ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ Reesei Trichoderma בצמחים טבק

Summary

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

Abstract

אנזימים משפילים תאית, cellulases, הם מטרות של שניהם אינטרסים תעשייתיים מחקר ו. העליונות של אנזימים אלה באורגניזמים קשים לתרבות, כגון פטריות העובש בנייה וחיידקים אנאירוביים, שהחישה את השימוש בטכנולוגיות רקומביננטי בתחום זה. שיטות ביטוי צמח הן מערכת רצויה לייצור בקנה מידה גדולה של אנזימים וחלבונים באופן תעשייתי שימושיים אחרים. בזאת, שיטות לביטוי החולף של endoglucanase פטרייתי, Trichoderma reesei Cel5A, בNicotiana tabacum הם הפגינו. ביטוי חלבון מוצלח מוצג, פיקוח על ידי הקרינה באמצעות חלבון היתוך mCherry-אנזים. בנוסף, סדרה של בדיקות בסיסיות המשמשות לבחון את הפעילות של ט 'הביע transiently reesei Cel5A, כולל-SDS, מערבי סופג, zymography, כמו גם הקרינה ומבחני השפלה מצע מבוסס צבען. המערכת המתוארת כאן יכולה לשמש לייצור תא פעילulase בתקופת זמן קצר, על מנת להעריך את הפוטנציאל לייצור נוסף במפעלים באמצעות מערכות ביטוי מכוננות או מושרה.

Introduction

השפלה של ביומסה lignocellulosic והמרתו לדלק נוזלי כבר חזתה כשיטת להפחתת תלות בדלקים מאובנים. המשוכה משמעותית אחד בהקמת מערכות לעיבוד ביומסה מבחינה כלכלית היא בשפלה האנזימטית של תאית hemicellulose ^1. מערכות ביטוי צמח מראות פוטנציאל גדול לייצור של אנזימים בקנה מידה תעשייתי. מערכות חקלאיות לצמחי יבול מבחינה כלכלית ובנפח כבר הוקמו, כפי שהם היו במשך אלפי שנים. הייצור של cellulases בצמחים רצוי בשל גורמים כמו קלות autohydrolysis ^2, ואת הפוטנציאל למקסם את השימוש ברמות אנזים נמוכים יותר על ידי הגדלת הנעכלות של קירות תא צמח ^1. לבסוף, מערכות מפעל מאפשרות את המיקוד של חלבונים רקומביננטי לאזורים הספציפ....

Protocol

1. צמיחה של צמחי tabacum נ סוג בר

1. לגדול נ tabacum L. קורות חיים. צמחי Petit הוואנה SR1 על אדמה, במקום זרעי טבק על הסירים מתאימים מלאים באדמת שתילה רגילה לנביטה. לאחר 2 שבועות, להעביר את השתילים לעציצים בודדים. דגירה צמחים בחממה עם קבוע 22 ° C (תקופה אפלה) או 25 ° C (תקופת אור) ו70% לחות אוויר יחסי. מספק תאורה ב16/8 שעה מחזור אור / חושך (למשל 400 מנורות W פיליפס IP65; 180 μmol · שניות ^-1 · מ ^-2; λ = 400-700 ננומטר) ומים בכל יום.

Results

TrCel5A וTrCel5A-mCherry באו לידי ביטוי בהצלחה בצמחי טבק באמצעות מערכת חולפת הביטוי (איורים 1 א ו 1 ב '). בחינה של דפוס הביטוי של חלבון היתוך TrCel5A-mCherry חשפה עלים בריאים (איור 1 ג), אשר הראה ביטוי חלבון נרחב תחת אור הירוק (1D איור).

מיצוי של החלבונים המסיסים בסך הכל בוצע בצמחי טבק שהיו עלים שהכילו הביע transiently חלבון TrCel5A ו- SDS הראה מ.......

Discussion

ביטוי רקומביננטי של cellulases הוא תחום עניין רב, בשל הרצון למערכות ייצור דלק ביולוגי יעילים יותר ^1. צמחים מציעים אפשרויות רבות לייצור cellulase מוצלח, עם תכונות כגון טכניקות קצירה כלכלית ושיטות autohydrolysis להיות תכונות רצויות מאוד לייצור דלק ביולוגי בקנה מידה גדולה. יתר על כן, השימוש בגרסות מגוירים שונות לייצור חלבונים לאפשר, שינויים במידת צורך, posttranslational ^20. שינוי צמחים כדי לאפשר ביטוי מכונן של cellulases, תוך שהיא מציעה יתרונות ברורים, היא שיטת .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
חומצה אצטית	ROTH	3738
אצטוסירינגון (מרוכז)	ROTH	6003
אנטיביוטיקה - קנמיצין	ROTH	T832
אנטיביוטיקה - ריפמפיצין	ROTH	4163
אנטיביוטיקה - קרבניצילין	ROTH	6344
נוגדן - ארנב אנטי His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
נוגדן - עז אנטי ארנב AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
אזו-קרבוקסימתיל צלולוז	MEGAZYME	S-ACMC
β-ציקלודקסטרין	SIGMA-ALDRICH	C4805
סידן כלוריד דיהידרט	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxymethyl cellulose	ROTH	3333.1
צלולאז מTrichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
אדום קונגו	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie כחול מבריק G 250	ROTH	9598.2
D(+)-גלוקוז	ROTH	8337
אתנול	ROTH	K928
נייר סינון - נייר ספיגה Rotilabo ROTH		CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES buffer	ROTH	4256
מתנול	ROTH	8388
נתרן ציטראט	ROTH	3580
נתרן dodecylsulfate	SERVA	20765
נתרן הידרוקסיד	ROTH	6771
אדמה, Einheitserde קלאסי	ספקטרומטר PATZER GMBH
- אינפיניטי M200	TECAN
סוכרוז	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-הידרוקסי בנזהידרזיד	SIGMA-ALDRICH	H9882
תמיסת מלח חוצצת פוספט	ROTH	1058
מקור אור UV - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica