טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

סיכום

ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים של עכבר לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ביעילות נמוכה על ידי ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. המתווכים הנדירים של תגובת התכנות מחדש מבודדים FACS באמצעות תיוג עם נוגדנים כנגד יצרני פני התא Thy-1.2, Ssea-1 ו-Epcam.

תקציר

ניתן לתכנת מחדש תאים בוגרים למצב פלוריפוטנטי. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) אלה מסוגלים להוליד את כל סוגי התאים בגוף וכתוצאה מכך יש להם פוטנציאל עצום ליישומי רפואה רגנרטיבית. באופן מסורתי, תאי iPS נוצרים על ידי החדרה ויראלית של גורמי שעתוק Oct-4, Klf-4, Sox-2 ו-c-Myc (OKSM) לפיברובלסטים. עם זאת, תכנות מחדש הוא תהליך לא יעיל כאשר רק 0.1-1% מהתאים חוזרים למצב פלוריפוטנטי, מה שמקשה על חקר מנגנון התכנות מחדש. מתודולוגיה מוכחת שאפשרה לחקור את תהליך התכנות מחדש היא להפריד בין המתווכים הנדירים של התגובה לבין האוכלוסייה העקשנית בתפזורת. במקרה של פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs), אנו ואחרים הראינו בעבר שתאי תכנות מחדש עוברים סדרה מובחנת של שינויים בפרופיל הביטוי של סמני פני התא שניתן להשתמש בהם להפרדת תאים אלה. במהלך השלבים המוקדמים של ביטוי OKSM, תאים מתכנתים מחדש בהצלחה, מאבדים את סמן הזהות הפיברובלסטים Thy-1.2 ומווסתים את הסמן הקשור לפלוריפוטנטיות Ssea-1. המעבר הסופי של תת-קבוצה של תאים חיוביים Ssea-1 למצב פלוריפוטנטי מסומן על ידי ביטוי של Epcam בשלבים המאוחרים של תכנות מחדש. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת לבידוד מתווכי תכנות מחדש מתרבויות של MEFs תכנות מחדש. על מנת להגביר את יכולת השחזור הניסיונית, אנו משתמשים בזן עכבר הניתן לתכנות מחדש שתוכנן לבטא טרנסאקטיבטור שעתוק (m2rtTA) בשליטה של לוקוס Rosa26 ו-OKSM בשליטה של מקדם מגיב לדוקסיציקלין. תאים המבודדים מעכברים אלה הם איזוגניים ומבטאים OKSM באופן הומוגני עם הוספת דוקסיציקלין. אנו מתארים בפירוט את הקמת העכברים הניתנים לתכנות מחדש, גזירת MEFs, ובידוד לאחר מכן של חומרי ביניים במהלך תכנות מחדש לתאי iPS באמצעות מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS).

מבוא

תאי גזע עוברי (ES) נגזרים ממסת התאים הפנימית של עובר ^ב1 שלב הבלסטוציסט. בתנאים מתאימים תרבות הם עצמי לחדש ולהישאר pluripotent. בשנת 2006 יאמאנאקה ועמיתים הראו שתאים בוגרים ניתן לתכנות מחדש לתאים שנקרא גזע pluripotent המושרה (iPS) על ידי ביטוי בכפייה של שעתוק גורמי אוקטובר -4, KLF-4, סוקס-2, c-Myc (OKSM) ^2. תאי iPS, כמו תאי גזע עובריים, יכולים להצמיח את כל סוגי התאים בגוף, לעומת זאת, הם חופשיים מהמגבלות האתיות המקיפות את הדור של תאי גזע עובריים ^3. יתר על כן, תאי iPS לשאת את ההבטחה של רפואת רגנרטיבית אישית ולהחזיק פוטנציאל עצום עבור יישומים כמו דוגמנות מחלה ובתרופת מבחנה הקרנת ^4,5. על מנת שתכנות מחדש בטכנולוגיה כדי לממש את הפוטנציאל הזה, המנגנון הבסיסי של תכנות מחדש גרעיני צריך להיות מובן במלואו. עם זאת, מאמצים לנתח את טפיחת תכנות מחדשhway כבר הקשתה על ידי העובדה שרק מספר קטן מאוד של תאים לתכנת מחדש (0.1-1%). פיברובלסטים בהצלחה תכנות מחדש כבר דיווחו לעבור סדרה שונה של אירועים כולל mesenchymal למעבר אפיתל ^6-10 ו, בשלבים הסופיים של תכנות מחדש, פעילות ברשת pluripotency ליבת אנדוגני ^11-14. אנו ואחרים ^12,13,15-17 לאחרונה זיהינו קבוצה של סמנים על פני התא ומאפשרת להפרדת ביניים נדירים מהאוכלוסייה בתפזורת עקשן. fibroblasts עכבר תכנות מחדש העוברי (MEFs) עובר שינויים בביטוי של Thy-1.2, Ssea1 וEpCAM (בין יתר) בתהליך תכנות מחדש 2 שבועות הארוך ^15. מוקדם במהלך תכנות מחדש משנה של MEFs להסדיר את הביטוי של סמן זהות פיברובלסטים (Thy-1.2) ולאחר מכן להתחיל להביע את הסמן הקשורים pluripotency SSEA-1 ^12. בשלבים הסופיים של תאי Ssea1 החיוביים תכנות מחדש reactivאכלתי גני pluripotency אנדוגני כגון אוקטובר -4 ^10-13,15. המעבר אחרון זה מסומן על פני התא על ידי ביטוי לגילוי של EpCAM (ראה איור 1) או בשלב מאוחר יותר ¹⁵ PECAM. לאחרונה, אומאלי et al. דיווח על השימוש בCD44 וiCAM1 כחלופות או משלים לThy-1.2 וSSEA-1 לזיהוי ביניים תכנות מחדש. יש לנו בעבר FACS חילוץ ביניים תכנות מחדש מיום 0, יום 3, יום 6, תרבויות יום 9 ויום 12 תכנות מחדש, כמו גם משורות תאי iPS הוקמו על בסיס סמנים פני תא אלה ^15,18. למערכת תכנות מחדש מתואר להלן ותנאים שהראינו ברמת התא הבודד, שלמרות שהאוכלוסיות שקטות הומוגנית, יש מידה מסוימת של הטרוגניות באוכלוסיות ביניים זוהו. יש לציין כי רק קבוצת משנה של תאים בתוך אוכלוסיות אלה יוכלו להתקדם לsta הבא המתאיםGE של תהליך תכנות מחדש ולהצמיח מושבות תאי iPS ביעילות שונה, שאופיין בהרחבה בעבר ^15,19. יתר על כן, יעילות תכנות מחדש של אוכלוסיות אלה תהיה תלוי, כמו גם על התנאים מחדש ציפוי והתרבות. כדי להגדיל את שחזור ניסוי אנו משתמשים זן עכבר אפשר לתכנתו שתוכנן כדי להביע transactivator תעתיק (m2rtTA) תחת שליטה של מוקד Rosa26 וקלטת OKSM polycistronic תחת שליטה של אמרגן תגובה דוקסיציקלין ^20,21. שימוש במודל עכבר זה עוקף את תופעות לוואי בלתי רצויה של שיטות נגיפיות מסורתיות של דור iPS תא, כלומר, אוכלוסייה הטרוגנית התחלה עם תא לשונות תא במספר והמיקום של אתרי אינטגרציה של מוסיף ויראלי. שני זני עכבר מהונדסים (OKSM, m2rtTA), זמין כחיות מייסד הומוזיגוטים במעבדה ג'קסון, יש לי להיות חצו כדי להקים reprograמודל עכבר mmable (ראה איור 2). בכתב יד זה אנו מתארים בפירוט כיצד להפיק MEFs, ליצור תאי iPS, ולבודד את תשומות תכנות מחדש בשלבים שונים של תהליך הגיור על ידי FACS.

פרוטוקול

.1 מכשיר הגדרות / מגיב הכנה / Genotyping

1. הכן מדיום סלולארי iPS: מוסף 500 תקשורת מ"ל Knockout DMEM עם סרום 75 מ"ל שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 5 מ"ל, 5 מ"ל חומצות אמינו לא חיוניות, 500 β-mercaptoethanol μl, 5 x 10 גורם מעכב לוקימיה ⁵ יחידות ( LIF). אנא עיין בחומרי רשימה במוצר ובמידע רכישה לחומרים כימיים המשמשים בהקשר של כתב היד הזה.
2. הכן בינוני MEF: מוסף 500 מ"ל DMEM תקשורת עם FBS 50 מ"ל, L-גלוטמין 5 מ"ל, 5 מ"ל חומצות אמינו לא חיוניים, 5 מ"ל פירובט נתרן, 500 β-mercaptoethanol μl.
3. הכן הקפאה בינונית: ל10 מ"ל, לשלב 9 מ"ל של FBS עם 1 מ"ל של DMSO.
4. הכינו לטין מצופה מנות הוספת 3-5 מ"ל 0.1% פתרון ג'לטין החזיריים לבקבוק T75, לדגור על RT לפחות 10 דקות ולשאוב ממש לפני השימוש.
5. להכין מדיום תיוג FACS: ל10 מ"ל, לשלב 9.9 מ"ל של PBS עם 0.1 מ"ל של FBS.
6. בצעגנוטיפ PCR למוקד Rosa26 m2rtTA: בצע תגובות עם פולימראז תקי DNA על פי הוראות יצרן. השתמש שונה MgCl ₂ -concentration של 3.5 מ"מ ו3 פריימרים הבאים: oIMR8052: 5 'gcg AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: GCT GTC 5'AAA CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA gcg GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. תנאי רכיבה על אופניים: 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 35 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 65 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות); 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב12 C °. גודל מוצר צפוי: 650 נ"ב לאלל סוג בר ו340 נ"ב לאלל מוטנטי.
7. לבצע PCR גנוטיפ למוקד קולגן-StemCa / OKSM: בצע תגובות עם פולימראז תקי DNA לפי הוראות. השתמש שונה MgCl ₂ -concentration של 2.5 מ"מ ו3 פריימרים הבאים: col / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 GCAGAAGCGCGGCCGT '3 CTGG '. תנאי רכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס במשך דקות 1: 2 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 70 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות), 6 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 68 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות) ו30 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות); 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; להחזיק ב12 C °. גודל מוצר צפוי: 331 נ"ב לאלל סוג בר ו551 נ"ב לאלל מוטנטי.
8. לבצע את כל צעדי צנטריפוגה ב XG 400 במשך 3 דקות ב 4 ° C..

2 דור של Fibroblasts העכבר עוברי

1. לבצע הזדווגות בעיתוי בין בעלי חיים של זן OKSM עם בן המין הנגדי של מתח m2rtTA. עוברי קציר ביום עוברי 13.5 ע"י דילול האמא והסרת קרן הרחם. לפני הסרת קרן הרחם, לרסס את אזור הבטן עם פתרון אתנול 80%, כדי למנוע זיהום חיידקים.
2. העבר את קרן הרחם לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר המכילה 10 מ"ל של פוספט סטרילי שנאגרו מלוח (PBS). השתמש במספרי כיתה כירורגית מעוקרים לחתוך את קרן הרחם לחתיכות המכילות עובר אחד (ראה איור 3 א ', ב').
3. השתמש במיקרוסקופ דיסקציה (באופן אידיאלי ממוקם בתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה) ומלקחיים מעוקרים כדי להסיר את מעטפת הרחם וקרומי חוץ עוברי המקיפים את כל עובר בזהירות. העבר את כל עובר לצלחת נפרדת 10 סנטימטר עם 10 מ"ל של PBS.
4. המשך על ידי הסרת ראשו של העובר, גפיים, זנב ואיברים פנימיים (לב, כבד, וכו 'מעי) עם המלקחיים (ראה איור 3 ג). העבר את ראשו של העובר לתוך צינור 1.5 מ"ל ולהקפיא את כך שהוא יכול לשמש לגנוטיפ במידת צורך.
5. העבר את פלג הגוף העליון של העובר לתוך צלחת 10cm ריקה ולהשתמש בשני להבים כירורגית כדי לרכך את העובר למשך 2 דקות. הוסף 200 μl של פתרון טריפסין / EDTA על גבי העובר הטחון ודגירה של 3-5 דקות ב RT. המשך מיותר עבור 2 דקות נוספות, להוסיף 2 מ"ל של תקשורת MEF ב להפעיל טריפסין, ולאחר מכן להעביר לתוך צינור 15 מ"ל.
6. השתמש בפיפטה 1,000 μl ללנתק את הרקמה על ידי pipetting העדין נוסף באופן מכאני. מעבירים לצלחת 10 סנטימטר מצופה ג'לטין ולהוסיף נוסף 10 מ"ל של תקשורת MEF. הערה: שני חממות normoxic וחוסר חמצן יכולות לשמש לתרבות, מתייחס לדיון לקבלת מידע נוסף.
7. לאחר 24-48 שעה הצלחת צריכה להיות מכוסה בצפיפות עם MEFs.
8. לחלופין, אז יכולים להיות מופצים תאים נוספים או קפוא במורד. להקפאת תאים, להסיר את התקשורת והתרבות, לשטוף את הצלחת עם 10 מ"ל PBS כדי להסיר עקבות של תקשורת וכיסוי עם 3 מ"ל פתרון / EDTA טריפסין. דגירה של 3-5 דק 'על 37 מעלות צלזיוס, להשבית עיכול טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של תקשורת והעברת MEF לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. ספין למטה וresuspend גלולה ב 3 מ"ל הקפאת תקשורת. העברה ל3 cryovials ולהקפיא אותו במכל הקפאת תא.

.3 תכנות מחדש של MEFs

ove_content "> הערה: תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשתמש בחממות תרבית רקמת normoxic לתכנות מחדש זה יכול להיות מועיל כדי להפיק ולהרחיב MEFs בתנאי חוסר חמצן (חמצן 5%, ראה דיון לקבלת מידע נוסף. ).

1. במהירות להפשיר cryovial נמוך מעבר (P0-P1, 2-3 תאי Mio) באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ולהעביר את התוכן לתוך צינור עם 10 מ"ל של תקשורת MEF המחוממת מראש. תאים גלולה, גלולים בתקשורת MEF 12 מ"ל טרי, להעביר לכלי תרבות T75 ג'לטין המצופה, ולאפשר לתאים להתאושש במשך 24-48 שעה לפני שימשיך. הערה: יכול לשמש גם MEFs ישירות לאחר גזירה.
2. בעקבות ההסרה של תקשורת בתרבות, לשטוף MEFs עם PBS וcellularize ידי כיסה עם פתרון טריפסין / EDTA (3 מ"ל ל3-5 דקות ב 37 ° C). להרוות טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של תקשורת MEF ולנתק עוד תאים על ידי ערבוב עדין עם טפטפת 10 מ"ל. לקבוע מספרים סלולריים באמצעות hemocytometer.
3. לreprograניסויי mming, MEFs זרע על צלוחיות T75 ג'לטין מצופים בצפיפויות של 6.7 x 10 ³ תאים / ² סנטימטר (~ 0.5 Mio תאים לכל בקבוק) בתקשורת iPSC המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין. עיין בטבלת 1 המלצות זריעה בנוגע להשגה סביב 2 ביניים תכנות מחדש Mio לכל נקודת זמן. הערה: תכנות מחדש מתחיל עם התוספת של דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם / מ"ל) בתוספת תקשורת
4. לראשון 6 הימים להחליף תקשורת בכל יום אחר עם דוקסיציקלין הטרי בתוספת תקשורת iPSC (12 מ"ל של תקשורת לכל בקבוק T75). מעבר לנקודה זו לחדש תקשורת על בסיס יומי אם יש מספרים סלולריים גבוהים. להכפיל את נפח התרבות אם ניתן לבצע שינויים בתקשורת רק בכל יום חלופי.
5. ביניים תכנות מחדש קציר בנקודות הזמן הנדרש (הצעה: ימים 3, 6, 9, 12) על ידי הסרת תקשורת, שטיפה עם נפח מתאים של PBS (10 מ"ל לבקבוק T75) וכיסה עם פתרון טריפסין-EDTA (3 מ"ל ל בקבוק T75). דגירהל3-5 דק 'על 37 מעלות צלזיוס ולהרוות ידי הוספת 5 מ"ל של תקשורת iPSC אחרי pipetting העדין.
6. רוזן השעיה תא עם hemocytometer (ראה לעיל), גלולה על ידי צנטריפוגה, לשאוב את תאי supernatant וגלולים ב10 מ"ל של PBS כדי להסיר כל עקבות של טריפסין. גלולה תאים שוב, supernatant לשאוב ולהמשיך בשלב 4.1 לבודד ביניים תכנות מחדש. הערה: תאים עוברים תכנות מחדש יכולים להיות cryopreserved ומופשר לבידוד FACS בשלב מאוחר יותר.
7. להקים תרבויות iPS לתכנות מחדש באופן מלא, לגדל תאים בתקשורת iPSC ללא DOX לעוד 4-7 ימים. הערה: תרבויות בהצלחה תכנות מחדש יכילו מספר רב של מושבות ביום 12 (ראה איור 4). במהלך תקופה זו, תאי iPS חריגים שעדיין דורשים ביטוי OKSM ייעלמו.
8. לחלופין, כדי להפיץ תרבויות iPS לתכנות מחדש באופן מלא שנותרו: תחילה, זרע MEFs המוקרן בצפיפות של 15 x 10 ³ תא / ² סנטימטר ב12 מ"ל של תקשורת iPSC על ג'לטין המצופה T75 בקבוקון יום אחד או 6 שעות לפני ניסויים.
9. בשלב הבא, בתרביות תאי iPS cellularize על ידי הסרת תקשורת, שטיפת בקבוק T75 עם 10 מ"ל של PBS, שכיסה עם 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA ודוגר במשך 3-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. להרוות טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של תקשורת iPSC אחרי ערבוב עדין, להעביר לצינור חרוטי 15 מ"ל, ספין למטה ולאחר מכן resuspended ב10 מ"ל תקשורת iPS.
10. העבר את 500 μl של השעיה תא זה על MEFs המוקרן (בקבוק T75) ולאפשר לתרבויות לגדול במשך 4-5 ימים. הערה: תרבויות iPS הוקם יכולות להיות cryopreserved או המשמש לניסויים. ניתן לגזור שורות תאים משובטים ידי הרמת מושבות iPSC בודדות תחת מיקרוסקופ לנתח ^22.
11. קריו לשמר את תרבות iPSC מחוברות כמתואר ב2.8 לMEFs.

.4 נוגדן תיוג

1. כדורי תא הגלול של תרבויות תכנות מחדש, כפי שהוכן בסעיף 3, בתקשורת FACS תיוג בתוספת נוגדנים (אנטי Thy-1.2 פסיפיק כחולים 1: 400, ביוטין אנטי SSEA-1 1: 400 ואנטי EpCAM FITC 1: 400). השתמש 200 μl של תערובת תיוג בתוספת לכל 5 מיליון תאים ולדגור על קרח.
2. לאחר 10 דקות לטפוח בעדינות את הצינור לresuspend תאי דגירה נוספת 10 דקות על קרח. הוסף 10 מ"ל של PBS הקר לכל צינור וספין למטה.
3. לכל צינור להיות מוכתם להכין 200 μl של תקשורת תיוג בתוספת μl 1 streptavidin-PeCy7 (1: 200) לכל 5 מיליון תאים. כאשר תאי pelleted, לשאוב בזהירות את supernatant וגלול בנפח מתאים של תקשורת תיוג בתוספת streptavidin-PeCy7.
4. שמור את התאים על קרח עבור 10 דקות, ברז לresuspend, דגירה עוד 10 דקות על קרח, להוסיף 10 מ"ל של PBS הקר לכל צינור, ספין למטה וsupernatant לשאוב.
5. כדורי תא גלול בתקשורת תיוג בתוספת יודיד propidium (PI) (2 מיקרוגרם / מ"ל) בכ 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל. להסיר גושי תא על ידי העברת ההשעיה דרך מסננת 70 מיקרומטר. העבר את התאים לצינור FACS מתאים ולשמור אותם על קרח.
6. הכן דגימות נפרדות עם נוגדני אדם (אנטי Thy-1.2, אנטי SSEA-1 ואנטי EpCAM). הערה: אלה נדרשים לבצע פיצויי צבע בשלושה ערוצים המשמשים בניתוח. בנוסף, יש צורך בתאים ללא תווית להגדיר מתחים ושערים למיון. באופן אידיאלי תאי iPS משמשים לפיצוי: מניות של 0.5-1 x 10 ⁶ תאים iPS שמרו על MEFs המוקרן מאוחסנות בcryovials בחנקן נוזלי. הנוכחות של MEFs היא חיונית כדי לקבל אות בערוץ Thy-1.2.
7. להפשיר cryovial של תאי iPS כפי שתואר עבור MEFs (סעיף 3). בעקבות צנטריפוגה, תאים גלולים ב800 μl של חיץ תיוג ו200 μl של מדגם זה הוא להפריש כשליטה ללא תווית.
8. השתמש בתאים שנותרו כפקדי פיצוי. תאים מתחלקים בין שלושה 15 צינורות מ"ל ונוגדנים להוסיףכדלקמן: שליטת פיצוי הכחולה האוקיינוס ​​השקט: להוסיף 0.5 μl של נוגדן פסיפיק בלו-Thy-1.2 אנטי. צינור פיצוי FITC: להוסיף 0.5 μl של הנוגדן אנטי EpCAM-FITC. שליטת Pe-Cy7 פיצוי: 0.5 μl של נוגדן SSEA-1 ביוטין אנטי.
9. שמור דגימות תאי נוגדנים על קרח עבור 10 דקות, לערבב על ידי הקשה והדגירה של 10 דקות על קרח.
10. לשטוף דגימות עם PBS הקר 10 מ"ל כדי להסיר נוגדן מאוגד, ספין תאים למטה ולשאוב supernatant. כדורי תא גלולים ב200 μl של תקשורת תיוג FACS.
11. עבור אנטי SSEA-1 ביוטין דגימות שכותרתו, להוסיף המצומד streptavidin-PeCy7 (μl 1 ל200 תאי μl). תאי תווית כפי שתוארו לנוגדן ראשוני (SSEA-1-ביוטין).
12. להעביר את כל הדגימות כוללים השליטה ללא תווית דרך מסננת 70 מיקרומטר ולהוסיף PI (2 מיקרוגרם / מ"ל). העבר את התאים לצינורות FACS ולשמור על קרח עד לרגע שימוש.

.5 בידוד FACS של התשומות לייצור

הערה:תאים מסודרים באמצעות סדרן תא קרינה המופעל עם 405 ננומטר, 488 ננומטר ו560 לייזרי עירור ננומטר וזרבובית 100 מיקרומטר.

1. מתחים שהוקמו לפיזור קדימה וצד כך שאוכלוסיית התא דמיין כראוי. לצייר שער סביב תאים כפי שמצוין באיור 5A להוציא פסולת. הערה: להגדיר הנכון של מתח על סדרן התא יכול להיות מורכב ודורש מפעיל FACS מנוסה.
2. גובה השתמש בפיזור קדימה (FSC) לעומת אזור FSC להוציא אגרגטים (איור 5).
3. דמיין את ערוץ PI לעומת FSC לשער בתאי חיים השליליים PI (איור 5 ג).
4. השתמש בתאים ללא תווית כדי להתאים את המתח לערוצי הניאון של PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. באופן אידיאלי למקם את אוכלוסיית התאים בקצה התחתון של הערוץ המתאים.
5. קבע שערים עם תאי שליטה ללא תווית, כפי שמוצג באיור 6 א ', ב' לתת שבריר פולחן תכנות מחדשures ליום 3, 6 ו -9 אוכלוסיות: SSEA-1 / Thy-1.2 + תאים; SSEA-1 / Thy-1.2- תאים; ותכנות מחדש ביניים SSEA-1 + / Thy-1.2- תאים.
6. יתר על כן לחלק את יום 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- שבריר באמצעות Pe-Cy7 לעומת FITC כתם; לצייר שערים סביב SSE-A1 + / EpCAM + התאים וSSEA-1 + / תאי Epcam-. קבע שערים עם תאי שליטה ללא תווית, כפי שמוצג באיור 6 ג, ד.
7. מלא מראש צינורות איסוף מתאימים עם תקשורת תא iPS (1-2 מ"ל) לפני מיון האוכלוסיות הרצויות (ראה איור 7 עבור פרופילי נציג FACS לMEFs, יום 3 / יום 6 / יום 9 / יום 12 תרבויות ותאי iPS).
8. בצע FACS מיון לפי מייצר פרוטוקול.
9. לאחר בידוד FACS להגיש תאים לפרופיל מולקולרי (RNA / הפקת חלבון, immunoprecipitation הכרומטין, וכו 'ניתוח methylome DNA). לחלופין, ברי תאים השונים עשויים להיות מתורבתים.

תוצאות

לאחר הנתיחה, disaggregation והציפוי של עובר עכבר E13.5, צלחת 10 סנטימטר צפוי להגיע confluency בכ 1 עד 2 ימים. בשלב זה, זה נורמלי לתרבות להכיל כמה חתיכות חסיד של רקמה שלא היה cellularized כראוי. אלה ייעלמו לאחר passaging.

על האינדוקציה דוקסיציקלין, MEFs תכנות מחדש עובר שינויים מורפולוגיים ברורים. סביב יום 6, טלאים כמו מושבה מוקדם צריכים להתחיל לצאת (איור 4C). אלה ימשיכו לגדול בגודל על תרבות נוספת (ראה איור 4D, E). ניסוי תכנות מחדש טוב צריך לגרום ל> 500 מושבות בכל T75 שבתחילה היה זרע עם 5 x 10 ⁵ תאים (איור 4E). תרבויות iPS הוקמו ברשות מושבות כיפה אופיינית בצורה וצריכה בעיקר להיות נטול תאים מובחנים (איור 4F). מדי פעם, passaging נוסף של cultu iPSמיל ייתכן שיידרש כדי להסיר את תאים שלא עברו התמיינות / תכנות מחדש באופן חלקי; בקבוק ומחוברות של תאים ניתן לפצל ביחס של 1:10 על שכבת מזין של MEFs המוקרן.

כפי שצוין לעיל, שינויים מורפולוגיים ומולקולריים במהלך תכנות מחדש באים לידי ביטוי בשינויים בפרופילי FACS לThy-1.2, SSEA-1 וסופו של הדבר EpCAM (ראה איור 7 א-F). כפי שדווח בעבר ^12,15, בעוד MEFs הם בעיקר חיובי לThy-1.2 ושלילי לסמנים האחרים, 3 תרבויות היום כבר נראו שונות במידה ניכרת. חלק גדול מתאים החלו למטה להסדיר את הביטוי של Thy-1.2 וקבוצה קטנה מאוד של Thy-1.2 תאים השליליים אלה הפכו חיוביים לSSEA-1, תכנות מחדש בפועל ביניים לנקודה זו בזמן. מספר ביניים תכנות מחדש שניתן לחלץ מיום 3 תרבויות הוא מאוד בלתי צפוי כמו אחוז SSEA-1 + / Thy-1.2- בדרך כלל נמצא בטווח שבין 1-10% מviablתאי דואר. בימים 6 ו -9 אחוז מוגבר של תאי SSEA-1 +, בדרך כלל הרבה מעל 10%, ניתן לאתר. סביב יום 12 משנה של SSEA-1 תאים חיוביים ניתן לאתרם שגם תווית חיובית לEpCAM. תרבויות יום 12, כמו 3 תרבויות היום, מייצגת צוואר בקבוק בתהליך של טיהור ביניים, כאחוז מSSEA-1.2 + / EpCAM + התאים משתנה ובדרך כלל נופל בטווח של רק 2-4% מכל תאי החיים. המספר הצפוי של תשומות תכנות מחדש מוצגות בלוח 1 משמש רק כהערכה גסה. תרבויות שהוקמו בתום לב iPS תא תהיה חיוביות מאוד לSSEA-1 וEpCAM.

איור 1 משטח סמן שינויים במהלך מסלול תכנות מחדש: Down-תקנה של סמן זהות פיברובלסטים Thy-1.2 אחריו תקנה עד שלSSEA-1. המעבר של קבוצת משנה של SSEA-1 תאים חיוביים כלפי מדינת pluripotent מצויינים על ידי רכישה של EpCAM סביב יום 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 ייצוג סכמטי של מודל העכבר אפשר לתכנתו:. ביטוי m2rtTA נמצא תחת שליטה של מוקד Rosa26 כל מקום בגוף הפעיל בנוכחות של דוקסיציקלין (DOX) חלבון m2rtTA נקשר לאמרגן תלוי טטרציקלין (tetOP) בשעה קולגן 1A1 (Col1a1) מוקד וכתוצאה מכך הביטוי של קלטת ארבעת גורם. שתי קלטות bicistronic מקושרות על ידי אתר הריבוזום פנימי כניסה (IRES). מסגרות קריאה פתוחות לאוקטובר -4 / KLF-4 וסוקסו-2 / c-Myc הן פו sed על ידי רצפי F2A וE2A ביקוע עצמיים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נתיחת .3 העובר איור: קרן רחם העברה () לתוך צלחת 10 סנטימטר מלא ב10 מ"ל PBS ו (ב) לחתוך לחתיכות המכילות עובר אחד. (C) בעזרת מלקחיים לשחרר את העוברים מהרקמה עוברית נוספת ולהסיר את הראש, גפיים, זנב ואיברים פנימיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

les / ftp_upload / 51728 / "width =" 51728fig4highres.jpg 500 "/>
התיקונים כמו מושבה איור 4 שינויים מורפולוגיים במהלך תכנות מחדש. יתבררו בתרבויות מיום 6 ואילך. iPSCs תום הלב מתאפיין במורפולוגיה בצורה כיפה. יום 0 / MEFs, יום (ב ') 3, יום 6 (ג), יום 9 (ד'), יום (E) 12, (F) () iPS תרבית תאים. סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 התקנה בסיסית FACS. () תכלול פסולת עם צד פיזור לעומת שטח פיזור קדימה כתם. (ב)תכלול אגרגטים מהלא פסולת על ידי gating על אוכלוסיית תא בודדת עם פינת פיזור קדימה לעומת כתם גבוה קדימה פיזור. (ג) תכלול תאים מתים מאוכלוסיית תא בודדת על ידי gating על אירועים נמוכים PI עם ערוץ PI לעומת שטח פיזור קדימה כתם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 gating. (A, B) שימוש בתאי השליטה ללא התווית להגדיר שערים לThy-1.2 + / SSEA-1 תאים, Thy-1.2- / SSEA-1 תאים וThy-1.2- / SSEA-1 + תאים. (ג) השתמש בתאי השליטה ללא התווית להגדיר שערים לתאים שליליים חיוביים וEpCAM EpCAM. (ד) ניתן להפריד + / Thy-1.2- תאים SSEA-1לEpCAM חיובי ולאוכלוסייה שלילית EpCAM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7 Thy-1.2 לעומת SSEA-1 כתמי FACS בשלבים שונים של תהליך תכנות מחדש. יום (א ') 0 / MEFs, יום 3, יום 6, יום 9, (E) יום (ב) (ג) (ד) 12, תרבית תאים (F) iPS.

טבלה 1 מוצע צפיפות זריעה, מספר בקבוק ותוצאה הצפויה לP1 MEFs של הטרוזיגוטיים עובר לOKSM וm2rtTA. אנא לחץ על here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יום	מספר צלוחיות T75 זורעים על יום 0	מספר כולל של תאי Ssea1 + לאחר FACS	מספר כולל של Ssea1 + / EpCAM + תאים לאחר FACS
3	8	2 מ'
6	4	2 מ'
9	4	2 מ'
12	10	10 מ'	2 מ'

דיון

על מנת לתכנת מחדש בהצלחה MEFs לתאי iPS ולטהר ביניים תכנות מחדש בכמות גבוהה זה הכרחי להיות מודע לגורמים שיש להם השפעה על היעילות הכוללת. בפרט אצווה של FBS משמש כדי להשלים את תקשורת iPS יכול להיות השפעה מזיקה. בחוויות חיוביות כלליות נעשו עם הגזע עוברי FBS המוסמך תא (ES), אך בדיקת אצווה של סרה ממגוון רחב של ספקים עלולים לזהות חלופה זולה יותר.

גורם נוסף שמשפיע על יעילות תכנות מחדש הוא גנוטיפ של MEFs ^15,20. למרות MEFs נגזר מהטרוזיגוטיים עכברים (ח) לשני OKSM ומוקד m2rtTA אל לתכנת מחדש, homozygousity באחת או בשני תוצאות הלוקוסים ביעילות תכנות מחדש גבוהה יותר. ואכן, MEFs נגזר מהצאצאים של צלבי OKSM וm2rtTA להראות עלייה ביעילות תכנות מחדש לפי הסדר הבא (OKSM / m2rtTA): ח / ח <הומו / ח <ח / הומו <הומו /הומו (שים לב שהמספרים הניתנים בטבלה 1 הם לבעלי החיים ח / ח). בהזדמנות נדירה של בעלי חיים הומו / הומו גברי מזוהה, הרמון הזדווגות עם נקבות m2rtTA מרובות ניתן להגדיר. כל הצאצאים מצלבים אלה "מדוכאת" / הומו לOKSM / לוקוסי m2rtTA, בהתאמה. בנוסף, גנוטיפ המהיר של המלטות מומלץ כהמלטות גדולות יותר מתקבלות כאשר משתמשים בעכברים צעירים לרבייה (6-15 שבועות של גיל).

יתר על כן, השימוש בMEFs מעבר הנמוך לתכנות מחדש יודגש ^23. אם MEFs נגזרו והרחיב בתרבית רקמת חממת normoxic אנו ממליצים בחום להשתמש רק תאים אלה עד למעבר .2 עם זאת, אם יש לו את הניסוי גישה לחממת חמצן נמוך (חמצן 5%) לגזירה והרחבת MEFs, מספרי מעבר גבוהים ככל 3 עדיין להניב תוצאות טובות ^23.

במקרה הנסיין נתקל בבעיות הקשורות לתכנות מחדש, כפי שתואר, סביר להניח שההסברים הם מספרי מעבר גבוהים בזמן בנוסף DOX, גנוטיפ לא נכון של העכברים או השימוש בFBS שהוא לא תורם ליצירת תאי iPS. עם זאת, במקרים נדירים אנחנו ציינו כי MEFs לא הצליחו לתכנת מחדש גם בתנאים אידיאליים. במקרים אלה מחיקה ספונטנית דה נובו בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה של m2rtTA זוהתה כסיבה הבסיסית.

מתודולוגיה זו הותאמה בהצלחה לחלץ SSEA-1 + ביניים באמצעות בידוד מגנטי תא (MACS). יש יתרון ברור בזמן באמצעות MACS, לעומת זאת, טוהר SSEA-1 + "אוכלוסיות תאים מצטמצם 80-90%, ולא יותר מ 95%, אשר תלוי בסוג של ניסוי בתאים מיועדים לעלולים להוות בעיה. לפיכך, אפשרות היא להשתמש MACS להעשיר לSSEA-1 + תאים ואחריו FACS להגדיל טוהר ו / או החלק ל+ / תאי Epcam- SSEA-1 + / EpCAM + וSSEA-1.

"> בעוד תאי iPS המיוצרים על ידי הפרוטוקול שתואר ומודל עכבר הוכחו להיות pluripotent וביעילות לתרום לכל הרקמות של בעלי החיים chimeric ^15,20, קיבולת מופחתת כדי לייצר עוברים לחלוטין מורכבים מתאי iPS אלה באמצעות שלמת tetraploid כבר הפגין ^24. דפוסי מתילציה Aberrant באשכול גני DLK-Dio3 זוהו כגורם הבסיסי ^24. עם זאת, תוספת של חומצה אסקורבית בריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל לתקשורת במהלך תכנות מחדש תהיה לייצר תאי iPS המוסמך שלמת tetraploid ^24. לידיעתך מודל עכבר אפשר לתכנת חלופי שהונדס גורמי תכנות מחדש בstoichiometry שונה יכול לייצר תאי iPS המוסמך tetraploid גם בהעדרו של טיפול בחומצה אסקורבית ^25. עם זאת, בתאים את ידינו מלתכנת מחדש את המתח הזה באופן משמעותי תדירות נמוכה יותר בהשוואה למצב עכבר במסמך זה משמשl.

המתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה מאפשרת הפרדת ביניים תכנות מחדש מהכמויות הגדולות עקשן של האוכלוסייה ויש לראותו ככלי רב ערך כדי לנתח ולהבין את תהליך תכנות מחדש, הסרת המגבלות הקודמות של צורך להשתמש באוכלוסיית unfractioned לפרופיל (לדוגמא, רעש גבוה אות מהתאים עקשן). שילוב הנוגדן המתואר כאן מאפשר בידוד של חומרי ביניים מתאי עכבר בטוהר גבוה, אולם יתכן כי סמנים פני תא נוספים להיחשף בעתיד שיאפשר להשיג ביניים בטוהר גבוה אף יותר. שים לב שהביטוי SSEA-1 הוא לא סימן היכר של תאי גזע pluripotent האנושיים מושרה וכפרוטוקול כזה זה לא יכול להיות בשימוש על תכנות מחדש של תאים ממקור אנושי. לסיכום, ביניים תכנות מחדש מבודדים פעם אחת עם השיטה המתוארת יכולים לשמש לניתוחים מולקולריים כוללים profilin ביטויg, immunoprecipitation הכרומטין, methylome ניתוח, וחלבון מבחני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CD90.2 נגד עכבר (Thy1.2) פסיפיק בלו	eBioscience	48-0902-82
ביוטין SSEA-1 אנטי-אנושי/עכבר	eBioscience	13-8813
סטרפטווידין PE-Cy 7	eBioscience	25-4317-82
נגד עכבר CD326 (Epcam) Fitc	eBioscience	48-5791-82
נתרן פירובט	טכנולוגיות חיים	ברקוד 11360-070
MEM חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	טכנולוגיות חיים	11140-050
סרום בקר עוברי מוסמך לתאי גזע עובריים (FBS)	טכנולוגיות חיים
טריפסין-EDTA (0.25%)	טכנולוגיות חיים	ברקוד 25200-056
גלוטה-מקס	טכנולוגיות חיים	35050-070
&בטא;-מרקפטואתנול	טכנולוגיות חיים	21985-023
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	סיגמא-אולדריץ'	D8418
פניצילין/סטרפטומיצין	טכנולוגיות חיים	15140
תמיסת פרופידיום יודיד (PI)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4864-10 מ"ל
ג'לטין מעור חזיר	סיגמא-אולדריץ'	G1890
דוקסיציקלין היקלט	סיגמא-אולדריץ'	ברקוד 33429-100MG-R
גורם מעכב לוקמיה (LIF)	מיליפור	ESG1107
DMEM גלוקוז גבוה	טכנולוגיות חיים	11960-044
DPBS (מי מלח מאגר פוספט של Dulbecco)	טכנולוגיות חיים	14190-144
נוקאאוט DMEM	טכנולוגיות חיים	10829-018
MEFs מוקרנים	טכנולוגיות חיים	S1520-100
75-cm2 צלוחיות תרבית רקמות	קורנינג/BD ביוסיינס
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל	קורנינג/BD ביוסיינס
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל	קורנינג/BD ביוסיינס
להבים כירורגיים חד פעמיים	Clifford Hallam	SM0501
בקבוקונים קריוגניים	קורנינג/BD ביוסיינס
70 ומיקרו; m מסננת תאים	BD ביוסיינס	352340
טאק DNA פולימראז	טכנולוגיות חיים	ברקוד 10342-020