ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ Reesei Trichoderma בצמחים טבק

סיכום

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

תקציר

אנזימים משפילים תאית, cellulases, הם מטרות של שניהם אינטרסים תעשייתיים מחקר ו. העליונות של אנזימים אלה באורגניזמים קשים לתרבות, כגון פטריות העובש בנייה וחיידקים אנאירוביים, שהחישה את השימוש בטכנולוגיות רקומביננטי בתחום זה. שיטות ביטוי צמח הן מערכת רצויה לייצור בקנה מידה גדולה של אנזימים וחלבונים באופן תעשייתי שימושיים אחרים. בזאת, שיטות לביטוי החולף של endoglucanase פטרייתי, Trichoderma reesei Cel5A, בNicotiana tabacum הם הפגינו. ביטוי חלבון מוצלח מוצג, פיקוח על ידי הקרינה באמצעות חלבון היתוך mCherry-אנזים. בנוסף, סדרה של בדיקות בסיסיות המשמשות לבחון את הפעילות של ט 'הביע transiently reesei Cel5A, כולל-SDS, מערבי סופג, zymography, כמו גם הקרינה ומבחני השפלה מצע מבוסס צבען. המערכת המתוארת כאן יכולה לשמש לייצור תא פעילulase בתקופת זמן קצר, על מנת להעריך את הפוטנציאל לייצור נוסף במפעלים באמצעות מערכות ביטוי מכוננות או מושרה.

מבוא

השפלה של ביומסה lignocellulosic והמרתו לדלק נוזלי כבר חזתה כשיטת להפחתת תלות בדלקים מאובנים. המשוכה משמעותית אחד בהקמת מערכות לעיבוד ביומסה מבחינה כלכלית היא בשפלה האנזימטית של תאית hemicellulose ^1. מערכות ביטוי צמח מראות פוטנציאל גדול לייצור של אנזימים בקנה מידה תעשייתי. מערכות חקלאיות לצמחי יבול מבחינה כלכלית ובנפח כבר הוקמו, כפי שהם היו במשך אלפי שנים. הייצור של cellulases בצמחים רצוי בשל גורמים כמו קלות autohydrolysis ^2, ואת הפוטנציאל למקסם את השימוש ברמות אנזים נמוכים יותר על ידי הגדלת הנעכלות של קירות תא צמח ^1. לבסוף, מערכות מפעל מאפשרות את המיקוד של חלבונים רקומביננטי לאזורים הספציפיים של תאי צמח והם מסוגלים לשנות posttranslationally אנזימים שבו נדרשו ^3.

ve_content ">

tabacum Nicotiana (טבק) מאוד נפוץ כאורגניזם מודל ללימודי ביטוי חלבון Heterologous בצמחים, בשל תכונותיה צמיחה המהירה וביומסה הצטברות ^4. ביטוי חולף של חלבונים רקומביננטיים הוא טכניקה המאפשרת ייצור חלבון בתקופות זמן קצר ^5, תוך שמירה על גמישות כמו ללוקליזציה ולכן שינויי posttranslational של החלבונים שנבחרו, כלומר cellulases. זה מאפשר הייצור של cellulase (ים) לניתוח בסיסי, גם בעת הנחת התשתית לאסטרטגיות ביטוי נוספות בצמחים. משתמש באסטרטגית ביטוי חולפת כאלה, endoglucanase ממשפחת glycosyl hydrolase 5, Cel5A, הנגזרת מהמארח פטרייתי Trichoderma reesei (jecorina Hypocrea) ⁶ מופק (להלן כTrCel5A). TrCel5A הוא חלבון 42 kDa אשר glycosylated באופן מקורי, והוא פעיל מאוד בHYDroylzing רשתות תאית ^7.

טכניקת הביטוי חולפת המתוארת כאן מבוססת על מערכת יחסית נפוץ, שחדרו לעלי הצמח עם Agrobacteria נושא את הגן של עניין בוקטור ביטוי מתאים. כדי לאפשר ניתוח מהיר של הצלחה בביטוי Planta, TrCel5A יכול גם לבוא לידי ביטוי חלבון היתוך עם mCherry, חלבון פלואורסצנטי monomeric נגזר במקור sp Discosoma. חלבון DsRed ^8, עם שאריות נוספות שש היסטידין (שלו תג) התמזגו C-הסופית (TrCel5A-mCherry). ביטוי של חלבון Heterologous ההיתוך, TrCel5A-mCherry, ובכך תוכל להיות במעקב במסגרת גידול הצמחים על ידי שימוש באור ירוק לבחון פיזור mCherry. אם תרצה, סעיפים דקים של החומר הצמחי יכולים להיבחן תחת אור הירוק במיקרוסקופ כדי לקבוע את הלוקליזציה מסוימת של החלבון. לשם כך עבודה, אות וטראןפפטידים לשבת שולבו במבנה, בתרגום יצוא חלבון Heterologous לreticulum endoplasmic ^9.

כדי לנתח את הפעילות של cellulases הצמח בא לידי ביטוי, ביניהם TrCel5A, מספר בדיקות פעילות cellulase ניתן להפעיל. לאחר המיצוי של החלבונים הצמחיים המסיסים בסך הכל, TrCel5A יכול להיות מטוהר באופן חלקי באמצעות טכניקת דגירה תרמית. גודל חלבון הוקם באמצעות SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג. Zymography יכול לשמש גם כדי לנתח את הפעילות נגד מצעים, למשל תאית אשר כבר-מפוגל carboxy (מה שהופך את תאית carboxymethyl: CMC) למסיסות ^10. פעילות Cellulase וglucosidase ניתן לנטר באמצעות fluorophore 4-methylumbelliferyl (4-MU) הקשורים β-D-cellobioside (בשילוב: 4-MUC). שיטה נוספת להערכת פעילות endoglucanase כרוכה ניתוח spectrometric של CMC שנקשר עם אזו דאתם (Remazolbrilliant הכחול R) ^11. בנוסף, פעילות חלבון של שני endoglucanases ומגוון של cellulases יכולה להיות פיקוח על ידי שימוש במבחן ניתוח סוכר, כגון hydrazide p-הידרוקסי benzoic החומצה (PAHBAH) assay ^12. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להבהיר ולכמת את הפעילות של cellulase הביע עניין.

פרוטוקול

1. צמיחה של צמחי tabacum נ סוג בר

1. לגדול נ tabacum L. קורות חיים. צמחי Petit הוואנה SR1 על אדמה, במקום זרעי טבק על הסירים מתאימים מלאים באדמת שתילה רגילה לנביטה. לאחר 2 שבועות, להעביר את השתילים לעציצים בודדים. דגירה צמחים בחממה עם קבוע 22 ° C (תקופה אפלה) או 25 ° C (תקופת אור) ו70% לחות אוויר יחסי. מספק תאורה ב16/8 שעה מחזור אור / חושך (למשל 400 מנורות W פיליפס IP65; 180 μmol · שניות ^-1 · מ ^-2; λ = 400-700 ננומטר) ומים בכל יום.

2. ביטוי חולף של TrCel5A וTrCel5A-mCherry חלבונים

1. בתנאים סטריליים, לבחור מושבות אחת של tumefaciens Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) המכילות גם pTRAkc-ER-TrCel5A או pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry והעברה לבקבוק Erlenmeyer מכיל 10 מיליליטר תמצית שמריםבינוני מרק (ייב, שהוכן בהתאם למפרטי יצרנים) וkanamycin (50 מ"ג / מיליליטר), ריפאמפיצין (50 מ"ג / מיליליטר), וcarbenicillin (100 מ"ג / מיליליטר) לבחירה. דגירה של 36-40 שעות ב26 מעלות צלזיוס ו180 סל"ד. הערה: העיצוב של מבנים מתאימים לביטוי חלבון הוא מחוץ לתחום של מאמר זה, אבל להדרכה, השיטות של מקלין ואח' ¹³ ומונרו ^ו14 Pellham ניתן בעקבות לעיצוב מבנה..
2. קח 200 μl של כל תרבות לחסן 20 מיליליטר של ייב עם ריכוזי האנטיביוטיקה שהוזכרו לעיל ודגירה באותם תנאים כמו קודם.
3. לאחר 36-40 שעות, preinduce התרבויות על ידי הוספת acetosyringon 2 μl (200 מיקרומטר ריכוז סופי), 100 μl 40% (w / v) פתרון גלוקוז ו200 μl של 1 pH חיץ M MES 5.6. דגירה הלילה.
4. הכן של חיץ חדירה 2x (מלחים בסיסיים סוכרוז 100 g / L, גלוקוז 3.6 גר '/ ל', 8.6 g / L Murashige וSkoog 100 מיליליטר, כדי להתאים את pH 5.6 באמצעות אשלגן הידרוקסידי).
5. מדוד OD ₆₀₀ של התרבויות עם 1:05 דילולים עד שהוא מגיע OD ₆₀₀ של 5-6. חישוב התרבות נחוץ ל30 בינוניים חדירת מיליליטר ב OD ₆₀₀ נפח. הוסף 15 מיליליטר של חיץ חדירה 2x, ואז מוסיף H ₂ O deionized לעשות עד 30 מיליליטר החיץ.
6. קח את הצמחים מהחממה ולהשתמש בקצה פיפטה לכינוי צד abaxial של 3 ^rd לעלה 5 ^ה מהחלק העליון כדי להקל על חדירה.
7. השתמש בקצה פיפטה לכינוי צד abaxial של העלים כדי להקל על חדירה.
8. ממלאי מזרק עם מדיום חדירה והכניס אותו (בלי מחט) על אחד מהחתכים שנעשו בעבר. לתמוך במזרק עם אצבע בצד העלה adaxial. לחץ הבינוני בזהירות לתוך הרקמה של אזורים עלה interveinal. הערה: לאחר חדירה, לטפח צמחים בחממה באותם תנאים כפי שתואר לעיל. כמו כן, לשמור על פרופורציה שווה של untreated, צמחים שאינם חולפים ביטוי (NTEPs) כפקדים, תחת אותם התנאים כמו צמחים שחדר.

3. הערכת ביטוי TrCel5A-mCherry בצמח עלים

1. אחרי 4-6 ימים, לקחת צמחים הסתננו עם א ' tumefaciens מכיל pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry מהחממה ולמקם אותם בחדר חשוך לניתוח הקרינה.
2. כדי להמחיש את הקרינה בסעיפי עלה להביע TrCel5A-mCherry, צמחי אור באמצעות מקור אור נייד פולט אור ירוק ב515 ננומטר עם מסנן אדום (620-750 ננומטר). הערה: בעומק אפיון של ביטוי חלבון בעלי הצמח יכול להיות מושגת על ידי עלים חתך דקים עם vibratome ובדיקה תחת אור ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך בצע את הפעולות הבאות:
   1. לחתוך חלקים קטנים של כ 5 x 5 מ"מ גודל מעלה שחדר ולהטביע אותם ב4% מומסים agarose ב50 מ"מ חיץ פוספט (pH 5.7).
   2. גזורקטע של גודל מיקרומטר 80-90 מעלים מוטבעים באמצעות vibratome. למקם אותם בשקופית מיקרוסקופ, מכסה בחיץ או להחליק את מכסה ולבחון אותם באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של 10X עם גלאי הקרינה, באמצעות אותו הגל והמסנן האמור לעיל.

4. TrCel5A הפקה מעליי הטבק

1. חותכים חתיכות מטבק למשקל משוער של 1 גרם מצמחים נגועים בא tumefaciens מכיל pTRAkc-ER-TrCel5A ומקום במכתש precooled עם חנקן נוזלי. הוספת כמות מתאימה של חנקן נוזלי לדגימות. לטחון משאיר לאבקה באמצעות העלי precooled.
2. הוסף 2 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) המכיל פלואוריד phenylmethylsulfonyl 1 מ"מ לעניין עלה קרקע ולערבב עד שרוב עניין עלה הוא בהשעיה. תמצית צנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C ולקחת את supernatant המכיל חלבון.
3. CentriFUGE התמצית ב15,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ולקחת נזהר שלא לשבש את גלולה המכיל supernatant חלבון. זורק את הכדור.
4. חלקית לטהר TrCel5A ידי דוגרים supernatant המכיל חלבון ב55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מניח לנוח בטמפרטורת חדר למשך יותר 10 דקות, אז צנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 10 דקות ב RT. חזור על תהליך טיהור חלקי לצמחים שאינם הסתננו להשיג דגימות שליטה. השתמש בדגימות אלה לכל הניסויים הבאים. הערה: ניתן לאחסן פתרונות חלבון על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1 או ב -20 ° C עד 3 חודשים.
5. חזור על תהליך הטיהור החלקי לצמחים שאינם הסתננו להשיג דגימות שליטה. השתמש בדגימות אלה לכל הניסויים הבאים. הערה: ניתן לאחסן פתרונות חלבון על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1 או ב -20 ° C עד 3 חודשים.

5. SDS-PAGE, מערבי סופג, ואזו-CMC zymography של TrCel5A-mCherry

1. רכישה או להכין 12% (w / v) ג'לי-SDS לפי שיטות הוקמו ^15.
2. ממיסים CMC במים כדי להשיג 1.5% פתרון (w / v). כדי להפוך את ג'לי CMC-SDS-PAGE, להחליף 1 מיליליטר של .1.5% CMC ל1 מיליליטר של מים בתמיסת 10 מיליליטר תערובת ג'ל SDS-PAGE, וכתוצאה מכך 0.1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) לערבב ג'ל SDS-PAGE. יוצקים ג'ל כרגיל. הערה: ודא כי CMC בפתרון המקורי הוא נמס לגמרי על ידי שילוב של ערבוב וחימום ל40 ° C (לחזור ישירות לפני הכנת פתרון ג'ל).
3. לפגל דגימות על ידי רתחה בנוכחות SDS, כמו לכל שיטות שהוקמו ^12. כביקורת חיובית, השתמש בדילול 1:500 מתערובת cellulase זמינה מסחרי מט reesei, כגון T. reesei ATCC 26921. כביקורת שלילית להשתמש בפתרון חלבון שהוכן באופן דומה מעלים שאינם הסתנן (NTEPs).
4. לבצע אלקטרופורזה לפי פרוטוקולים רגילים ^15,למשל להשתמש 200 V ל~ דקות 50 עם אלקטרופורזה נבלמה פעם אחת מול לצבוע הגיע לתחתית הג'ל.
5. כתם ג'ל SDS-PAGE אחד באמצעות 0.1% (w / v) Coomassie כחול מבריק וdestain באמצעות מתנול / תערובת חומצה אצטית קרחונים. הערה: צביעה וdestaining מהירים יכולים להתבצע בעדינות על ידי חימום מכתים וdestaining פתרונות, כלומר באמצעות מיקרוגל ל~ 15 שניות כדי לחמם (אך לא להרתיח) ראשון מכתים ולאחר מכן פתרונות destaining, שינוי פתרון destaining לאחר 10 דקות , או כאשר התקרר, וחזור עם פתרון destaining חדש.
6. לבצע מערבי סופג של אחד ג'ל SDS-PAGE באמצעות פרוטוקולים הוקמו ^16,17. השתמש בנוגדנים הבאים: נוגדן ארנבת polyclonal נגד אזורו תג (ראשוני) ועז polyclonal נגד ארנב נוגדני Fc אשר כבר מצומדת לphosphatase אלקליין (משני). שימו לב: יש לבחור נוגדנים משני כדי לאפשר להדמיה באמצעות tetrazol nitroblueמלח p-toluidine chloride/5-bromo-4-chloro-3 ium '-indolyphosphate (NBT / BCIP), כפי שתואר ^18.
7. לבצע חלבון בג'ל refolding על 0.15% (w / v) ג'ל CMC-SDS על ידי דוגרים ג'ל ב1.5% (w / v) β-ציקלודקסטרין, חיץ 20 מ"מ פוספט-ציטראט, pH 6.5, בטמפרטורת חדר עם עדין רועד במשך 15 דקות ^19.
8. מחק את פתרון β-ציקלודקסטרין ובקצרה לשטוף את הג'ל עם H ₂ O. לדגור על RT בחיץ 50mm נתרן אצטט (pH 4.8) לדקות 15 נוספות. בצע zymography CMC באמצעות 0.15% ג'ל SDS-PAGE קפל CMC על ידי דוגרים ג'ל בpH חיץ נתרן אצטט 30 מ"מ 4.8 עבור 20 דקות ב50 ° C.
9. בצע zymography CMC באמצעות 0.15% קפלו (w / v) ג'ל CMC-SDS על ידי דוגרים ג'ל ב30 חיץ נתרן אצטט מ"מ (pH 4.8) עבור 20 דקות ב50 ° C.
10. כתם ג'ל ל10 דקות באמצעות 0.1% w / v פתרון קונגו אדום וdestain ל30 דקות או עד להקות ברורות הם נצפו באמצעות 1 M NaCl. שטוף את הג'ל עם 0.3% (v / v) חומצה אצטית להדמיה ברורה יותר.

6. 4-MUC פעילות Assay של TrCel5A

1. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ 4-MUC ב50% (v / v) מתנול, ולאחסן אותו בחושך ב RT
2. מייד לפני assay, להכין פתרון 4-MUC 2x עובד, מורכב מ1 מ"מ 4-MUC ו60 מ"מ נתרן אצטט, pH 4.8.
3. בצע בדיקה זו בדגימות המכילות חלבון עלה של 100 μl (עם או בלי TrCel5A הביע inducibly), 100 μl תערובת cellulase זמינה מסחרי מט 1:1,000 reesei, ו-H ₂ O הטהור, בהתאמה. הפעל כל דגימה בשלושה עותקים.
4. של הפתרון עובד 4-MUC לתוך בארות נפרדות מצלחת 96 היטב פיפטה 100 μl, ולאחר מכן להוסיף לכל דגימה 100 μl.
5. קבע 0 timepoint דקות של הקרינה 4-MU באמצעות ספקטרוסקופיית ניאון, באמצעות גל עירור של 360 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר.
6. דגירה צלחות ל20דקות על 50 מעלות צלזיוס, מכוסה במכסים דביקים כדי למנוע אידוי. לעצור את התגובה על ידי הקפאה (או על ידי שילוב של 100 μl 0.15 M גליצין, pH 10.0, ומדגם 100 μl בצלחת נפרדת).
7. לקבוע את נקודת הסיום של הקרינה 4-MU באמצעות ספקטרוסקופיית ניאון, באמצעות גל עירור של 360 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. להחסיר 0 דקות מtimepoint נקודת קצה (20 דקות) כדי להשיג את השינוי בערכי הקרינה.

7. אזו-carboxymethyl צלולוזה פעילות Assay של TrCel5A

1. הכן מלאי של .1.5% (w / v) אזו-CMC אשר מאוחסן ב RT, ופתרון משקעים המכילים אצטט 18 מ"מ האבץ, 0.5 נתרן אצטט M, pH 5 ו80% ​​אתנול (V / V), חנות בחדר טמפרטורה.
2. מייד לפני assay, להכין פתרון אזו-CMC 2x עובד, המורכב של 1% (w / v) אזו-CMC (H ₂ O) ו60 מ"מ נתרן אצטט, pH 4.8.
3. שלב 50 μl של מדגם ו50 μl של העבודהing פתרון ב1.5 צינורות מיליליטר.
4. בדיקת דגימות המכילות 50 μl חלבון עלה של (עם או בלי TrCel5A הביע transiently); מתערובת cellulase זמינה מסחרי מט 100 μl reesei דילול 1:1,000; וטהור H ₂ O. דגימות לרוץ וסטנדרטים בשלושה עותקים.
5. דגירה דגימות עבור 20 דקות ב50 ° C. עצור את התגובה על ידי הוספת 250 μl של פתרון משקעים. ורטקס כל מדגם נמרצות ל10 שניות כדי להבטיח פתרונות אוחדו לחלוטין.
6. דגירה דגימות ב RT עבור 10 דקות ולאחר מכן מערבולת שוב. צנטריפוגה דגימות 1,000 XG 10 דקות. הסר 200 μl של כל supernatant מדגם לצלחת 96 היטב, נזהר שלא להפריע לגלולה.
7. Assay באמצעות ספקטרוסקופיית הספיגה באורך גל של 590 ננומטר.

8. PAHBAH Assay של TrCel5A

1. השתמש חירור לחתוך עיגול (~ קוטר 5.5 מ"מ) של נייר סינון. הוספת 100 μl 60 מ"מ NaAc, pH 4.8, ו100 μl של דגימות, או המכילים חלבון עלה (עם או בלי TrCel5A הביע inducibly) או ט מסחרי תערובת cellulase reesei, בדילול 1:1,000, דגירה עם עיגולי נייר סינון ל20 שעות על 50 מעלות צלזיוס עם 300 סל"ד רועד. עבור כל דגימה הודגרו עם נייר סינון, גם דגירה פתרון כפול ללא נייר סינון כמדגם בקרות פרטניות.
2. הכן hydrazide החומצה benzoic (PAHBAH) פתרון p-הידרוקסי 330 מ"מ על ידי המסת PAHBAH בH ₂ O עם התוספת של 5 מיליליטר HCl מרוכז עבור סכום כולל של 100 פתרון מיליליטר, ולאחסן ב RT. הערה: התוצאות הטובות ביותר מושגות על ידי הוספת HCl לנפח קטן יותר של תרחיף PAHBAH, כלומר 30 מיליליטר, אשר עורר בטמפרטורה כדי לעזור פירוק לפני קבלת הנפח ל100 מיליליטר עם H ₂ O.
3. הכן את הפתרון B PAHBAH, המכיל נתרן ציטרט 50 מ"מ, סידן כלורי 10 מ"מ, ו500 מ"מ NaOH וחנות ב RT.
4. Immediately לפני assay, להכין פתרון 1.5x עבודה של מגיב PAHBAH מיליליטר 1 עד 9 מיליליטר פתרון חיץ, לאחסן על קרח עד לשימוש (לשימוש תוך 4 שעות).
5. הכן את הדגימות ב0.2 או 0.5 מיליליטר צינורות חומים. שלב 5 μl של כל פתרון הודגרו עם נייר סינון (שלב 8.1) 45 μl של H ₂ O ושל פתרון עובד PAHBAH 100 μl. פקדים לדוגמא (דוגמאות הודגרו ללא נייר סינון) יש להפעיל באותם ריכוזים (5 מדגם μl, 45 H ₂ O μl פתרון, 100 PAHBAH μl עובד). גם לבדוק 5 סטנדרטים (5 μl) המכילים בין 0 ל 0.2 גר '/ L של גלוקוז, ו-H הטהור ₂ O. דגימות לרוץ וסטנדרטים בשלושה עותקים.
6. דגירה דגימות בדיוק 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לצנן על RT במשך בדיוק 10 דקות. פתרונות פיפטה לתוך צלחת גם 96 וassay spectroscopically באורך גל של 410 ננומטר. לחסר מדגם פקדים בודדים (הודגרו ללא נייר סינון) מדגימות כדי להשיג סופיערכים.

תוצאות

TrCel5A וTrCel5A-mCherry באו לידי ביטוי בהצלחה בצמחי טבק באמצעות מערכת חולפת הביטוי (איורים 1 א ו 1 ב '). בחינה של דפוס הביטוי של חלבון היתוך TrCel5A-mCherry חשפה עלים בריאים (איור 1 ג), אשר הראה ביטוי חלבון נרחב תחת אור הירוק (1D איור).

מיצוי של החלבונים המסיסים בסך הכל בוצע בצמחי טבק שהיו עלים שהכילו הביע transiently חלבון TrCel5A ו- SDS הראה מ...

דיון

ביטוי רקומביננטי של cellulases הוא תחום עניין רב, בשל הרצון למערכות ייצור דלק ביולוגי יעילים יותר ^1. צמחים מציעים אפשרויות רבות לייצור cellulase מוצלח, עם תכונות כגון טכניקות קצירה כלכלית ושיטות autohydrolysis להיות תכונות רצויות מאוד לייצור דלק ביולוגי בקנה מידה גדולה. יתר על כן, השימוש בגרסות מגוירים שונות לייצור חלבונים לאפשר, שינויים במידת צורך, posttranslational ^20. שינוי צמחים כדי לאפשר ביטוי מכונן של cellulases, תוך שהיא מציעה יתרונות ברורים, היא שיטת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
חומצה אצטית	ROTH	3738
אצטוסירינגון (מרוכז)	ROTH	6003
אנטיביוטיקה - קנמיצין	ROTH	T832
אנטיביוטיקה - ריפמפיצין	ROTH	4163
אנטיביוטיקה - קרבניצילין	ROTH	6344
נוגדן - ארנב אנטי His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
נוגדן - עז אנטי ארנב AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
אזו-קרבוקסימתיל צלולוז	MEGAZYME	S-ACMC
β-ציקלודקסטרין	SIGMA-ALDRICH	C4805
סידן כלוריד דיהידרט	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxymethyl cellulose	ROTH	3333.1
צלולאז מTrichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
אדום קונגו	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie כחול מבריק G 250	ROTH	9598.2
D(+)-גלוקוז	ROTH	8337
אתנול	ROTH	K928
נייר סינון - נייר ספיגה Rotilabo ROTH		CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES buffer	ROTH	4256
מתנול	ROTH	8388
נתרן ציטראט	ROTH	3580
נתרן dodecylsulfate	SERVA	20765
נתרן הידרוקסיד	ROTH	6771
אדמה, Einheitserde קלאסי	ספקטרומטר PATZER GMBH
- אינפיניטי M200	TECAN
סוכרוז	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-הידרוקסי בנזהידרזיד	SIGMA-ALDRICH	H9882
תמיסת מלח חוצצת פוספט	ROTH	1058
מקור אור UV - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica