השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

סיכום

השתלת עור זנב היא מודל רב עוצמה לחקר דחייה תלויה בתאי T והשראת סבילות במהלך תגובות חיסוניות אלוגניות בעכברים. היתרונות של פרוטוקול זה הם ניתוח פולשני קל, וקלות ניטור ללא צורך להקריב את העכבר המקבל.

תקציר

חקר תגובות תאי T והשלכותיהן במהלך זיהוי אלו-אנטיגן דורש מודל המאפשר להבחין בין תאי T תורמים לתאי T מארחים, לנטר בקלות את השתל ולהתאים את המערכת כדי לענות על שאלות אימונולוגיות שונות. מדאוור ועמיתיו הקימו השתלת עור זנב-זנב אלוגנית בעכברים ב-1955. מאז, מודל השתלת העור שונה והותאם ללא הרף כדי לענות על שאלות ספציפיות. השימוש בעור זנב הופך את המודל הזה לקל לציון לדחיית השתל, אינו דורש הכנה נרחבת או הרדמה עמוקה, ישים לבעלי חיים מכל הרקע הגנטי, מונע נמק איסכמי ומאפשר התערבות כימית וביולוגית.

באופן כללי, גם תאי T אלוגניים CD4⁺ וגם CD8⁺ אחראים לדחיית השתלות מכיוון שהם מזהים אנטיגנים של תאימות היסטולוגית עיקרית לא תואמים מזני עכברים שונים. תוארו מספר מודלים להפעלת תאי T אלוגניים בעכברים מושתלי עור. הזיהוי של מולקולות קומפלקס תאימות היסטולוגית (MHC) מסוג I ו-II בזני עכברים שונים כולל עכברי C57BL/6 היה צעד חשוב לקראת הבנה ולימוד תגובות בתיווך תאי T. במודל השתלת עור הזנב המתואר כאן, מוטציה תלת-נקודתית (I-A^bm12) בחריץ מציג האנטיגן של מולקולת MHC-class II (I-A^b) מספיקה כדי לגרום להפעלה אלוגנית חזקה של תאי CD4⁺ T בעכברי C57BL/6. השתלות עור מעכברי I-A^bm12 בעכברי C57BL/6 נדחות תוך 12-15 יום, בעוד שתלים סינגניים מתקבלים עד 100 ימים. היעדר תאי T (עכברי CD3^{-/- ו-Rag2-/-}) מאפשר קבלת שתלי עור עד 100 ימים, שניתן להתגבר עליהם על ידי העברת 2 x 10⁴ תאי T מסוג פרא או טרנסגני. תאי T שהועברו באימוץ מתרבים ומייצרים IFN-γ בעכברי Rag2^-/- מושתלים ב-I-A^bm12.

מבוא

השתלה של איברים מוצקים כגון עור, לב וכליות היא כעת הליך סטנדרטי בפרקטיקה רפואית ברחבי העולם ^1. ניתן לדחות איברים מושתלים בהצלחה על ידי הפעלה של מערכת חיסון הנמען, אשר מזהה את האנטיגנים histocompatibility העיקריים של התורם. חולים מושתלים ולכן זקוקים לטיפול בתרופות לדיכוי המערכת החיסונית ^2. השתלה אלוגנאית עור בעכברים הוקמה על ידי מךוואר ועמיתיו בשנת 1955 והייתה מועיל לזיהוי המולקולות הממוקדות תיארו מאוחר יותר כמורכב histocompatibility מרכזי (MHC) אני בכיתה ו-II. מאז, מודל השתלת עור כבר שונה באופן רציף ומותאם לללמוד את התפקיד של תת תא T ואת הרלוונטיות של חומר כימי וביולוגית התערבות בדיכוי דחיית שתל ^2-4. עור מהאוזן ותא המטען קשה יותר להכין ורגישים יותר לחוסר חמצן ונימק מאשר זנב ^עור-5; עם זאת,הליך ההשתלה הוא דומה. בנוסף הניטור של השתלות עור הזנב הוא קל בשל מרקם השיער האופייני לעור.

מאמר זה מספק נוהל מפורט לכיתת MHC II השתלת עור זנב חוסר התאמה המאפשרת לחקר היבטים שונים של דחייה מסוג CD4 ⁺ T תא בתיווך של שתל וסובלנות בעכברים. המוטציה הטבעית שלוש הנקודות בMHC הכיתה השנייה ^ב IA מולקולה (הנקראת IA ^{bm12) 6-9} די בכך כדי לגרום לדחייה של allografts עור בעכברי C57BL / 6 ^8. מולקולת ^bm12 IA מפעילה CD4 ⁺ T תאים עם קולטן תא αβ-T שונים (TCR) שרשרות מעכברי C57BL / 6, ביניהם תאי T Vα2Vβ8-TCR ספציפיים זוהו על מנת ליצור עכבר TCR-מהונדס ^10. העברת המאמצת של תאי T Vα2Vβ8-TCR ספציפיים נעשתה שימוש כדי לבסס מודל דחייה בC57B עם מערכת החיסון החלשL / 6 RAG2 ^{- / -} העכברים מושתלים עם עור IA ^bm12.

הבדלים גנטיים בין תורם למקבל להשפיע על התוצאה של קבלת השתלה ודחייה. ישנם סוגים שונים של השתלות: השתלות autografts הם מן הפרט הנמען עצמו; syngrafts וallografts הם השתלות מאנשים זהים מבחינה גנטית וגנטי שאינם קשורים בהתאמה. קבלה של השתלות איברים אלוגנאית שונות הוכח על ידי התערבות כימית וביולוגית בחולים ומודלי עכבר ^11,3,4. בגישה בסיסית, עכברים שטופלו בנוגדן אנטי CD3 C57BL / 6 הראו הישרדות ממושכת של עור זנב-IA ^bm12 (נתונים שלא פורסמו). דלדול של CD4 ⁺ ו CD8 ⁺ T תאים לפני ההשתלה בעכברי נמען הביא לקבלה שלי בכיתה MHC והשני שתלי תואמים (חזון ^ב12). מעניין לציין, כי דחייה של שתלי עור תלוי בנוכחות של CD4 ⁺ תאי T (חזון ^ב12). במודל זה, מיקוד אינטראקציות ספציפיות בין תאי מערכת החיסון שונים על ידי חסימת מולקולות costimulatory עם נוגדנים או דיכוי עם תאי T רגולטוריים עלול לגרום סובלנות (נתונים שלא פורסמו). ואכן, החסימה גם CD40 CD28 והובילה לסובלנות של שתל עור לטווח ארוך ^13,14.

השתלת עור הזנב היא קלה לביצוע וקל לניטור בהשוואה להשתלה של איברים אחרים. בנוסף, השתלות עור הזנב הן קלים להכנה והם פחות רגישים לאיסכמיה מאשר רקמות עור אחרות. בניגוד להרדמה מוזרקת, השימוש בגז הרדמה (isofluorane) במהלך השתלה מקצר גם את ההליך והתאוששות נמען זמן. קרלינג של השתלת עור הזנב, דבר שעלול להוביל לריפוי פצע שלם ודחיית שתל, נמנע על ידי יישום של דבק רקמות. יתר על כן, מודל השתלת עור זנב IA ^bm12 בלעדי מפעיל CD4 ^{+ תאי T בשתי מערכת חיסון ומערכת חיסון חלש עכברים (של אותו רקע גנטי) להקל על הפרשנות של התוצאות.}

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר אמין, לשחזור ומעקב בקלות, המאפשר להתערבות כימית וביולוגית. המודל מיועד לחקירת אינדוקציה דחייה וסובלנות של השתלות עור הזנב.

פרוטוקול

בפרסום הסרטון הזה ופרוטוקול, כל ההליכים בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי בעלי החיים Cantonal הרשות באזל, שוויץ. לבצע את כל ההליכים בתנאים שבם ניתן סטרילי.

1. הכנת הניתוח

1. החיטוי כל מכשירי הניתוח וגזה לפני השימוש.
2. מחממים את הכרית החמה ולארגן את מכשירי ניתוח על השולחן (הטבלה של חומרים / שיטות).
3. פתח את תחבושות רצועת אצבע. החל וזלין על משטח הפצע עם מטלית כותנה (לוודא הגזה מכוסה לחלוטין).
4. לשקול את העכברים ולנהל שיכוך כאבים עצירות 0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף. שים לב: זה יספק שיכוך כאבים מייד לאחר השתלה.

2. הכנה של עור הזנב להשתלות

1. להרדים עכברי תורם (למשל, ^bm12 IA) לCO מחנק ₂ ו-Disinfect הזנבות עם פתרון חיטוי לפני הכריתה.
2. מקם את הזנב עם הפס השחור על לוח פלסטיק נקי ולחתוך אותו לאורך ציר אורך הקו האמצעי, מה שהופך את החתך שטחי מעורב רק את שכבת העור.
3. למשוך את העור מהזנב באמצעות מלקחיים מרתקים.
4. שים את עור הזנב בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטר מלא ב10 מיליליטר HBSS.

3. הליך כירורגי

1. הרדימי עכברי נמען (לדוגמא, C57BL / 6) על ידי שאיפה של פתרון isofluorane 3% בקופסא אינדוקציה שקופה. הערה: זה לוקח 3-5 דקות לעכבר כדי להגיע להרדמת מטוס כירורגית. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
2. העבר את העכבר על משטח החם ולהחיל isofluorane 1.5% באמצעות מסיכת פה ותחת של כל רפלקס בבעלי חיים על ידי בוהן צביטה.
3. לגלח את אתר הגב של עכברי הנמען (לדוגמא, C57BL / 6) ולהסיר שערות מזהמים באמצעות SW גזה יבשAB.
4. לחטא אתר השתלה מגולח עם פתרון מזוהם.
5. לצבוט את העור עם מלקחיים באתר המרכז / ימין של dorsum ולהשתמש במספריים מעוגלים לעשות חתך עגול של כ 1 x 0.6 סנטימטר.
6. אם דימום מתרחש, ולאחר מכן לנקות את הפצע עם מקלון צמר גפן סטרילי.
7. להעריך את גודל החתך ולחתוך השתלה של הגודל המוערך מעור הזנב באמצעות האזמל.
8. לקצץ פינות לעגל את ההשתלה.
9. טען את ההשתלה באזמל, העודף יבש של HBSS על מקלון צמר גפן סטרילי ולמקם אותו במיטת השתל של עכבר הנמען.
10. הימנע מחופף של תורם ועור מארח ולהחיל דבק רקמות באזור המגע באופן בלעדי.
11. החל טיח ללא קמטים סביב המותניים העכבר.
12. החל תחבושת לא אלסטי דבק כדי לתקן את הטיח לעכבר (3 מ"מ עבר).
13. לחתוך עם המספריים על 3 מ"מ באתר הגחון העליון של התחבושת. הערה: זה הוא להימנע TRapping שיניו של העכבר בשלב ההתאוששות.
14. הסר את ההרדמה הפה המסכה ולשמור על העכברים המושתלים על כרית החימום עד ערה.
15. לחזור עכברים מושתלים לכלובים שלהם רק כאשר התאוששו באופן מלא ולהעריך את הניידות שלהם כדי להבטיח שהתחבושת לא הדוקה מדי.
16. לעקר את כל מכשירי הניתוח עם אתנול 70% לפני שתמשיך בניתוח הבא.

4. טיפול שלאחר הניתוח

1. הוספת סירופ המכיל אקמול למי השתייה (4 מ"ג / מיליליטר) ולנהל אותו למשך 7 ימים.
2. חזור עכבר לחדר בעלי החיים ברגע שהיא התאוששה.
3. לעקוב מקרוב אחר עכברים לסימנים קליניים כוללים דיכאון או שינויים אחרים התנהגותיים (אכילה או חוסר תנועה), מראה נורמלי (חוסר הטיפוח) או תנוחה (pilo-זקפה או יציבה כפופה) בפעם התחבושת היא במקום (שבוע 1).

5. הסרת תחבושת (6-7 ימים לאחר השתלה)

1. Anesthetize עכברים על ידי שאיפה של פתרון isofluorane 3% בקופסא שקופה אינדוקציה (ראה לעיל).
2. לחתוך תחבושת וגבס עם מספריים עורק ובזהירות להסיר אותם. הערה: למנוע מתיחה של אתר ההשתלה.
3. לפקח על העכברים המושתלים לסימנים קליניים (ראה 4.3) ואת הציון לדחייה של שתלי עור (טבלת 1). הערה: מערכת ציון השתל מנצלת את מרקמי שיער השונים על עור הזנב בהשוואה לעור הגב. המראה של ההשתלה והדחייה שלה הוא מסווג ב3 כיתות. שתלי עור אלוגנאית (MHC II תואם, למשל, IA ^bm12) של C57BL / 6 עכברים עם מערכת חיסון תקין בדרך כלל נדחים בתוך 12-15 ימים לאחר השתלה (הנתונים שלו ^ו15-20).

תוצאות

בגישה ראשונה C57BL / 6 עכברים הושתלו עם allografts ^bm12 IA וsyngrafts ^ב IA. לאחר הסרת תחבושת, שתל סימנים גלויים של ריפוי פצע בלי סגירה של הקשר באזור C57BL / 6 עכברים (איור 1 א). לאחר הסרת תחבושת, דלקת בתיווך תאי CD4 ⁺ T הובילה להופעתו של אזורי נמקים (כתמים אדומים) והדחייה של allografts ^bm12 IA בעכברי C57BL / 6 בתוך 13 ימים לאחר ההשתלה (איור 1 ב-C, סמלים מלאים), בעוד syngrafts היו נסבל עד 100 ימים

דיון

השתלת עור היא שיטה בשימוש נרחבת ללימוד דחייה וסובלנות תלויה בתאי T. מאז מודל השתלת העור הוקם, כמה התאמות ושינויים כבר מיושמים. בהליך המתואר, השתלת עור זנב IA ^bm12 מתבצעת באמצעות גז הרדמה (isofluorane). השימוש בגז ההרדמה מקטין את הזמן של ביצוע והתאוששות עכברים, אשר מפחית את הלחץ על עכברים מושתלים. ההליך מעסיק דבק רקמות כדי לתקן את עור הזנב, הנוטה להתכרבל יותר מאוזן או רקמת עור גב. יתר על כן, חשוב לשטח את עור הזנב לפני חיתוך וחיתוך הקצוות כמו זה מפחית מסתלסל ומשפר את המיצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בטדין תמיסה סטנדרטית	Mundipharma
צמר גפן	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan , UPSA	בריסטול מאיירס סקוויב UPSA
רצועות אצבעות Hansaplast	Beierdorf AG	REF.76861
דבק רקמות היסטואקריל	בראון	REF.1050052
לויקוטייפ קלאסי , 2 ס"מ x 10 מ'	BSN Medical SAS	REF.02204-00
PBS, תמיסת מלח חוצצת פוספט, pH 7.4	Invitrogen	10010015	GIBCO
גזה סטרילית, 5 x 5 ס"מ, 8 שכבות	MaiMed GmbH	21010
מלקחיים בתבנית צרה	FST	11003-12
מספריים קשתית עדינה מעוגלת	FST	14095-11
מספריים קשתית עדינה	FST	14094-11
מספריים מאיו	FST	14010-15
קצה כדורי מספריים לעורקים 11.5 ס"מ	FST	14080-11
מלקחיים לרקמות	FST	11021-14
להב כירורגי מס' 20	Swann-Morton LTD	3006
ידיות להב כירורגי	Swann-Morton LTD
, 1 מ"ל	ARTSANA		חד פעמי
Temgesic, בופרנורפין	ESSEX Chemie AG		0.3 מ"ג/מ"ל
כלי תרבית רקמות 10 ס"מ, 60.1 ס"מ2	TPP
וזלין	Vifor SA
כרית חמה	סוליס		סוג 223

מפלדת פחמן מזרק