Method Article

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

DOI:

10.3791/51718

⸱

February 21st, 2015

 ,  ,  , 
1Cytogenetics Department, Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust, 2Cytogenetics Department, Viapath Analytics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערך CGH לצורך זיהוי של גרסאות עותק מספר הגנומי החליף ניתוח קריוטיפ התאגדו-G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה והיישום שלה במעבדת שירות לאבחון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערך CGH לזיהוי וריאנטים של מספר עותקים גנומיים החליף ניתוח קריוטיפ עם פס G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה ויישומה במעבדה של שירות אבחון קליני. DNA המופק מדגימת המטופל (דם, רוק או סוגי רקמות אחרים) מסומן בפלואורוכרום (ציאנין 5 או ציאנין 3). דגימת DNA ייחוס מסומנת עם הפלואורוכרום ההפוך. לאחר מכן יש שלב ניקוי להסרת נוקלאוטידים לא משולבים לפני שה-DNA המסומן מעורבב ומושעה מחדש במאגר הכלאה ומוחל על מערך הכולל ~60,000 בדיקות אוליגונוקלאוטידים מאתרים ברחבי הגנום, עם צפיפות בדיקה גבוהה באזורים חשובים מבחינה קלינית. לאחר הכלאה, המערכים נשטפים, ואז נסרקים והתמונות המתקבלות מנותחות כדי למדוד את הקרינה האדומה והירוקה עבור כל בדיקה. תוכנה משמשת להערכת האיכות של כל מדידת בדיקה, חישוב היחס בין הקרינה האדומה לירוקה וזיהוי וריאנטים פוטנציאליים של מספר עותקים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה כבר ידוע במשך שנים רבות כי מחיקות או עותקים נוספים של מגזרי כרומוזומליות לגרום לנכות אינטלקטואלית, dysmorphism ומומי congentical, ובמקרים מסוימים לגרום לתסמונות גנטיות 1. עם זאת, הטכנולוגיה זמינה רק עד אמצע שנתי ה -2000 לגילוי הגנום של שינויים אלה יכול הייתה G-התאגדה ניתוח כרומוזום, שבו יש רזולוציה של כ 5-10Mb, בהתאם לאזור והטבע של חוסר האיזון, ושלא לזהות כרומוזומים לא נורמלים שבו חומר הוחלף באזור מכרומוזום שונה עם אותו דפוס פסים. טכניקות ציטוגנטית נלוות כגון הקרינה הכלאה באתר והגברת בדיקה קשירה ספציפית זמנית היו זמינות לחקירה של לוקוסים ספציפיים, במקרים של חוסר איזון syndromic הספציפי חשוד, אבל זה לא היה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת 1. תוויות

  1. לפני השימוש dUTPs, מראש aliquot cyanine 3 ו -5 שכותרתו, נוקלאוטידים ללא תווית ופריימרים אקראיים בריכוזים מומלץ יצרן ל96-גם צלחות וחנות ב -20 מעלות מוכנות לשימוש. למטרות פרוטוקול זה, aliquot 10.5 μl של dUTP שהכותרת המתאימה ו10.5 μl נוקלאוטידים ללא תווית ופריימרים אקראיים היטב כל אחד.
  2. להפשיר את הצלחת מוכנה לשימוש 96-היטב של נוקלאוטידים ופריימרים על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעה, מוגן מפני אור.
  3. ברגע שהפשיר, לאזן צלחת זה ב RT לפחו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל בדיקה על מערך הכלאה היא דמיינה כתערובת של fluorochromes האדום והירוק (ראה איור 1). היחס של אדום לאות ניאון ירוק עבור כל בדיקה הוא לכמת על ידי הסורק והתוכנה נלווית חלקות אלה כיחסי log2 על פי העמדה הגנומי שלהם, ומזהה אזורים נופלים גבולות מוגדרים מראש מחוץ. עקבות מערך וכתוצאה מכך לאפשר פרשנות של אזורים שזוהו כgenomically לא מאוזן. לדוגמא, העקבות מילד עם תסמונת ויליאמס, תסמונת microdeletion חוזרת בתיווכו של חזרות נמוכות עותק באזור הפרוקסימלי של כרומוזום 7, מתוארת <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערך CGH לא יזהה שחלופים מאוזנים או הפרעות ploidy כגון triploidy. יתר על כן, חוסר איזון פסיפס רמה נמוכה עשוי שלא להיות מזוהה. עם זאת, יש מערך CGH רזולוציה גבוהה יותר לזיהוי CNV מאשר ניתוח כרומוזום התאגדו-G בו החליף במעבדות ציטוגנטיקה רבות. לכן תקן הזהב הנוכחי לגילוי CNV הגנום. זה יכול להיות מוחלף על ידי טכנולוגיות רצף של הדור הבא בעתיד, אבל כרגע, עלותם והמורכבות הטכנית הקשורות בשימוש קצר קוראים לגילוי CNV אומר שזה עדיין לא בכושר טוב לשימוש קליני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אישורים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CGH microarray 8 x 60KAgilentG4126
Array CGH wash buffersAgilent5188-5226
מערך CGH מאגר הכלאהAgilent5188-5380
ערכת טיהור מינלוטQiagen28006
ערכת תיוג CGHמערך EnzoENZ-42672-0000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
  2. Ahn, J. W., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Array CGHCopy Number VariantsDNA LabelingFluorescent DyesHybridization BufferOligonucleotide ProbesFluorescence ScanningLog Two RatiosGenomic Imbalance DetectionClinical Diagnostic Service

Related Articles