורה גם עם ביוטין-TEG (spacer גליקול טטרה-אתילן 15 אטום) לקיבוע משטח (ראה איור 4 א). ניתן לשלב את כל השינויים האלה לתוך dsDNA הבאים מבוססת פרוטוקול ה-PCR (פרוטוקול 1 ואיור 3 ב). האורך והרצף הנבחרים של הסככות לעבוד היטב כדי לייצר אירועי סריג לזיהוי והפיכים בתנאי ניסוי רגילים. לולאות וקינטיקה unlooping של לולאת ה-DNA רגישים לטמפרטורת הסביבה, ולכן, בקר טמפרטורה הוא חיוני לשחזור. כגון controller ניתן לשלב בקלות לתוך מיקרוסקופ (איור 2).

באמצעות TIRFM, אנטי קורלציה תנודות של Cy3 (תורם) וCy5 אותות (acceptor) ממולקולות dsDNA-משותק משטח נצפו (איור 4). במדינת הכרך, המרחק בין שני צבעים הוא קטן יותר מאשר 5nm, אשר יביאו באות Cy5 גבוהה ואות Cy3 נמוכה בשל יעילות גבוהה סריג (איורים 4 א ו4C). ניסויים שליטים כמה בוצעו כדי להוכיח שמדינת סריג הגבוהה מייצגת את מדינת הכרך. כל החיים של מדינת סריג הגבוהה גדלו עם אורך הסככה גובר, אשר טוען כי המדינה הגבוהה סריג הוא התייצב על ידי בסיס התאמה בין שתי המערות. כל החיים של מדינת סריג הגבוהה גם ירד עם ירידה באורך ה-DNA, שצפוי כי עליות אנרגיית הלולאה בחינם כלולאה הופכת להיות קטנות יותר 12. בהתבסס על עדות זו, STA סריג הגבוה והנמוךtes ניתן להקצות למדינות כרך וunlooped, בהתאמה.

כדי לבדוק את ההשפעה של עקמומיות הפנימית של dsDNA בלולאות, שתי dsDNAs 186 נ"ב עם עקמומיות שונה נבנו, אשר בשם (S-DNA) "ישר" ו( C-DNA) המעוקל, המבוסס על העקמומיות שלהם. רצף 10-mer החוזר הוא TTTATCATCC עבור ה-C-DNA וTGACAGCAAC לS-DNA. העקמומיות הכוללת של כל אחד מdsDNAs אלה נבדקה על ידי עמוד (אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל), שהיא השיטה הנפוצה ביותר להערכת עקמומיות dsDNA 16,22. איור 5 מראה כי S-DNA פועל באופן דומה ל-DNA של אותו גודל בסולם ה-DNA (השווה מסלול 1 ומסלול 2 באיור 5). מצד השני, ה-C-DNA תערוכות גודל נראים גדול יותר בהשוואה למקבילו בסולם ה-DNA (~ 1.2 גדולים יותר מהגודל האמיתי שלה, ראו מסלול 1 ומסלול 3). תצפית זו מצביעה על כך שC-DNA בעל מ"ק פנימי גדול יותרrvature מ S-DNA.

איור 6 מראה עקבות זמן הקרינה נציג מC-DNA (איור 6 א) ועקבות סריג המקבילות (איור 6). בהשוואה ל-S-DNA (4B דמויות ו4C), ה-C-DNA מייצר יותר אירועים גבוה סריג באותה תקופה של זמן; ה-C-DNA לולאות 4 פעמים בתדירות גבוהה יותר מאשר ה-S-DNA במהלך אותו זמן הרכישה (איור 7). תוצאה זו מוכיחה כי עקמומיות פנימית של ה-DNA יכולה להשפיע באופן משמעותי looping דינמיקה.

כדי לחלץ את גורם J משיעור הלולאה, צריך למדוד את שיעור קבוע מסדר שני הריכוז עצמאי להכלאה בין שתי סככות מנותקות. מימוש המדידה זו שמוצגת באיור 8 א. הכלאה של אוליגו Cy3 לאוליגו Cy5 המשותק מייצרת פרצי עצמת Cy5 בשל להתרגז. ממאה מרובותsurements עם ריכוזי Cy3-אוליגו שונים (ראה איור 8 ב), ניתן לחלץ באופן סטטיסטי חזק. בניסוי שלנו, שיעור הקבוע חישול בין שני oligos ב500 מ"מ NaCl היה נחוש להיות 0.45 ± 0.04 x 10 6 M -1 שניות -1. גורם J היה מחושב על ידי חלוקת שיעור הלולאה (k לולאה) על ידי שיעור קבוע חישול מסדר השנייה (לחשל יא '). זה היה 61 ± 3 ננומטר עבור S-DNA ו265 ± 48 ננומטר עבור ה-C-DNA. גורם J של ה-S-DNA (איור 9) הוא בהסכם הוגן עם מדידות קודמות באורך דומה 7.

איור 1. Objective-סוג TIRFM.) עירור אופטי. 532 לייזרי ננומטר ו640 ננומטר collimated בנפרד לsimilקוטר ar, מוזג לתוך באותה הדרך על ידי מראה dichroic, והתמקד על מראה סגלגל זעיר ממוקם מתחת הצמצם חזרה האובייקטיבי. חשוב להשתמש בעדשה אכרומטית למיקוד כדי למזער אופטיקה מיקרוסקופ סטייה כרומטית. ב '). העמדה לרוחב של המראה הזעיר צריכה להיות מותאמת היטב על כך שהוא יכול לשקף את קרן הלייזר באמצעות האובייקטיבי תוך חסימת פליטת הקרינה מינימאלית. לכן, זה חייב להיות מותקן על תרגום במה קטנה. מראה נוספת בצד השני משקפת את הלייזר היוצא כדי למנוע ממנה להיכנס לאופטיקה זיהוי. במטוס התמונה מחוץ לגוף מיקרוסקופ, חריץ להתאמה ממוקם כדי לחתוך את התמונה למחצית מגודלו של אזור זיהוי של ה-CCD. פליטת הקרינה מחולקת על ידי מראה dichroic לשני ערוצים, ועדשות הממסר יוצרות תמונה השנייה על CCD עם 01:01 ההגדלה. אחת מהמראות המשקפות מסובב מעט כדי לקזז את התורםותמונות acceptor. Bandpass ומסנני longpass משמשים כדי להפחית את הרקע בערוצי תורם acceptor, בהתאמה. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. בקרת טמפרטורה לניסויי מולקולה בודדת. טמפרטורת הסט (T ים) היא הקריאה על Chiller מים / התנור. הטמפרטורה בפועל (T) נמדדה על ידי צמד תרמי פנייה המשטח העליון של coverslip על המיקרוסקופ. העלילה של הטמפרטורות בפועל לעומת שש טמפרטורות שונות סט (ריבועים שחורים) מראה ליניאריות מצוינת (קו מקווקו ירוק). חוסנו של הבקר שמוצג על ידי מדידות אקראיות שנעשו בתקופות מאוחרות יותר (יהלומים אדומים). הבלעה היא התמונה של שיתוף הטמפרטורהntrolling יחידה ואובייקטיבי בהרכבה הסופית שלהם. הקו האדום מייצג את שיפוע של אחדות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. DNA עיצוב.) מעוקל dsDNA. DsDNA 10-mer מיוצג כמגזר מעוקל צינור, ושני גדילי יחיד כקווים מקווקווים. ציר הסליל של כל ה-DNA 10-mer הוא לא ישר לגמרי, ולכן כל שרשור של 10-mer כזה יוביל להטיה הדרגתית של ציר הסליל באותו הכיוון. השפעה זו יכולה להיות מנוצלת ליצירה מישוריים, מולקולת superhelical. ב ') הכנת dsDNA מבוססת ה-PCR. DNAs חד גדילים מוצגים כקו אופקי. העקמומיות שלהם בפועל אינה מתוארת כאן. הקטע המרכזי בשחור מייצג את חלק ייחודי של שבר דנ"א. שמוצגים בצבע אפור בהיר הם רצפי המתאם משותפים לכל DNAs שימש במחקר זה. לחשל פריימר 1 ו -4 למתאמים הקדמיים והאחוריים, בהתאמה. פריימר 2 מתויג עם Cy3 בסוף 5'-. פריימר 3 יש תג ביוטין בסוף 5'-וCy5 מקושר באופן פנימי. האזורים הכחולים הבהירים של פריימר 2 ו -3 מכילים רצפי משלימים המתפקדים כקצוות דביקים. כך או פלסמיד או הדנ"א הגנומי המכיל את הרצף של העניין משמש כתבנית בשתי PCR תגובות נפרדות. dsDNA שכותרתו Cy3 מופק באמצעות פריימר 1 ו -2, וה-DNA שכותרתו Cy5 biotinylated מופקת באמצעות פריימר 3 ו -4. שני מוצרי ה-PCR אלה הם מחוממים ומקוררים יחד להחלפת גדיל. ארבע dsDNAs שונה נוצרים, רק אחד מהם מכיל Cy3, Cy5, וביוטין. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

תמיד ">
איור 4. תכנית ניסויית.) ניסוי סריג מולקולה בודדת. מולקולות dsDNA שכותרתו עם Cy3 (ירוק) בצד אחד וCy5 (אדום) מצד השני הם משותקים על PEG (פוליאתילן גליקול) מצופה על פני שטח. לולאות וunlooping הפיכים של dsDNAs לגרום גבוה סריג (כרך) וסריג נמוך מדינות (unlooped), בהתאמה. ב ') עקבות זמן מולקולה בודדת טיפוסיות של תורם (ירוק) וacceptor (עוצמות אדומות) הקרינה. מדינות סריג גבוהות ונמוכות מזוהות כמדינות כרך וunlooped, בהתאמה. כמו כן ציין הוא זמן הלולאה הראשון המשמש לחישוב שיעור הלולאה. (הבלעה) זום באיור מציג את אנטי המתאם של עוצמות Cy3 וCy5. C) שמץ של סריג יעילות מחושבים מעוצמת תורם acceptor זמן עקבות בB. איור 4 ו <s טרונג> 4C נלקחו מהדנ"א ישר (S-DNA) כפי שמתואר בטקסט הראשי. סריג הנמוך ב0.2 בשל עירור ישיר של Cy5 ידי לייזר 532 ננומטר, ומאשר את נוכחותו של Cy5 הפעיל fluorescently. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5. ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (29.2:0.8 acrylamide / bis-acrylamide, 5% במאגר TBE, pH 8.0) של DNAs הסינתטי. משמאל לימין, הנתיבים מכילים סמן 1 קילו, ה-DNA ישר 186 נ"ב ונ"ב 186 ה-DNA מעוקל. נתון זה מותאם באופן חלקי מפרסום קודם 12 עם רשות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

_content "עבור: together.within-לשמור על עמודים =" תמיד ">
איור 6. עקבות נציג מDNA המעוגל (C-DNA) () ועקבותיה המקבילה סריג (ב '). השוואה של עוצמת וסריג עקבות בין S-DNA (4B דמויות ו4C) ו-C-DNA (6A דמויות ו6B) מראה בבירור כי ה-DNA המעוגל לולאות בתדירות גבוהה יותר מאשר ה-DNA ישר באותו מצב החיץ. (הבלעה) דמות זום ​​בתערוכות נגד המתאם של עוצמות Cy3 וCy5. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 7. פעמים לולאות הראשונות הממוצעת של ישר וDNAs המעוקל. כל tIME היה שחולץ מן ~ 500 מולקולות ב 5 תחומים שונים. הברים השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) מחושב מ3 ניסויים בלתי תלויים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 8. קביעת שיעור קבוע חישול מהכלאת אוליגו. א) בתצוגה סכמטית של מדידת קצב חישול. פריימר Cy5 הוא משותק על פני השטח, ופריימר Cy3 הוא נוכח ב50-180 ננומטר. מחייב ולא מחייב של פריימר Cy3 ב50 ננומטר להתרחש הפיך ולהוביל להתפרצויות acceptor לזיהוי, אשר מוצגות בהבלעה. B) שיעור חישול תלוי באופן ליניארי על הריכוז של אוליגו בחינם. השיפוע של הקו מייצג את השיעור קבוע חישול מסדר השנייה (annea יא ' יב). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 9 גורמי J של DNAs הישר והעקום מחושב בננומטר גורם J נקבע בהתבסס על שני measurables:... שיעור הלולאה של לולאת dsDNA ושיעור קבוע חישול של הסככות המשלימות בחינם לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר .

שמונה: 25px; רוחב: 351px; "> מים

רכיב	Volume/50 תגובת μl	ריכוז סופי
36 μl
חיץ Phusion 5x	10 μl	1x
10 מ"מ dNTPs	1 μl	200 מיקרומטר כל אחת
פריימר קדימה (מיקרומטר 25)	1 μl	0.5 מיקרומטר
פריימר ההפוך (מיקרומטר 25)	1 μl	0.5 מיקרומטר
DNA פולימרז חם תחילת Phusion (2 U / μl)	0.5 μl	0.02 U / μl
תבנית ה-DNA	0.5 μl	~ 1 ng

טבלת 1. תערובת תגובת PCR. הפרוטוקול מותאם לפולימראז Phusion ה-DNA. יש להוסיף פריטים בהזמנה זו.

"> 95 מעלות צלזיוס

צעד מחזור	טמפרטורה	זמן	מספר המחזורים
denaturation הראשוני	30 שניות	1
Denaturation	95 מעלות צלזיוס	5 שניות	30
רכוך	60 ° C	10 שניות
הארכה	72 ° C	15 שניות / kb
הארכה סופית	72 ° C	5 דקות	1
4 & #176; C	להחזיק

טבלה 2. הוראות רכיבה על אופניים ה-PCR. חישול בטמפרטורה נקבעה בהתבסס על טמפרטורות ההיתוך של פריימרים. זמן ההארכה מותאם לפולימראז Phusion ה-DNA.

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.